PLoS ONE: Divergent Androgen receptor og Beta-Catenin Signaling i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

På trods af årtiers indsats for at udvikle en effektiv terapi og identificere lovende nye lægemidler, prostatakræft er dødelig, når det udvikler sig til kastrationsresistent sygdom. Undersøgelser viser mis-regulering af flere veje i kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), hvilket afspejler heterogeniteten af ​​tumorerne, og også antyde, at målrette androgen receptor (AR) vej alene måske ikke er tilstrækkelig til at behandle CRPC. I denne undersøgelse præsenterer vi beviser for, at Wnt /β-catenin pathway kan blive aktiveret i prostatacancerceller efter androgen-berøvelse at fremme androgen-uafhængig vækst, dels gennem øget samspil af β-catenin med TCF4. Androgen-uafhængige prostatacancerceller var mere tilbøjelige til at aktivere et Wnt-reporter, og inhibering af Wnt /β-catenin pathway forøget følsomhed af disse celler til anden generation af antiandrogen, enzalutamide. Kombineret behandling af enzalutamide og Wnt /β-catenin inhibitor viste øget vækst undertrykkelse i både androgen-afhængige og -uafhængige prostatacancerceller, hvilket tyder terapeutisk potentiale for denne tilgang

Henvisning:. Lee E, Ha S, Logan SK (2015) divergerende Androgen receptor og Beta-Catenin Signaling i prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (10): e0141589. doi: 10,1371 /journal.pone.0141589

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: 4. august, 2015; Accepteret: 9 okt 2015; Udgivet: 28 Oktober 2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health R01CA112226 (SL) og American Cancer Society RSG-11-108-01-CDD (SL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser : AR, androgen receptor; APC, adenomatøs polypose coli; CRPC, kastrationsresistent prostatacancer; DHT, dihydrotestosteron; GSK3, glycogensyntasekinase 3; iCRT3, inhibitor af catenin reagerende transkription 3; PI3K, phosphatidylinostitol-3-kinase; PTEN, phosphatase og tensin homolog; TCF4, transskription faktor 4; UBE2C, Ubiquitin-konjugerende enzym E2C

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige form for kræft hos mænd [1]. I betragtning af den centrale rolle, androgen receptor (AR) signalering i sygdomsprogression, at den nuværende konventionelle tilgang behandling af prostatacancer er androgen deprivation terapi ofte kombineret med antiandrogen-behandling. Trods det oprindelige tumor regression, aggressiv sygdom udvikler sig til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC), for hvilken behandling der er den største udfordring i marken. Nye lægemidler målrettet mod AR pathway såsom anden generation antiandrogen, enzalutamide [2] og abiraterone som blokerer intratumoral produktion af androgen [3] er blevet godkendt af FDA til behandling af CRPC. Trods løftet om disse og andre lægemidler, de forlænge livet med kun 6-8 måneder [4, 5], hvilket indikerer behovet for en ny tilgang til behandling af fremskreden sygdom.

På grund af de komplekse signalering netværk i avanceret sygdom, kan hæmning af én pathway forårsage uforudsigelige reaktioner [6, 7]. I denne forbindelse er det blevet foreslået, at prostatatumorer også kan aktivere alternative signalveje for at kompensere for konsekvenserne af AR inhibering [8, 9]. Interaktion mellem PI3K og AR veje er blevet godt undersøgt og faktisk er rapporteret gensidig feedback mellem de to veje i PTEN-deleteret prostatacancer, hvilket indikerer vigtigheden af ​​at målrette begge veje i PTEN-deleteret sygdom [10]. For nylig blev opregulering af glucocorticoidreceptor (GR) rapporteret i enzalutamide-resistente tumorer [11], og vist at være nødvendig for den resistente fænotype. Derfor kan terapeutiske fremgangsmåder, der samtidigt er målrettet flere veje være mere effektive til behandling CRPC [6].

