PLoS ONE: mucin MUC4 og dens Membrane Partner ErbB2 Regulere biologiske egenskaber af menneskelig Capan-2 bugspytkirtelkræftceller via forskellige Signalering Pathways

Abstrakt

mucin MUC4 og dens membran partner ErbB2 onkogene receptor er potentielle interagerende partnere i human pancreas tumorudvikling. Men den måde de fungerer, er stadig stort set ukendt. I dette arbejde, vi havde til formål at identificere de cellulære mekanismer og de intracellulære signalveje under kontrol af både ErbB2 og MUC4 i en human pancreas adenocarcinomatous cellelinie. Brug co-immunpræcipitering og GST pull-down, viser vi, at MUC4 og ErbB2 interagere i den menneskelige bugspytkirtlen adenocarcinomatous cellelinie Capan-2

via

EGF domæner MUC4. Stabile cellekloner blev dannet ved hvilken enten MUC4 eller ErbB2 blev slået ned (KD) af en shRNA fremgangsmåde. Biologiske egenskaber af disse celler blev derefter undersøgt

in vitro

in vivo

. Vores resultater viser, at ErbB2-KD celler er mere apoptotiske og mindre proliferativ (nedsat cyclin D1 og forøget p27KIP1 ekspression) mens migration og invasive egenskaber ikke er blevet ændret. MUC4-KD-kloner var mindre proliferativ med nedsat cyklin D1 udtryk, G1 cellecyklusstop og ændret ErbB2 /ErbB3 udtryk. Deres migration egenskaber blev reduceret mens invasive egenskaber blev forøget. Vigtigere er, at inhibering af ErbB2 og MUC4 ekspression ikke forringe de samme signalveje (hæmning af MUC4 ekspression påvirkede JNK mens anlægget på ErbB2 ændret MAPK-vejen). Endelig viste ErbB2-KD og MUC4-KD celler nedsat vækst tumor

in vivo

. Vores resultater viser, at ErbB2 og MUC4, som interagerer fysisk, aktivere forskellige intracellulære signalveje at regulere biologiske egenskaber Capan-2 bugspytkirtelkræftceller

Henvisning:. Jonckheere N, Skrypek N, Merlin J, Dessein AF, Dumont P, Leteurtre E, et al. (2012) mucin MUC4 og dens Membrane Partner ErbB2 Regulere biologiske egenskaber af menneskelig Capan-2 bugspytkirtelkræftceller

via

Forskellige Signalering Veje. PLoS ONE 7 (2): e32232. doi: 10,1371 /journal.pone.0032232

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: August 12, 2011; Accepteret: 24 Januar 2012; Publiceret: 29 feb 2012

Copyright: © 2012 Jonckheere et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dr. Nicolas Jonckheere er en modtager af en postdoc stipendium fra Institut National du Cancer (Inca) og Ligue nationale contre le Cancer (LNCC). Nicolas Skrypek er en modtager af et ph.d.-stipendium af Centre Hospitalier Régional Universitaire (CHRU) de Lille /region Nord-Pas de Calais. Dr. Frédéric Frénois er en modtager af en postdoc stipendium fra Fondation pour la Recherche Médicale (FRM). Johann Merlin er modtageren af ​​en ph.d.-stipendium fra Université de Lille 2 og Région Nord-Pas de Calais. Dette arbejde er støttet af en bevilling fra la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labellisée Ligue 2010, IVS). Isabelle Van Seuningen er modtageren af ​​en “Contrat Hospitalier de Recherche Translationnelle” /cHRT 2010, AVIESAN. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas Ductal adenocarcinom (PDAC) er den 4. hyppigste dødsårsag ved kræft i verden. Overlevelsen kurve er ekstremt kort (6 måneder) og overlevelsesraten efter 5 år er meget lav (3%). Denne dramatiske resultat er relateret til en mangel på terapeutiske værktøjer og tidlige diagnostiske markører, som gør bugspytkirtelkræft den mest dødelige kræft. På tidspunktet for diagnosen, mere end 80% af PDAC allerede metastatisk eller lokalt avanceret og kun omkring 10 til 15% af patienterne er berettiget til kirurgisk resektion. Pancreas carcinogenese følger en metaplasi /dysplasi /cancer progression med PDAC udvikler fra duktalt læsion forstadier kaldet Pancreas intraepitelialneoplasi (Panin-1A /-1b /-2 /-3), hvor histologiske, cytologisk og genetiske ændringer akkumulere [1], [2 ]. Identifikation af nye molekylære mål, især dem med ændret ekspression i begyndelsen Panin, og dechifrere de molekylære mekanismer bag sygdommen, vil utvivlsomt muliggøre udviklingen af ​​nye terapeutiske fremgangsmåder til at stoppe /bremse tumorprogression.

