PLoS ONE: Øget ekspression af ATG10 i kolorektal cancer er forbundet med Lymphovascular Invasion og lymfeknuder Metastasis

Abstrakt

Baggrund

Autophagy har paradoksale og komplekse funktioner i udviklingen af ​​kræft, og autofagi-relaterede gener (ATG) er centrale regulatorer i autofagi. Indtil nu har mere end 30 forskellige ATG proteiner blevet identificeret i gær, og deres pattedyr kolleger også er blevet rapporteret. Selvom rollerne for et par ATG proteiner i cancer er blevet karakteriseret, rolle ATG10 er næsten helt ukendt.

Metodologi /vigtigste resultater

For at undersøge klinisk-patologisk rolle ATG10 i kolorektal cancer, vi analyserede ATG10 udtryk i kolorektal cancer væv og cellelinier. Proteinekspression analyse viste, at ATG10 er stærkt forøget i kolorektal cancer (tissue – 18/37 cases, 48%; cellelinje -8/12 cellelinier, 66%). Immunohistokemisk analyse med klinisk-patologiske træk indikerede en stærk association af opregulering af ATG10 med tumor lymfeknudemetastase (p = 0,005) og invasion (p 0,001). Desuden har både 5-års sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse satser for patienter, der bærer tumorer, der ikke udtrykker ATG10 var væsentligt højere end for patienter, der bærer ATG10-udtrykkende tumorer (p = 0,012).

Konklusion /Betydning

Øget ekspression af ATG10 i kolorektal cancer er forbundet med lymphovascular invasion og lymfeknude metastaser indikerer, at ATG10 kan være en potentiel prognostisk maker i kolorektal cancer

Henvisning:. Jo YK, Kim SC, Park IJ , Park SJ, Jin DH, Hong SW, et al. (2012) Øget ekspression af ATG10 i kolorektal cancer er forbundet med Lymphovascular Invasion og lymfeknudemetastase. PLoS ONE 7 (12): e52705. doi: 10,1371 /journal.pone.0052705

Redaktør: Henrik Einwaechter, Klinikum Rechts der Isar der TU München, Tyskland

Modtaget: 23. marts 2012; Accepteret: November 19, 2012; Udgivet: December 20, 2012 |

Copyright: © 2012 Jo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af center for udvikling og kommercialisering af Anti-Cancer Therapeutics og den koreanske Health 21 R . T, tumorvæv, N, tilsvarende normale væv). ATG10 ekspression blev normaliseret til actin ekspression (n = 37). (B) Western blot analyse af ATG10 udtryk i flere kolorektale cellelinjer (Normal – CCD841, Kræft – HCT116, HT29, KM12C, WiDr, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO, Caco2). ATG10 ekspression blev kvantificeret ved densitometri.

Forholdet mellem ATG10 Expression og Tumor Progression og Invasion

Vi undersøgte rolle ATG10 i tumor progression og invasion yderligere. For at undersøge klinisk-patologiske træk, blev immunhistokemisk analyse af et væv array med 127 colorektale cancer prøver udført (fig. 2 og tabel 1). Væv uden farvning eller svag farvning (≤10%) blev kategoriseret som negative (-). Væv med 10% farvning blev kategoriseret som positive (+). Tredive af de 127 tumorprøver (24%) viste ATG10 ekspression. Forholdet mellem ATG10 Ekspressions- og klinisk-patologiske træk er vist i tabel 2. Resultaterne viste, at ATG10 ekspression blev stærkt associeret med lymphovascular invasion (

P

0,001) og lymfeknudemetastaser (

P

= 0,005). Imidlertid blev ATG10 ekspression ikke signifikant associeret med alder, køn, tumorstedet, serum carcinoembryonisk antigen eller tumor proliferation. Disse resultater viser, at ATG10 udtryk er stærkt forbundet med lymphovascular invasion i kolorektal cancer.

ATG10 udtryk mønster i kolorektal cancer blev bestemt ved immunhistokemisk analyse af et væv microarray. (A og b) Negative prøver (-) med ≤10% farvning (200), (c og d) prøver med 10% til 50% farvning (+, × 200), og (e og f) prøver med 50 % farvning (+, × 200).

Forholdet mellem ATG10 Expression og patientoverlevelse

Resultaterne af den immunhistokemiske analyse viste, at ATG10 er tæt forbundet med tumor invasion, som er kendt risikofaktor for tilbagefald og overlevelse resultater. Således har vi vurderet forholdet mellem ATG10 udtryk og satserne for 5-års sygdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS) i kolorektale patienter. De 5-årige DFS og OS satser for patienter, der bærer tumorer, der ikke udtrykker ATG10 var væsentligt højere end for patienter, der bærer ATG10-udtrykkende tumorer (5-års OS [gennemsnit ± SEM], 76,4 ± 0,4%

vs.