Nylige genom sekventering data har vist fejlagtig regulering af Wnt-vejen i prostatacancer med sygdomsprogression. Den sammenlignende analyse af to separate hel-exome sekventering datasæt, en fra primære tumorer [12] og den anden fra dødelige kastrationsresistent metastatiske tumorer [13], viste, at APC (adenomatøs polypose coli) genet ofte blev muteret i primær tumorer, men mere markant muteret i fremskreden sygdom [14]. Faktisk senere data viser, at den Wnt-pathway er en af ​​de mest markant muterede veje i CRPC [13]. I overensstemmelse hermed WNT16B sekretion i tumormikromiljøet fremmet behandling-resistens i prostatacancer gennem aktivering af Wnt /β-catenin pathway [15]. For nylig blev det rapporteret, at 18% af tilfældene af metastatisk kastrationsniveau resistent prostatacancer udstillet ændringer i Wnt vej signalering [16]. Disse rapporter tyder på, at Wnt /β-catenin pathway kan være en af ​​de kompenserende pathways aktiveres i prostatacancer som reaktion på androgen deprivation terapi. Støtte denne idé, ekspressionen af ​​en aktiverende mutation af β-catenin i muse prostata aktiveret kontinuerlig prostata vækst efter kastration [17].

Vores gruppe tidligere offentliggjorte proof of concept undersøgelser, der viser, at et lille molekyle hæmmer af Wnt /β-catenin vej, iCRT3 (forkortet til C3) kan nedsætte AR mRNA-ekspression og transskription af downstream målgener ved at interferere med β-catenin /TCF interaktion på AR promotor. Vi viste også, at C3 kan interferere med AR og β-catenin-protein interaktion. De senere protein interaktionsforsøg blev udført i tilstedeværelse af høje niveauer af androgen at stabilisere AR protein niveauer, så de ikke blev nedsat i tilstedeværelse af β-catenin-hæmmer [18].

Arbejdet er beskrevet i dette manuskript shows at aktiviteten af ​​Wnt /β-catenin pathway er lav i prostatacancerceller sandsynligt skyldes præferencen for β-catenin interaktion med AR i stedet TCF4 i disse celler. Vi observerer, at undertrykkelse af AR aktivitet ved androgen-berøvelse, antiandrogen behandling eller AR knockdown forfremmet Wnt /β-catenin-target genekspression og dette korreleret med øget samspil mellem TCF4 og β-catenin. Den forøgede aktivering af Wnt /β-catenin pathway forårsagede væksten af ​​androgenafhængige LNCaP-celler i fraværet af androgen eller i nærvær af antiandrogen. Aktivering af Wnt /β-catenin pathway blev også undersøgt i en androgen-uafhængig sublinie af LNCaP-celler, LNCaP-abl (abl). ABL-celler blev dannet ved kontinuerlig passage i androgen forarmet medier og udvalgt for deres evne til at proliferere i androgen berøvet tilstand [19]. ABL-celler var mere tilbøjelige til Wnt /β-catenin aktivering end LNCaP-celler, og inhibering af β-catenin-aktivitet ved et lille molekyle inhibitor eller siRNA forøget enzalutamide følsomhed i ABL-celler. Desuden udviste kombineret behandling af enzalutamide og en Wnt /β-catenin hæmmer øget væksthæmning i både LNCaP- og ABL celler, hvilket indikerer det terapeutiske potentiale af denne tilgang.

Materialer og metoder

Cell kultur

LNCaP (ATCC, CRL-1740) og LNCaP-abl (abl) [19] (gave fra Z. Culig) celler blev dyrket i RPMI 1640 (Cellgro) suppleret med 10% FBS (Hyclone), og 10% trækul strippet FBS (CFBS; serum udtømt for steroider herunder androgener) og henholdsvis og 1% penicillin-streptomycin (Cellgro). 22Rv1 (ATCC, CRL-2505) og HEK293 (ATCC, CRL-1573) celler blev dyrket i DMEM (Cellgro) suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. De følgende forbindelser blev anvendt til behandling af celler: C3 (ChemDiv, C523-1410), enzalutamide (Selleck Chemicals) og GSK-3 inhibitor (CHIR99021; Stemgent). For celleproliferation, QRT-PCR, immunoblot, immunpræcipitation og chip assays, LNCaP-celler blev hormon frataget i 5% CFBS medier i 2-3 dage og derefter behandlet med androgen med eller uden de ovennævnte forbindelser.