I denne sammenhæng , den membranbundne mucin MUC4, som udtrykkes så tidligt som i Panin-1A mens det ikke er udtrykt i de raske bugspytkirtlen, og dens membran partner den onkogene receptor ErbB2 som ofte overudtrykkes i bugspytkirtelkræft samt i PanINs, repræsenterer lovende terapeutiske mål [3], [4], [5], [6].

MUC4 genet koder et stort apomucin (930 kDa), der består af to underenheder MUC4α og MUC4β [7], [8] , [9], [10]. MUC4α er det ekstracellulære underenhed featuring en typisk hyperglycosyleret region. MUC4β er det transeuropæiske membranen underenhed indeholdende tre EGF-lignende domæner (EGF3, EGF1 og EGF2 ligger fra C-terminalen til N-terminalen), som er konserveret i mennesker og gnavere [4], [11]. Eksperimentel dokumentation med rotte homologer af MUC4 og ErbB2 antyder, at de EGF-lignende domæner spiller en rolle i receptor-ligand-interaktioner og er en regulator ved signalering relateret til vækst, motilitet eller differentiering af cellen [4], [12]. Ud fra disse data, har Carraway og samarbejdspartnere foreslået MUC4 som modulator af spredning /differentiering balance [13], men på dette tidspunkt, sådan foreslåede mekanisme er ikke godkendt til human MUC4.

onkogen neu koder ErbB2 /HER2 type i transmembrane vækstfaktorreceptor, som tilhører den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR /ErbB1) familie bestående ErbB3 og ErbB4. ErbB2-proteinet består i et ekstracellulært domæne, et transmembrant domæne og et intracellulært tyrosinkinasedomæne. ErbB2 har ingen kendt ligand og beskrives som en co-receptor, som hetero-dimeriserer med de andre ErbB-receptorer [14]. ErbB2 er almindeligt overudtrykt i kræft, herunder PDAC, hvor ErbB2 ofte forstærkes.

Studier i humane celler forbliver knappe og foreslå hidtil en mulig rolle for MUC4 i biologiske egenskaber bugspytkirtelkræftceller [15], [ ,,,0],16]. Med hensyn til ErbB2, har kun en nylig undersøgelse i en anden bugspytkirtelkræft celle model vist, at ErbB2 kan være involveret i egenskaberne for bugspytkirtelkræftceller [17]. Tidligere værker i colon og pulmonære celler viste, at MUC4 og ErbB2 kan fungere som et funktionelt kompleks og transducerer signaler intracellulært [18], [19]. Men det er uklart, om MUC4 og ErbB2 aktivere samme signalvej (r).

I det nuværende arbejde, vi lovede at identificere de intracellulære signalveje under kontrol af enten ErbB2 eller MUC4 i samme cellulære model af pancreascancer at teste denne hypotese. Vi viser, at menneskelig MUC4 og ErbB2 fysisk interagerer i bugspytkirtelkræftceller og at hæmning af ekspressionen af ​​hver membran partnere forringer ikke de samme signalveje (hæmning af MUC4 udtryk påvirker JNK mens der i ErbB2 ændrer MAPK vejen). Forskellige effekter på de biologiske egenskaber af bugspytkirtelkræftceller blev observeret, hvilket tyder på selvstændig virksomhed som disse to proteiner med en rolle i bugspytkirtlen tumorvækst for ErbB2, mens MUC4 synes at være involveret i både tumorvækst og formidling.