57,5 ​​± 0,1%,

P

= 0,012;. 5-års DFS, 75,8 ± 0%

vs

42,8 ± 0,1%,

P

= 0,012) ( fig. 3). Disse resultater antydede, at ATG10 kan være en potentiel prognostisk maker i kolorektal cancer. I en multivariat analyser med potentielle overlevelse variabler, lymfeknude metastase alene var signifikant forbundet med overlevelse parametre, mens ATG10 udtryk ikke var (Hazard Ratio, 4,736

vs

1,404;. 95% konfidensinterval, 1,763 til 12,723

vs

0,676-2,916;.

P

= 0,002

vs

0,363)

forholdet mellem ATG10 udtryk og 5-års sygdomsfri overlevelse (. DFS) og total overlevelse (OS) satser for patienter med tyktarmskræft blev analyseret af Kaplan-Meier-kurver.

nedregulering af ATG10 Undertrykt Cell Proliferation i tyktarmskræft Celler

Vi yderligere undersøgte virkningen af ​​nedregulering af ATG10 på celleproliferation i HCT116-celler. Udtømning af ATG10 ekspression ved RNA-interferens lidt undertrykt celleproliferation sats i HCT116-celler, hvilket antyder, at ATG10 har funktionelle rolle i celleproliferation (fig. 4).

HCT116-celler blev transient transficeret med enten krypteret negativ siRNA (Scram) eller ATG10 specifik siRNA (siATG10) derefter cellen proliferationshastighed blev dagligt bestemmes ved anvendelse af en CCK-8 assaykit (a). Nedreguleringen af ​​ATG10 af siRNA blev bekræftet med Western blot-analyse (B). Data er repræsenteret ved middelværdien ± SEM (n = 3).

Diskussion

Autophagy styres af ATG proteiner og deres regulatorer [5], [8]. ATG-proteiner initiere autophagosome dannelse gennem autophagic konjugation [2]. Rolle ATG6 i kræft er blevet karakteriseret. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at faldet ATG6 ekspression fremmer tumorigenese i dyremodeller, og ATG6 nedreguleres i forskellige humane cancere [12] – [15]. Imidlertid er den rolle, andre ATG proteiner i tumorigenese ikke godt forstået.

I denne undersøgelse evaluerede vi ATG10 udtryk hos patienter med sporadisk kolorektal cancer. ATG10 er en E2-lignende enzym involveret i Ub-lignende ændring, som er afgørende for autophagosome formation. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at flere overudtrykte Ub-E2 lignende proteiner fremmer tumorudvikling i forskellige kræftformer [16] – [18]. Imidlertid rolle ATG10 i cancer er endnu ikke blevet evalueret,. I modsætning ATG6, der nedreguleres ved cancer, de foreliggende resultater indikerer, at ATG10 forøges i kolorektal cancer. Endvidere blev ATG10 ekspression stærkt forbundet med tumorinvasion og metastase. Vores resultater antyder, at ATG10 kan være et onkogent protein. Vi evaluerede også virkningen af ​​ATG10 overekspression på celleproliferation og i en mus xenograft model ved hjælp af RKO carcinomaceller stabilt udtrykker ATG10. Celleproliferation og tumorvækst blev ikke signifikant påvirket af ektopisk ekspression af ATG10 (data ikke vist). Men knock-down af ATG10 udtryk med siRNA undertrykt celledeling sats i HCT116 celler. Således fortsætter vi med at undersøge effekten af ​​opreguleret ATG10 på tumorigenese.

Genetiske ændringer er ansvarlig for forøget ekspression af mange onkogene proteiner. Den kromosomale region ATG10 (5q14) ofte tabt i ovariecancer, mavekræft, og brystkræft [19], [20]. Men de seneste genom-dækkende DNA microarray undersøgelser viste, at den 5q14 regionen forstærkes i neurofibrosarcoma og bugspytkirtelkræft [21], [22]. Kopiér nummer variationer på 5q14 i kolorektal cancer er ikke godt forstået. Således er der behov for fremtidige undersøgelser for at fastslå allele ændringer på dette locus i kolorektal cancer.

Autophagy synes at have dobbeltfunktioner i kræft. Især kan timingen af ​​autofagi være vigtig for tumorudvikling. I den tidlige fase af tumorigenese, synes autofagi at fungere som en tumorsuppressor. Som et resultat, inhibering autofagi forøger DNA-skade, kromosomale ændringer, såsom allelisk tab og gevinst, og oxidativt stress, hvilket kan føre til onkogene begivenheder [23], [24]. Men autophagy fremmer også tumorigenese. Autophagy induktion ved løsrivelse fra den ekstracellulære matrix hjælper tumor celle overlevelse under anoikis, som bidrager til formidling og metastaser [25], [26]. I overensstemmelse med disse tidligere undersøgelser, viste vores resultater, at ATG10 ekspression er tæt forbundet med lymphovascular invasion og lymfeknudemetastaser i colorektal cancer. Disse resultater kan forklares ved tilslutning af tumor-erstattet knudepunkter eller intravaskulære tumor aggregater med systemiske lymfeknuder via lymphovascular kanaler [27], [28]. Tumor invasion og metastase er kendt risikofaktorer for tilbagefald og overlevelse resultat. Ifølge dette begreb, fandt vi, at ATG10 ekspression i tumorer var forbundet med lavere overlevelsesrater. Imidlertid bør forholdet mellem ATG10 udtryk og kliniske resultater bekræftes med en større kohorte til bedre at forstå den rolle ATG10 i kræft.