Stabil integration af eGFP Wnt-reporter i prostatacancerceller

lentiviral eGFP Wnt reporter, 7xTcf-eGFP /SV40-mCherry blev købt fra Addgene (24304). Pakkeceller (HEK293T /17) (ATCC, CRL-11268) blev transient transficeret med 6 ug eGFP Wnt reporter konstrukt, 4 ug pakkende plasmid (psPAX2) og 2 ug kuvert udtrykkende plasmid (pMD2.G) under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Medier konditioneret med transfektanterne blev opsamlet efter 24 og 48 timer. LNCaP, abl og 22Rv1 celler blev inficeret ved inkubering i konditionerede medier natten over og fik lov til at restituere i en dag. Inficerede celler blev passeret og udvalgt af mCherry ekspression under anvendelse af flowcytometri.

Kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR)

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen), og derefter revers transskriberet ved 55 ° C i 1 time under anvendelse af Superscript III revers transkriptase og oligo- (dT) 20-primere (Invitrogen). Real-time PCR blev udført ved anvendelse af gen-specifikke primere og 2XSYBR grøn Taq-ready mix (Sigma). Data blev analyseret ved den DDCT metoden under anvendelse RPL19 som en kontrol-gen og normaliseret med kontrolprøver, som vilkårligt blev sat til 1.

Immunoblot, immunfældning og immunfarvning

I immunoblotanalyse blev celler lyseret i Triton-buffer og suppleret med 1 mM PMSF, 1 mM Na

3VO

4, 10 mg /ml leupeptin og 10 mg /ml aprotinin. Proteinlysater blev underkastet SDS-PAGE og immunblottet med følgende antistoffer mod: AR (441), β-catenin (H-102), TCF4 (H-125, Santa Cruz Biotechnology); aktive β-catenin (klon 8E7, Millipore); tubulin (Covance). Proteinbånd blev visualiseret under anvendelse af ECL Western Blotting detektionsreagenser (GE Healthcare). Billede J (NIH) software blev anvendt til at kvantificere protein niveauer.

immunopræcipitationseksperimenter celler blev lyseret som beskrevet ovenfor. Primære antistoffer, der er anført ovenfor blev sat til mindst 1,5 mg total protein og inkuberes natten over ved 4 ° C efterfulgt af tilsætning af protein A /G agarose beads (Santa Cruz Biotechnology) i 2 timer. Immune komplekser blev vasket grundigt med Triton-buffer og solubiliseret under anvendelse Laemmli prøvebuffer (BioRad). Normalt muse-IgG (Santa Cruz Biotechnology) eller normal kaninsera (Sigma) blev anvendt som kontroller.

I immunfluorescensfarvning blev celler fikseret med 4% formaldehyd i PBS i 20 min, vasket med PBS tre gange, permeabiliseret med 0,2% Triton-X i PBS i 20 min, blokeret med 5% normalt gede og 5% normalt hesteserum i PBS i 1 time og inkuberet med antistof mod aktiv β-catenin (Millipore) fortyndet med blokerende buffer, natten over ved 4 ° C. Den følgende dag blev cellerne vasket med PBS tre gange og derefter inkuberet med sekundære antistoffer konjugeret med FITC (Vector Lab) ved stuetemperatur i 1 time. Efterfølgende blev cellerne vasket i PBS tre gange og monteret med DAPI monterings opløsning (Vector Lab). At analysere eGFP og mCherry niveauer i celler, der stabilt integreret med 7xTcf-eGFP /SV40-mCherry-konstruktioner blev cellerne fikseret, vasket og permeabiliseret som beskrevet ovenfor og monteret med DAPI monteringsløsning.

Celleproliferationsassay

på CyQUANT celleproliferationsassay 3 til 4 x 10

3-celler blev udpladet i hver brønd af sort plade med 96 brønde. Celler blev udpladet i hormon-berøvet medier indeholdende 5% CFBS og dyrket i 2 til 3 dage, og derefter behandlet med angivne reagenser til hvert eksperiment. Reagenserne blev tilsat hver anden dag med flere medier og en tilsvarende mængde af vehikel tilsat til kontrolgruppen. Ved 2-3 dages mellemrum, blev CyQUANT assay (Invitrogen, C35006) udført i overensstemmelse med producentens anvisninger og analyseret på en SpectraMax M5 pladelæser (Molecular Devices) kører SoftMax Pro® software.