Materialer og metoder

Etablering af ErbB2 og MUC4 KD cellelinjer

Capan-2 bugspytkirtelkræft cellelinje (ATCC, HTB-80) blev dyrket som tidligere beskrevet [20]. ErbB2-KD-celler blev opnået efter stabil transfektion af Capan-2-celler med pGeneClip ™ puromycin vektor, der koder ErbB2 shRNA (SA Biosciences ™). Stabil transfektion af 1 ug Scal-fordøjet plasmid blev udført med Effectene® (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig) efter fabrikantens protokol. Den tomme vektor blev brugt til at hæve kontrol kloner kaldet Non målretning (NT). Selektion blev udført under anvendelse puromycine (0,1 ug /ml, InvivoGen, Limoges) og kloner blev isoleret ved begrænset seriefortynding. MUC4-slået ned (KD) -celler blev opnået ved retroviral infektion af Capan-2-celler med pRetroSuper plasmid (SA Biosciences ™) indeholdende en sekvens målretter MUC4 (5′-AAGTGGAACGAATCGATTCTGTTCAAGAGACAGAATCGATTCGTTCCACTT-3 ‘). Den tomme vektor blev brugt til at hæve kontrol kloner kaldes

Mock

. Udvælgelse blev udført ved hjælp af G418 /Geneticin (300 pg /ml, Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrig), og kloner blev isoleret ved seriel grænse fortynding.

Western blotting

Cytosoliske, nukleare og totale cellulære ekstrakter blev fremstillet som beskrevet i Van Seuningen

et al.

[21] og Jonckheere

et al.

[22], henholdsvis og holdt ved -80 ° C indtil anvendelse. Proteinindholdet (2 pi kerneekstrakter) blev målt i 96-brønds plader under anvendelse af bicinchoninsyre som beskrevet i producentens brugsvejledning (Pierce). Western blotting blev udført på nitrocellulosemembran (0,2 um, Schleicher og Schuell) som tidligere beskrevet [23]. Membraner blev probet med antistoffer mod ErbB-2 (klon Ab-1, fortynding 1/500), p27KIP1 (fortynding 1/500) fra Lab Vision Neomarker, USA; phospho-p42 /44MAPK (Thr202 /Tyr204) (klon 20G11, fortynding 1/500), p42 /44MAPK (klon I37F5, fortynding 1/500), phospho-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251, fortynding 1 /500), SAPK /JNK (klon 56G8, 1/500), phospho-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) (klon D3F9, 1/1000), p38MAPK (# 9212, fortynding 1/1000), FAK (# 3285, fortynding 1 /1000), phospho-Akt (Ser473) (klon D9E, 1/1000), Akt (klon C67E7, fortynding 1/1000), cyclin D1 (klon DCS6, fortynding 1/500), EGFR (# 2232, fortynding 1 /500), alle fra Cell Signaling Technology, USA; ErbB-3 (klon C-17, 1/500), ErbB-4 (klon C-18, fortynding 1/500), MMP2 (klon H-76, fortynding 1/500), MMP9 (klon 6-6b, fortynding 1/500), Bd-xL (klon H-5, fortynding 1/500), Bax (klon N-20, fortynding 1/500), MUC4 (8G7, fortynding 1/500) alle fra Santa Cruz Biotechnology, USA; MUC1 (M8, generøse gave fra Dr. D. Swallow, London), eller β-actin (A5441, fortynding 1/5000) fra Sigma, Frankrig. Antistoffer blev fortyndet i Tris-saltvand indeholdende 5% (vægt /volumen) fedtfrit tørmælk og Tween-20 (TBS-T), undtagen for MUC4 og β-actin og inkuberet natten over ved 4 ° C før behandling med immunfarvning. Peroxidasekonjugerede sekundære antistoffer (Sigma) blev anvendt, og immunreaktive bånd blev visualiseret under anvendelse af West Pico kemoluminescerende substrat (Perbio, Brebieres, Frankrig). Chemo-luminescens blev visualiseret ved hjælp LAS4000 apparat (Fujifilm) og resultaterne blev integreret med Gel analytiker Software® (Claravision). De viste data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Co-immunfældning af MUC4-ErbB2 kompleks