Som konklusion, ATG10 opregulering i kolorektal cancer er tæt forbundet med lymphovascular invasion og lymfeknudemetastase, hvilket indikerer, at ATG10 kan være nyttig som en prognostisk markør og som et terapeutisk mål i colorektal cancer.

Materialer og metoder Salg

Patienter og tumorprøver

at evaluere ATG10 udtryk, blev 37 kolorektal cancer vævsprøver tilfældigt udvalgt fra arkivering prøver fra resektioner udført mellem juni 1999 og 2003 på Asan Medical center (Seoul, Korea). For den efterfølgende kliniske validering af differentieret protein ekspressionsmønstre, vi vurderet tumor prøver fra i alt 124 patienter med sporadisk kolorektal cancer, herunder konsekutive patienter, som gennemgik resektion med helbredende hensigt (R0 resektion, n = 119, R1 resektion, n = 5) (tabel 1). Patienter med HNPCC eller familiær adenomatøs polypose blev udelukket, da var dem, der gennemgik præoperativ chemoradiation terapi. Gentagelse, herunder regionale og fjernmetastaser, fandt sted i 22 af 124 patienter (17,7%), der fik foretaget helbredende resektion under opfølgning (middel, 58 måneder, interval, 3-123 måneder). Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke, og undersøgelsen protokollen blev godkendt af IRB (institutionelle Review Board), i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen.

cellelinjer og reagenser

CCD841 celler venligt leveret af Dr. SY Rha (Yonsei University, Seoul, Korea) [29]. Den AMC5 cellelinjen blev afledt som beskrevet tidligere [30]. Og andre cancer cellelinjer, såsom HCT116, HT29, KM12C, WiDr, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO og Caco2 blev købt fra ATCC (Manassas, VA). Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator og holdt i RPMI1640-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Western blot-analyse

proteiner fra væv og celler blev fremstillet under anvendelse af protein prøvebuffer (62,5 mM Tris-HCI, 25% glycerol, 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 0,01% bromphenol blå) (BioRad, Hercules, CA). Proteiner (ca. 50 ug) blev kvantificeret ved anvendelse af Bradford-opløsning (BioRad) ifølge producentens instruktioner og derefter separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidenfluorid membraner (BioRad). Membranerne blev inkuberet med primære antistoffer mod ATG10 (1:3000, MBL, Nagoya, Japan) og actin (1:10,000; Chemicon International, Temecula, CA). Membranerne blev derefter inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer. (1:5000; Pierce, Rockford, IL) Salg

immunhistokemisk farvning Salg

vævsarray blokke blev fremstillet under anvendelse af en præcisions instrument (Beecher Instruments , Sun Prairie, WI). Immunhistokemisk farvning baseret på mærket streptavidin-biotin-metoden blev udført ved anvendelse af et Dako LSAB kit (Dako, Carpinteria, CA) med monoklonale ATG10 antistoffer (MBL). Svag farvning (≤10%) og ingen farvning blev scoret som negativ (-), og 10% farvning blev scoret som positiv (+). Prøver med negativ immunkemisk farvning blev undersøgt to gange for at bekræfte resultaterne.

Cell Proliferation Assay

Små interfererende RNA for ATG10 (siATG10, siGENOME SMART pool) og scrambled kontrol ikke-targeting siRNA (Scramble) blev syntetiseret af Dharmacon, Inc. (Thermo Scientific, Chicago, IL). HCT116-celler blev transficeret med 0,5 pmol /L i siATG10 eller krypteret siRNA med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Derefter blev proliferationshastigheden målt under anvendelse af et celleproliferationsassay kit (CCK-8) i overensstemmelse med producentens protokol (Dojindo Corporation, Japan). Kort fortalt blev celler i 96-brønds plade blandet med 10 pi CCK-8-opløsning, og blev derefter inkuberet i en time i en CO

2 incubator. Den efterfølgende kolorimetriske ændring blev målt ved anvendelse af en Victor mikrotiterpladelæser (PerkinElmer) indstillet til at overvåge ændringer i absorbans ved 450 nm.

Statistical Analysis

Cross-table-analyse under anvendelse af Fishers eksakte test med to- sidet kontrol blev anvendt til at sammenligne immunohistokemiske resultater ifølge de klinisk-patologiske træk og fornyet forekomst af patienter. Primære endepunkter var tilbagefald, 5-års DFS, og 5-års OS. Overlevelsesrater blev sammenlignet af Kaplan-Meier-metoden med log-rank test, og potente overlevelsesfaktorer blev verificeret ved hjælp af Cox ‘regressionsmodel. Signifikansniveauet på 5% blev valgt ved hver analyse. Statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS-software (version 19; SPSS Inc., Chicago, IL).