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

chippen blev udført som tidligere beskrevet [20]. Proteiner var dobbelt tværbundet med DSP (Pierce) i 20 minutter og 1% formalin i 10 minutter. Cellerne blev lyseret, kerner indsamlet og resuspenderet i sonikeringsbuffer, og sonicationed i 12 minutter (30 sek. På, 30 sek. Slukket) i en Bioruptor sonikator (Diagenode, model XL). Sonikerede lysater blev præ-blokerede i 2 timer med Protein A /G agaroseperler blokeret med laksesperm-DNA (Millipore). Supernatanter blev derefter inkuberet natten over med de følgende antistoffer: en blanding AR (441) og AR (N-20), eller β-catenin (H-102). Kontrol Chippen blev udført med normal mus IgG og normalt kanin IgG sera. Immunkomplekser blev derefter vasket og tværbinding omvendt. DNA blev isoleret med Qiagen PCR oprensningskit og qPCR blev udført. Relativ berigelse blev beregnet som en procentdel af 4% input normaliseret til IgG.

RNA-interferens (RNA-i)

I β-catenin og AR knockdown, siGENOME SMARTpool siRNA’er mod β-catenin eller AR blev brugt (Dharmacon). For APC knockdown, blev puljen af ​​tre Silencer® Select siRNA’er mod APC (Ambion, s1433, s1434 og s1435), der anvendes. Celler blev transficeret med HiPerFect transfektionsreagens (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. 1 X 10

5-celler blev udpladet i hver brønd i en plade med 24 i hormon-berøvet medier indeholdende 5% CFBS og blandingen af ​​HiPerFect reagens og siRNA’er blev tilsat direkte ovenpå cellerne. Celler blev dyrket i 2 dage og derefter behandlet med angivne reagenser til hvert eksperiment. For CyQUANT proliferationsassay 3 til 4 x 10

3-celler blev udpladet i hver brønd i sorte plader med 96 brønde i hormon-berøvet medier indeholdende 5% CFBS og blandingen af ​​HiPerFect reagens- og APC siRNA’er blev tilsat direkte oven på celler. Celler blev dyrket i 2 dage og derefter behandlet med angivne reagenser til hvert eksperiment. CyQUANT assay blev udført ved 2-3 dages intervaller som beskrevet ovenfor.

Cellelinjerne stabilt udtømt for β-catenin blev genereret med lentiviral pGIPZ shRNA mod β-catenin (Open Biosystems, RHS4430-98912789) eller en kontrol shRNA (Open Biosystems, RHS4743). Efter infektion blev celler udpladet ved en meget lav densitet og selekteret for 10 dage med 1 pg /ml puromycin (Sigma). Hver resistente celle koloni blev opsamlet og udvidet i udvælgelseskriterierne medier til at screene for beta-catenin-protein niveauer. To cellelinjer viser moderat reduktion af β-catenin blev udvalgt til at teste enzalutamide følsomhed (sh-β-cat-1 og -2) for at minimere den robuste vækst inhibitoriske virkning af β-catenin knockdown (25).

Resultater

androgen behandling undertrykker Wnt-reporter aktivitet i androgen-afhængige LNCaP celler

for at undersøge Wnt /β-catenin pathway aktivitet i prostatakræft, vi overvågede endogene Wnt /β-catenin aktivitet på en Wnt-reporter opstrøms for eGFP (7xTcf-eGFP /SV40-mCherry). Konstruktionen udtrykker også mCherry under konstitutivt aktive SV40-promotor indikerer positivt inficerede celler [21]. LNCaP, LNCaP-abl (abl) og 22Rv1 prostatacancerceller blev inficeret med lentivirus indeholdende reporter-konstruktionen og celler, der stabilt integreret med konstrukt blev udvalgt ved flowcytometri under anvendelse mCherry ekspression. Wnt reportergenaktivitet blev testet under anvendelse GSK-3 inhibitor (GSK3-I; CHIR99021), en potent Wnt-aktivator [22, 23]. eGFP Wnt reporter aktiviteten blev forøget i nærvær af GSK3-i, vist ved den forøgede transkription af eGFP i LNCaP-abl celler, der stabilt udtrykker reporter. EGFP transkription blev formindsket i nærværelse af siRNA targeting β-catenin (fig 1A). Under anvendelse af denne reporter undersøgte vi aktiviteten af ​​Wnt /β-catenin pathway i androgenafhængige LNCaP-celler, og androgen-uafhængige LNCaP-abl og 22Rv1 celler [24, 25]. På trods af rigelige niveauer af aktiv, nuklear β-catenin (fig 1B), viste de tre cellelinier lav basal aktivitet af Wnt-reporter (Fig 1C). Behandling med GSK-3 inhibitor (3 uM) aktiveres Wnt-reporter-aktivitet i androgen-uafhængige abl og 22Rv1 celler (Fig 1D), hvilket antyder, at øgede niveauer af β-catenin skulle aktivere Wnt /β-catenin-responsiv transkription. Men behandling af androgenafhængige LNCaP-celler med 3 uM GSK3-i havde meget lille effekt på Wnt reporter (data ikke vist). Endvidere blev Wnt-reporter ikke aktiveret i nærværelse af højere koncentrationer af GSK-3 inhibitor (6 eller 9μM) (Fig 1D). Fig 1E viser de relative mRNA-niveauer af eGFP i hver betingelse, med øget eGFP transkription i GSK-3-inhibitor behandlede ABL celler, men ikke i LNCaP-celler.