150 ug Capan-2 cellulære ekstrakt blev inkuberet natten over med 1,5 ug anti-ErbB2-antistoffet (Kanin polyklonale, Ab-1, Thermo Scientific). Protein A blev kovalent bundet til tværbundne 4% agaroseperler (Sigma, Frankrig), ækvilibreret med 1 × bindingspuffer (200 mM Tris-HCl pH 7,5 indeholdende 1 M NaCl, 20 mM EDTA og 2% NP40 (v /v)) og tilsat til lysatet-antistof blanding og inkuberet på en roterende platform i 2 timer ved 4 ° C. Perlerne blev derefter vasket tre gange med 1 × bindingspuffer. Kanin IgG’er (Millipore) blev anvendt som en negativ kontrol. Vaskede perler blev derefter blandet med 2 x SDS-gel loading buffer inden elektroforese på en 2% (vægt /volumen) agarosegel og immunoblotting som beskrevet tidligere [23].

Konstruktion af GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2-fusionsprotein

cDNA, der koder MUC4

EGF3 + 1 + 2-sekvensen blev amplificeret ved PCR under anvendelse af et FLAG-epitop-mærket version af MUC4β underenhed [16] kaldet MUC4F2-CF2 som skabelon og F_EGF3 (5′-CGCGGATCCGCCTGTGAGGAGCCG-3 ‘) og R_EGF1 (5′-TCCCCCGGG TCAGAAGCAGCGGCTGTC-3’) som primere. PCR-produktet koder MUC4

EGF3 + 1 + 2 blev fordøjet af

BamHI

Smal

og indsat i pGEX-4T1 (GE Lifesciences). Den pGEX-4T1-GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 konstrukt blev derefter transficeret i B834pLysS

E. coli

(Novagen) ved hjælp af elektroporation og

E. coli

blev dyrket i Luria Bertani-medium (Invitrogen) til en OD

600 på 0,8. GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2-fusionsprotein-ekspression blev derefter induceret ved tilsætning af 1 mM isopropylthiogalactopyranosyl (Ambion) ved 15 ° C natten over. Cellerne blev høstet ved centrifugering ved 3800 x g ved 4 ° C, resuspenderet i 60 ml lysisbuffer (1 × PBS, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% (volumen /volumen) Triton X /100) og lyseret ved lydbehandling (Branson Sonifier 250). Efter centrifugering (20 000 x g, 90 min, 4 ° C) blev supernatanten udvindes, og GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 blev separeret fra hel-cellelysat under anvendelse glutathionagaroseperler (Qiagen). Efter vask perler med lyseringsbuffer, GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 fusionsproteinet blev elueret med 40 mM reduceret glutathion i en 50 mM Tris-HCI pH 8,0 buffer indeholdende 150 mM NaCl, 0,1% (vol /vol) Triton X /100 og 1 mM DTT. Protein renhed blev bestemt ved Coomassie blåfarvning efter en 12% SDS-PAGE. Det oprensede protein blev dialyseret mod 1 × bindingsbuffer og opbevaret ved 4 ° C indtil anvendelse.

GST pull-down

GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 blev sat på ækvilibrerede glutathionperler (Qiagen,) som beskrevet af producenten. Efter natten over binding ved 4 ° C i nærvær af det humane rekombinante ErbB2 protein (5 ug, R 5) med statistisk signifikans (P 0,05) blev sorteret ved hjælp asymptotisk P-værdi beregning. Alle data er MIAME kompatibel. Den rå data er blevet deponeret i Gene Expression Omnibus (GEO, tiltrædelse nummer: GSE31322).

QRT-PCR

I alt RNA fra bugspytkirtelkræftceller blev fremstillet ved anvendelse NucleoSpin® RNA II kit ( Macherey Nagel) efter fabrikantens protokol. cDNA’er blev fremstillet som tidligere beskrevet [27]. PCR blev udført under anvendelse SsoFast ™ Evagreen Supermix kit efter fabrikantens protokol under anvendelse af CFX96 real time PCR-system (Biorad). Primer oplysninger er givet i tabel S1.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Graphpad Prism 4.0 software (Graphpad programmel Inc., La Jolla, USA). Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Forskelle i gennemsnit af to prøver blev analyseret af den studerendes

t

test eller en måde ANOVA test med udvalgte sammenligning hjælp Tukeys HSD post-hoc test forskelle mindre end 0,05 anses for væsentlig, og blev markeret med en *. ** Angiver p 0,01, *** angiver p 0,001. Forskelle i uforudsete blev analyseret ved hjælp af Chi square test.