A

, catenin knockdown formindsket Wnt-reporter aktivering som reaktion på GSK-3-inhibitor den. ABL celler blev inficeret med eGFP Wnt-reporter (7xTcf-eGFP /SV40-mCherry) og transficeret med si-kontrol eller si – catenin. Celler blev dyrket i 2 dage og derefter behandlet med bærer, 2 pM eller 3 pM GSK-3-inhibitor i 24 timer. De relative mRNA-niveauer af eGFP indikerer Wnt aktivitet blev analyseret ved QRT-PCR.

B

, Niveauerne af nukleare catenin (grøn) i LNCaP, ABL og 22Rv1 prostatacancerceller blev bestemt ved immunfluorescensfarvning.

C

, Repræsentative fluorescens billeder, der viser det lave niveau af eGFP Wnt reporter aktivitet i LNCaP, abl og 22Rv1 celler: Wnt aktivitet (grøn), tilstedeværelse af celler (mCherry, rød), og nuklear placering (DAPI, blå ).

D og E

, androgenuafhængig abl og 22Rv1 celler er mere tilbøjelige til aktivering af Wnt-reporter. Celler blev behandlet med GSK-3-inhibitor i 24 timer og underkastet fluorescensmåling billeddannelse (

D

) eller QRT-PCR for at måle de relative mRNA-niveauer af eGFP (

E

). I

A-E

, blev udført eksperimenter i normale vækstmedier af hver cellelinie som beskrevet i Materialer og Metoder.

F og G

, hormon-berøvelse forbedret aktivering af Wnt-reporter i LNCaP celler, som mindskes ved androgen behandling. Celler blev behandlet med 9 pM GSK-3 inhibitor i fuldstændig (i) eller hormon-berøvet medier med /uden 10 nM di-hydrotestosterone (DHT) i 24 timer (ii og iii). Celler blev derefter underkastet fluorescensimagografi (

F

), eller QRT-PCR for at måle de relative mRNA-niveauer af eGFP (

G

). De præsenterede data er repræsentative for tre uafhængige forsøg, og den angivne fejl er standardafvigelsen.

Da β-catenin interagerer med AR i en androgen-afhængig måde [26-28], vi ræsonnerede, at androgen-deprivation kan forbedre β-catenin interaktion med TCF og dermed øge Wnt-reporter-aktivitet. Til støtte for denne idé, behandling af LNCaP-celler med GSK-3-inhibitor i regelmæssig hormon indeholdende medier (betingelse i) i forhold til hormon-berøvet medier (betingelse ii) medførte øget reporter aktivering (fig 1F) i hormon berøvet tilstand. Behandling med di-hydrotestosterone (DHT) formindsket denne reporter aktivering (fig 1F, betingelse iii), hvilket antyder, at androgen behandling undertrykker Wnt reporter-aktivitet i LNCaP-celler. Det relative niveau af eGFP mRNA i hver tilstand er vist i fig 1G.

Inhibering af AR-aktivitet forøger Wnt /β-catenin-reagerende transkription

Som vi observeret øget aktivering af Wnt-reporter i hormon-berøvet betingelser, vi den hypotese, at inhibering af AR-aktivitet kan forbedre Wnt /β-catenin-responsiv transkription. For at teste denne idé blev AR aktivitet undertrykt ved enten hormon-afsavn, antiandrogen behandling (enzalutamide [2]), eller siRNA-medieret AR udtynding. Cellerne blev behandlet med stigende koncentrationer af GSK-3-inhibitor til at inducere Wnt /β-catenin-reagerende transkription og de relative mRNA niveauer i Wnt-reporter (eGFP) og endogene Wnt /β-catenin målgen,

Axin2

, blev analyseret. Sammenlignet med kontrolceller, højere induktion af Wnt-reporter og

Axin2

mRNA-niveauer blev observeret i LNCaP-celler dyrket i hormon-berøvet medier, i nærværelse af enzalutamide eller behandlet med AR siRNA (Fig 2A-2C). Som et alternativ til GSK-3-inhibitor behandling vi gentog også eksperimentet under anvendelse APC knockdown at aktivere Wnt /β-catenin pathway. APC er en komponent af β-catenin ødelæggelse kompleks og APC deletion eller tab af funktion mutation er blevet vist at stabilisere β-catenin og aktivere Wnt /β-catenin-reagerende transkription [29, 30]. I overensstemmelse med resultaterne i GSK-3-inhibitor-behandlede celler (fig 2A-2C), APC-knockdown induceret højere aktivering af Wnt-reportergenet og

Axin2

transkription i hormon-berøvet eller enzalutamide behandlede celler (Fig 2D og 2E ), hvilket antyder at AR undertrykkelse fremmer Wnt /β-catenin-aktivering i LNCaP-celler. Imidlertid ABL celler udviste høje niveauer af Wnt reporter og

Axin2

ekspression i respons til GSK-3-inhibitor, der kun let øget i fravær af DHT eller nærvær af enzalutamide (fig 2F og 2G) med undtagelse af

Axin2

, som var upåvirket af enzalutamide behandling i forhold til at styre celler (fig 2G). Udtømning af AR af siRNA viste en stigning i Wnt reporter geners aktivitet og

Axin2

mRNA i både LNCaP- og ABL celler (Fig 2C og 2H) tyder på, at udtømning af AR protein resulterer i frigivelse af mere β-catenin i en cellulære pulje til rådighed for at aktivere Wnt /β-catenin pathway

LNCaP-celler blev behandlet med 6 uM eller 9 uM af GSK-3 inhibitor (

AC

).; ABL-celler blev behandlet med og 2 uM eller 3 pM af GSK-3 inhibitor (

F-H

).

A og F

, Celler blev hormon-berøvet i 3 dage og derefter behandlet med vehikel eller stigende koncentration af GSK-3-inhibitor med /uden 10 nM DHT i 24 timer.

B og G

blev celler behandlet med vehikel eller stigende koncentration af GSK-3-inhibitor med /uden 10 uM enzalutamide (Enz) i 24 timer.

C og H

, Celler blev transficeret med si-kontrol eller si-AR, dyrket i 2 dage og derefter behandlet med vehikel eller stigende koncentration af GSK-3-inhibitor i 24 timer.

D og E

blev LNCaP-celler transficeret med si-kontrol eller stigende mængder af si-APC og enten hormon-berøvet i 2 dage og derefter behandlet med køretøjet eller 10 nM DHT i 24 timer (

D

) eller dyrket i komplette medier i 2 dage og derefter behandlet med vehikel eller 10 uM enzalutamide i 24 timer (

E

). De relative mRNA-niveauer af de angivet gener analyseres ved QRT-PCR. De præsenterede data repræsenterer tre uafhængige forsøg og den indikerede fejl er standardafvigelsen.

Alt i alt tyder disse resultater, at i androgenafhængige LNCaP-celler, kan inhibering af AR tillade tumorcellerne at aktivere Wnt /β-catenin pathway. Under betingelser med hormon deprivation kan dette ske ved udsættelse for Wnt-signaler sandsynligvis til stede i tumormikromiljøet [15, 31, 32]. I modsætning hertil synes androgen-uafhængige ABL-celler, der er afledt fra LNCaP-celler, klar til Wnt /β-catenin-aktivering i både nærvær og fravær af AR-aktivitet, hvilket indikerer, at interaktionen mellem AR og Wnt /β-catenin pathways kan have været ændret i progression til androgen uafhængighed.