Resultater

MUC4 og ErbB2 fysisk interagerer i Capan-2 bugspytkirtelkræftceller

Immunopræcipitation af Capan-2 cellulære ekstrakt med anti-ErbB2-antistoffet blev udført før immunoblotting med anti-MUC4 antistof. MUC4 immunfarvning indikerer, at MUC4 co-immunpræcipiteret med ErbB2 i Capan-2-celler (figur 1A, bane 1). Specificitet af interaktionen blev vurderet ved anvendelse irrelevante kanin IgG’er, der viste nogen immunopræcipiteret bånd (bane 2). For at vise en direkte fysisk interaktion mellem MUC4 og ErbB2, vi først foretaget en GST pull-down assay. Til det, vi foretaget en GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2-fusionsprotein, som indeholder de tre EGF-lignende domæner af MUC4. Vi forberedt derefter to affinitetssøjler bærer enten GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2-fusionsprotein eller alene GST på hvilken rekombinant human ErbB2 blev indlæst. Efter affinitetskromatografi viste anti-ErbB2 immunoblot et ErbB2 specifikt bånd for glutathionperler kolonnen bærer GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2-fusionsprotein (figur 1B, bane 1). Der blev ikke observeret nogen bånd til glutathion kolonnen bærende GST alene (bane 2).

(A) Co-immunfældning af 150 ug Capan-2 cellulære ekstrakt med anti-ErbB2-antistof (bane 1) eller kanin IgG’er ( bane 2). Capan-2 celleekstrakt alene (bane 3). (B) ErbB2 immunoblot af GST pull-down af rekombinant humant ErbB2 protein med GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 glutathionperler (bane 1) eller GST glutathionperler (bane 2). Rekombinant ErbB2 alene (bane 3). (C)

In situ

nærhed ligand assay på Capan-2 celler. MUC4 og ErbB2 komplekser (røde prikker) er angivet med en pil. Kerner blev farvet ved anvendelse DAPI. Kontrolforsøg blev udført i fravær af primært antistof. (D) Immunofluorescens påvisning af MUC4 (rød) og ErbB2 (grøn) ved konfokal mikroskopi viste co-lokalisering af de to proteiner (gul). (E) Angivelse af MUC4 og ErbB2 i to repræsentative kloner af MUC4-KD og ErbB2-KD-celler og deres respektive kontroller (Mock og NT) ved Western blotting.

Samspil mellem MUC4 og ErbB2 blev derefter bekræftet at bruge en anden tilgang, der er

i situ

nærhed ligeringsfremgangsmåder analyser (PLA). Resultaterne indikerer, at MUC4 og ErbB2 danner en endogen kompleks i Capan-2-celler (røde prikker, pile, figur 1C). Endelig konfokal mikroskopi studier bekræftede co-lokalisering af MUC4 og ErbB2 i Capan-2-celler (figur 1D). Tilsammen indikerer disse resultater, at MUC4 og ErbB2 fysisk interagerer i Capan-2 bugspytkirtelkræftceller

via

MUC4

EGF3 + 1 + 2-region, der indeholder de tre EGF-lignende domæner. Vi derefter forpligtede sig til at identificere de cellulære mekanismer og de intracellulære signalveje under kontrol af begge parter.

Generation og karakterisering af stabile ErbB2-KD og MUC4-KD cellulære kloner

De fem ErbB2- KD og syv MUC4-KD cellulære kloner viste henholdsvis næsten fuldstændig eller fuldstændig inhibering af ErbB2 og MUC4 ekspression sammenlignet med kontrol kloner (figur 1E). Western blot analyse af en anden membranbundne mucin, der er vigtig i cancer, MUC1, indikeret, at inhibering af MUC4 dramatisk nedsat, at af MUC1 henviser inhibering af ErbB2 havde ingen virkning (fig S1). Når vi kiggede på ekspressionen af ​​de tre andre medlemmer af ErbB-receptor familien, hæmning af MUC4 eller ErbB2 udtryk førte til en kraftig nedgang i ErbB2 og ErbB3 (MUC4-KD) og ErbB3 (ErbB2-KD), henholdsvis, mens der ikke effekt blev opdaget for ErbB1 og ErbB4 (figur S1).