hormon afsavn øger β-catenin interaktion med TCF4

Da β-catenin interagerer med AR eller TCF for at aktivere AR eller Wnt /β-catenin-lydhør transkription henholdsvis i prostatacancer [33, 34], undersøgte vi β-catenin belægning på AR og TCF-bindingssteder ved anvendelse chromatin immunoprecipitation (chip) assays. LNCaP-celler blev behandlet med DHT, GSK-3 inhibitor eller en kombination af begge i 4 timer i hormon-berøvet medier. De relative mRNA-niveauer af Wnt /β-catenin (eGFP Wnt-reporter og

Axin2

) og AR-mål (

PSA

) gener i hver tilstand blev analyseret (figur 3A). β-catenin belægning på TCF eller Ar bindingssteder blev også undersøgt (Fig 3B) for at bestemme, om β-catenin rekruttering korreleret med målgenekspression. Som forventet, Wnt-reporter og

Axin2

mRNA-niveauer var øget i GSK-3-inhibitor-behandlede celler, men formindsket i nærvær af DHT og GSK-3 inhibitor (fig 3A). I overensstemmelse med mRNA-niveauer, blev β-catenin rekrutteret til TCF bindingssteder på Wnt-reporter og

Axin2

som reaktion på GSK-3-inhibitor, men ikke i cellerne co-behandlet med GSK-3 inhibitor og DHT (fig 3B). Transkription af

PSA

opstod som reaktion på DHT, og dette var upåvirket af samtidig behandling med DHT og GSK-3 inhibitor (fig 3A). β-catenin belægning blev observeret ved den

PSA

enhancer ved DHT behandling, men blev formindsket ved samtidig behandling med DHT og GSK-3 inhibitor (fig 3B), hvilket antyder, at i denne forbindelse β-catenin er ikke afgørende for

PSA

transskription. AR blev også analyseret; viser belægning på

PSA

som reaktion på DHT behandling, men ingen bindende blev fundet på TCF steder af Wnt /β-catenin target gener i enhver behandling (Fig 3C).

A

, Ekspression af Wnt /catenin målgener (eGFP reporter og

Axin2

) og AR målgenet (

PSA

) blev analyseret. LNCaP-celler blev hormon-berøvet i 3 dage og derefter behandlet med vehikel, 10 nM DHT, 9 uM GSK-3 inhibitor eller en kombination af begge i 24 timer.

B og C

, catenin eller AR bindende for målgener blev analyseret ved hjælp af kromatin-immunopræcipitation. LNCaP-celler blev hormon-berøvet i 3 dage og derefter behandlet med vehikel, 100 nM DHT, 9 uM GSK3-I eller en kombination af begge i 4 timer.

D og E

blev catenin interaktion med TCF4 eller AR analyseret ved hjælp af co-immunopræcipitation. LNCaP-celler blev hormon-berøvet i 3 dage og derefter behandlet med vehikel, 100 nM DHT, 9 uM GSK-3 inhibitor eller en kombination af begge i 4 timer. De proteinlysater blev enten immunoblottet med angivne antistoffer (

D

) eller underkastes co-IP studier (

E

) Kvantificering af β-catenin og aktive β-catenin-proteinniveauer er vist nedenfor paneler i (

D

). Relativ densitometri er normaliseret til køretøj alene sat til 1. De præsenterede data er repræsentative for tre uafhængige forsøg, og den angivne fejl er standardafvigelsen.

For at afgøre, om AR og β-catenin belægning på mål gener korrelerer med β-catenin binding til enten AR eller TCF4 protein gennemførte vi co-immunopræcipitationsanalyser. LNCaP-celler blev behandlet som beskrevet for chip assays ovenfor, og proteinlysater blev immunfældet med β-catenin antistof. Fig 3D viser, at AR er stabiliseret af DHT behandling. Mens de samlede niveauer af β-catenin var uændret ved 4 timers GSK-3-inhibitor behandling, GSK-3-inhibering let forøget protein ekspression af den aktive form af β-catenin (ikke-phosphoryleret i serin 37 og threonin 41, [35]), uafhængig af tilstedeværelsen af ​​DHT (fig 3D). Samlet set DHT behandling steg AR /β-catenin interaktion og faldt TCF4 /β-catenin interaktion sammenlignet med bærer behandling (fig 3E), som tidligere [34, 36] rapporteret. I overensstemmelse med chippen resultater (Fig 3B), GSK-3-inhibitor forbedret TCF4 /β-catenin interaktion, men kombinatoriske behandling med DHT formindsket denne interaktion (Fig 3E). Desuden viste celler behandlet med DHT forbedret AR /β-catenin interaktion, som blev reduceret i nærvær af GSK-3 inhibitor (fig 3E) stemte overens med formindsket AR om på

PSA

enhancer i nærvær af GSK-3-inhibitor og DHT (fig 3C). Det er ukendt, hvorfor AR binding til

PSA

og interaktion med β-catenin reduceres når DHT er co-behandlet med GSK-3-inhibitor, men det nedsatte niveau af AR på

PSA

forstærker stadig var tilstrækkeligt for

PSA

transskription (fig 3A, PSA mRNA-niveauer i DHT vs DHT + GSK3-i).

sammenfattende både chip og co-IP analyseresultaterne viser, at β- catenin interaktion med TCF4 (fig 3E) og rekrutteringen til Wnt /β-catenin målgener (figur 3B) var forøget i fravær af androgen, i overensstemmelse med den forbedrede Wnt /β-catenin-reagerende transkription under hormon-depleteret betingelser (fig 1F, 2A og 2D).

Inhibering af AR og Wnt /β-catenin veje øger væksten undertrykkelse af LNCaP-celler

Da en af ​​de cellulære reaktioner af Wnt-pathway er at fremme proliferation [37, 38], testede vi, om den forøgede aktivering af Wnt /β-catenin pathway i fravær af androgen eller nærvær af enzalutamide (fig 2A, 2B, 2D og 2E) også fremmet celleproliferation. LNCaP-celler dyrket i hormon-berøvet medier blev væksten standset som forventet [39], men GSK-3 inhibitor behandling eller APC knockdown induceret vækst svarende til DHT behandling (Fig 4A og 4E). Enzalutamide behandling også undertrykt vækst af LNCaP-celler som tidligere observeret [2] men dette vækstinhiberende virkning var lettet ved GSK-3 inhibitor behandling eller APC knockdown (Fig 4B og 4F). Vi undersøgte også transkription af en M-fase cellecyklus regulerende gen,

UBE2C

, tidligere vist at være vigtig for væksten af ​​androgen-uafhængige prostatacancerceller [40]. GSK-3-inhibitor behandling resulterede i opregulering af

UBE2C

transskription ligner DHT behandling (Fig 4C), samt de-repression af

UBE2C

i enzalutamide co-behandlede celler (fig 4D). Disse resultater antyder, Wnt /β-catenin aktivering fremmer væksten af ​​LNCaP-celler i fraværet af androgen eller i nærvær af enzalutamide, ledsaget af opregulering af

UBE2C

. Behandling af celler med en inhibitor af Wnt /β-catenin pathway, iCRT3 (C3) [41], formindskede vækstfremmende virkning af GSK-3-inhibitor i en dosis-responsiv måde (Fig 4G og 4H), hvilket yderligere indikerer, at den Wnt /β-catenin vej dirigerer androgen-uafhængig vækst LNCaP celler.

aF

, GSK-3-inhibitor behandling eller APC knockdown fremmer væksten af ​​LNCaP celler i hormon-berøvet eller enzalutamide ( Enz) behandlede medier.

A og B

, Celler blev hormon-berøvet i 3 dage og derefter behandlet med vehikel, 10 nM DHT eller 6 uM GSK3-i (

A

), eller 10 nM DHT med /uden 10 uM Enz eller 6 uM GSK3-i (

B

) hver anden dag.

C og D

, Cellerne blev behandlet som beskrevet i (

A

) eller (

B

) i 24 timer og derefter de relative mRNA-niveauer af

UBE2C

blev analyseret ved QRT-PCR.

E og F

blev Celler transficeret med si-kontrol eller si-APC, hormon-berøvet i 2 dage og derefter behandlet med køretøjet eller 10 nM DHT (

E

), eller 10 nM DHT med /uden 10 pM Enz (

F

) hver anden dag.

G og H

, Behandling af celler med Wnt /β-catenin-inhibitor (C3) formindsker vækstfremmende virkning af GSK3-i. LNCaP celler hormon-berøvet i 3 dage og derefter behandlet med køretøj eller 6 uM GSK3-i (

G

), eller 10 nM DHT plus 10 uM Enz (

H

) med /uden stigende koncentrationer af C3 hver to dage.

jeg

, Co-behandling af Enz og C3 viser øget vækst hæmning af LNCaP celler.