rolle ErbB2 og MUC4 på celledeling og apoptose

MUC4-KD celler viste en nedsat proliferation fra 48 h, der blev opretholdt ved 72 h og blev signifikant ved 96 h (44% mindre end Mock celler, p 0,05). ErbB2-KD-celler var også mindre proliferativ med en signifikant reduktion på 27% ved 96 timer (p 0,05) (figur 2A). En stærk standsning af cellecyklus i G1-fasen (54,5% ± 0,13) blev observeret i MUC4-KD-celler sammenlignet med Mock celler (37,4% ± 7,2, *, p = 0,016) (figur 2B). Desuden G2M fase var meget kortere i MUC4-KD-celler (20,9% ± 4,7) sammenlignet med Mock kontrolceller (39,6% ± 6,7, **, p = 0,0035) (samlet *, p = 0,0102). I ErbB2-KD-celler, en tendens til en standsning af cellecyklus i G1 forekom også der forblev statistisk ikke-signifikant (p = 0,119) (figur 2B). For at identificere de mekanismer, der er ansvarlige for denne ændring i proliferation, blev ekspressionen af ​​cellecyklus markører evalueret ved Western blot (Figur 2C). Det er klart, nedsat proliferation i MUC4-KD-celler var associeret med undertrykkelse af cyclin D1. I ErbB2-KD-celler, blev nedsat proliferation associeret med både forøget ekspression af p27

kip1 cellecyklusinhibitor og fald i cyclin D1 (figur 2D), hvilket antyder en cellulær standsning ved G1 /S proliferation checkpoint.

(A) Cellevækst blev bestemt ved celletælling ved 24, 48, 72 og 96 timer for Capan-2 MUC4-KD eller ErbB2-KD og deres respektive kontroller (Mock og NT). * = P 0,05 hjælp studerende

t

-test. (B) cellecyklusfordeling profiler af MUC4-KD, ErbB2-KD og deres kontrol kloner (Mock og NT) ved flowcytometri efter inkubation med propidium iodure. Værdierne er udtrykt som middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg. * = P 0,05 under anvendelse Chi square test. ns = ikke signifikant. (C) Effekt af MUC4 eller ErbB2 lyddæmpning blev analyseret på cellecyklus markør cyclin D1 og p27

kip1 ved western blot. β-actin blev målt som den interne kontrol. (D) Bånd blev kvantificeret ved densitometri. Histogrammer af forholdet (cyklin D1 eller p27

kip1 /β-actin) er vist. (E)% af subG1 population af MUC4-KD, ErbB2-KD og kontroller (Mock og NT henholdsvis) blev bestemt ved flowcytometri efter inkubation med propidium iodure (* = p 0,05). (F) Western blot blev udført for kløvet caspase 3, Bcl

XL og Bax i MUC4-KD, ErbB2-KD og deres respektive kontroller (Mock og NT). β-actin blev bedømt som en indre kontrol. (G) Migration egenskaber MUC4-KD, ErbB2-KD og kontrol kloner (Mock og NT) blev vurderet ved anvendelse Boyden kamre. Resultaterne er udtrykt som gennemsnit vandrende celle nummer pr vision felt (*** = P 0,001, ns = ikke-signifikant). (H)% af invasion (invasive celler /migrerende celler) blev bestemt ved hjælp af Boyden kamre belagt med Matrigel®.

For at vurdere, om MUC4 eller ErbB2 hæmning også kan påvirke apoptose, måling af apoptotisk cellepopulation ( subG1 celler) ved flowcytometri blev udført (fig 2E). Resultaterne viste en signifikant stigning i subG1 population (13,33% ± 2,1) i ErbB2-KD-celler sammenlignet med NT kontrol kloner (6,2% ± 0,4) (*, p = 0,017). I MUC4-KD-celler, observeredes ingen forskelle i subG1 cellepopulation sammenlignet med Mock kontrol kloner (ns, p = 0,19). Ekspression af apoptotiske markører ved immunoblotting viste, at Bax og Bcl

XL blev ikke ændret i begge MUC4-KD og ErbB2-KD-celler henviser blev observeret stigning af spaltet caspase-3 i ErbB2-KD-celler (figur 2F).

rolle MUC4 og ErbB2 i celle migration /invasion /vedhæftning

for at vurdere hvilken rolle MUC4 og ErbB2 i celle migration /invasion blev eksperimenter udført i Boyden kamre uden eller med Matrigel® belægning, henholdsvis . Resultaterne viste, at et betydeligt lavere antal migrerende celler blev observeret i MUC4-KD-celler (37,8 ± 1,5) sammenlignet med Mock celler (60,1 ± 3,3) (p≤0.001) hvorimod ingen signifikant forskel blev fundet i ErbB2-KD-celler (53,5 ± 8,8) sammenlignet med NT kontrol kloner (56,2 ± 6,3) (Figur 2G). Da vi målte invasionsevne, MUC4-KD-celler forekom signifikant mere invasive (41,8% ± 1,5, n = 7) end celler, der udtrykker MUC4 (mock) (19,5% ± 1,5, n = 5) (p = 0,029) (figur 2H). ErbB2-KD-kloner, på den anden side, var lidt mindre invasive (9,4% ± 1,15) end celler, der udtrykker ErbB2 (NT, 14,14% ± 2,1), men dette fald var ikke signifikant (p = 0,09). Evnen hos MUC4-KD og ErbB2-KD-celler til at klæbe på Matrigel® (fremstillet af to komponenter i pancreas ekstracellulære matrix collagen IV og laminin) eller kollagen I blev også vurderet, men ingen signifikante forskelle blev fundet for enten celler (ikke vist) .

rolle ErbB2 og MUC4 i intracellulær signalering

virkningen af ​​ErbB2 eller MUC4 på de store veje for intracellulær signalering blev undersøgt ved Western blotting til: MAPK’er (p42 /44, p38 og JNK ), Akt, og fokal adhæsionkinase (FAK) (figur 3 og figur S2). Phosphorylering af p42 /p44 MAPK blev totalt afskaffet i ErbB2-KD-celler sammenlignet med NT kontrol kloner, hvilket indikerer fuldstændig inhibering af denne vej efter ErbB2 silencing. I MUC4-KD-celler sammenlignet med mock-kloner, konstitutive p42 /p44 MAPK faldt mens phosphoryleret p42 /44 steg antyder en aktivering af MAPK-vejen knyttet til MUC4 undertrykkelse.

(A) Western blot analyser blev udført på cytosolisk ekstrakt af MUC4-KD, ErbB2-KD og kontroller (Mock og NT henholdsvis) til ekspression af både phosphorylerede og konstitutive former af p42 /p44, JNK og p38 MAPK. β-actin blev anvendt som intern kontrol. To repræsentative kloner er vist. (B) Bånd blev kvantificeret ved densitometri. Histogrammer af forholdet (phosphorylerede /konstitutive form) til P42 /P44, JNK og p38 MAPK kinaser vises.

Når vi kiggede på JNK, blev der observeret en total undertrykkelse af JNK fosforylering i MUC4 -KD kloner sammenlignet med Mock kontroller tyder på, at MUC4 ekspression dramatisk indvirkning JNK aktivitet. Ingen virkning på JNK-vejen blev observeret i ErbB2-KD-kloner. p38 MAPK-vejen syntes ikke at ændres væsentligt efter enten ErbB2 eller MUC4 silencing (figur 3). Ligeledes blev Akt og FAK pathways ikke ændret signifikant (figur S2).

Alt i alt viser disse resultater, at tab af MUC4 og ErbB2 dramatisk svækker JNK- og p42 /44 MAPK signalveje henholdsvis.

effekt af ErbB2 og MUC4 på tumor egenskaber

in vivo

for at bekræfte

in vitro

data fra MUC4 og ErbB2 virkninger på tumor celle egenskaber, SC xenografundersøgelser blev udført . Resultaterne indikerer, at tumorvolumen var signifikant lavere i xenotransplanterede mus med M4-2-1 eller M4-2-10 kloner på dag 22 (figur 4A), hvor fravær af MUC4 blev bekræftet ved IHC (figur 4B). Reduktion af ErbB2-ekspression tidligere vist

in vitro

ved Western blotting blev også bekræftet

in vivo

i MUC4-KD tumorer ved IHC (figur 4B).