PLoS ONE: En Regulatory MDM4 Genetisk Variant Lokalisering i bindingen Sekvens af flere MikroRNA’er Bidrager til følsomhed over småcellet lungekræft

Abstrakt

En funktionel rs4245739 A C single (SNP) lokalisering i

MDM4

3′-uoversatte (3′-UTR) region skaber en miR-191-5p eller miR-887-3p målretning sites. Denne ændring resulterer i nedsat udtryk for onkogen

MDM4

. Derfor undersøgte vi sammenhængen mellem denne SNP og (SCLC) risiko småcellet lungekræft samt dens regulerende funktion i SCLC celler. Genotyper blev bestemt i to uafhængige case-kontrol sæt bestod af 520SCLC tilfælde og 1040 kontroller fra to regioner i Kina. Odds ratio (OR) og 95% konfidensintervaller (CIS) blev estimeret ved logistisk regression. Virkningen af ​​rs4245739 SNP på miR-191-5p /miR-887-3p medieret

MDM4

udtryk forordning blev undersøgt ved hjælp af luciferase reportergenassays. Vi fandt, at

MDM4

rs4245739AC og CC genotyper væsentligt blev forbundet med nedsat SCLC følsomhed i forhold til AA-genotypen i både case-kontrol-apparater (Shandong sæt: OR = 0,53, 95% CI = 0,32-0,89,

P

= 0,014; Jiangsu sæt: OR = 0,47, 95% CI = ,26-,879,

P

= 0,017). Stratificerede analyser viste, at der var en signifikant multiplikativ samspil mellem rs4245739 og rygning (

P

interactioin = 0,048). Efter co-transfektion af miRNA og forskellige allelic-

MDM4

reporter konstruerer i SCLC celler, fandt vi, at både miR-191-5p og miR-887-3p kan føre til faldt betydeligt

MDM4

udtryk aktiviteter i konstruktionen med C-allel 3′-UTR, men ikke a-allel 3′-UTR, hvilket tyder på en konsekvent genotype-fænotype korrelation. Vores data belyse, at

MDM4

rs4245739SNP bidrager til SCLC risiko og støtter den opfattelse, at gen 3′-UTR genetiske varianter, påvirker miRNA-bindende, kan ændre SCLC modtagelighed

Henvisning:. Gao F , Xiong X, Pan W, Yang X, Zhou C, Yuan Q, et al. (2015) En Regulatory

MDM4

Genetisk Variant Lokalisering i bindingen Sekvens af flere MikroRNA’er Bidrager til følsomhed over småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (8): e0135647. doi: 10,1371 /journal.pone.0135647

Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Soochow University, KINA

Modtaget: Marts 18, 2015; Accepteret: Juli 24, 2015; Udgivet: 14 August, 2015

Copyright: © 2015 Gao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China. (tilskud numre: 31.271.382 81.201.586; URL: https://www.nsfc.gov.cn/) ; National High-Tech Research and Development Program Kina (tilskud numre: 2015AA020950; URL: https://www.most.gov.cn/); grundforskning Midler til de centraleuropæiske universiteter (tilskud numre: YS1407, URL: https://www.moe.edu.cn/); Beijing Higher Education Young Elite Teacher Project (tilskud numre: YETP0521; URL: https://www.bjedu.gov.cn/); og Program for Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University (tilskud numre: IRT13045; URL: https://www.moe.edu.cn/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er de førende årsager til kræft dødsfald i verden, med flere than1,000,000 dødsfald om året [1]. Lungekræft almindeligvis klassificeret som småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC). Selvom der tegner sig for kun cirka tyve procent af alle tilfælde af lungekræft, SCLC er meget mere aggressiv i forhold til NSCLC [2,3]. Som en malignitet med dårlig prognose, SCLC viser høj vækst fraktion, hurtig fordobling tid, og tidlig udvikling af udbredte metastaser [2,3]. Når diagnosticeret, de fleste SCLC patienter har metastaser og dårlig prognose, hvis venstre ubehandlet [3]. Akkumulerede epidemiologiske beviser tyder på, at tunge tobaksrygning er en vigtig miljømæssig risiko-faktor på denne sygdom [2,3]. Seneste skrider på genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS) har afsløret, at flere nye genetiske variationer er associeret med lungekræft modtagelighed [4-12]. Men de fleste undersøgelser undersøgte både lungekræft undertyper eller kun fokuseret på NSCLC. Interessant, at flertallet af identificerede risikofaktorer loci ikke signifikant indflydelse på risikoen for lungekræft forskelligt ved histologi, hvilket indikerer, at der kan være forskellige genetiske makeup konsekvenser risiko for SCLC eller NSCLC [4-12]. Derfor opdagelsen af ​​nye SCLC-risiko-associerede SNPs kan være en potentielt værdifuld vej mod lysende ætiologi SCLC.

MDM4, også kendt som MDMX eller HDMX, er et strukturelt homologt protein af MDM2. MDM4 deler en NH

2-terminale P53-bindende domæne med MDM2 og kan inhibere aktiviteterne af p53 i forskellige maligniteter [13-17]. Som vogter af humane genom, at P53 funktioner i centrum af et komplekst molekylær netværk mægle tumor undertrykkelse. Som en velkendt onkogen, overudtrykt MDM4 i humane tumorer, herunder lungekræft førte til deprimerede P53 aktiviteter og dermed tumorigenese. I tråd med dette, musemodel med overudtrykt MDM4 via transgene teknologi viste spontan carcinogenese under deres levetid [18].

Der er en

MDM4

3′-untranslatedregion (3′-UTR) rs4245739A C SNP lokalisering i målbindingsstedet til to miRNA (mIR-191-5p og miR-887-3p) [19,20]. miR-191-5p og miR-887-3p selektivt kunne binde til

MDM4

3′-UTR med rs4245739C allelen, men ikke 3′-UTR med A-allelen. Denne allel miRNA ‘bindende fører til forhøjede ekspressionsniveauer af

MDM4

mRNA og /eller protein blandt rs4245739A allel luftfartsselskaber med kræft [19-22]. To GWAS viste, at

MDM4

rs4245739 A-allelen er signifikant forbundet med øget risiko for både prostatakræft og brystkræft [23,24]. Flere case-control studier bruger kandidat gen strategi bekræftede også den positive sammenhæng mellem denne polymorfi og modtagelighed i æggestokkene, brystkræft, esophageal planocellulært karcinom og non-Hodgkins lymfom i forskellige etniske befolkningsgrupper [20,22,25,26]. Men er stadig stort set ukendt inddragelse af denne funktionelle SNP i SCLC. I betragtning af den afgørende rolle MDM4 i carcinogenese, vi hypotese, at den

MDM4

rs4245739 SNP kan bidrage til SCLC modtagelighed via allel regulering ofmiR-191-5p og /eller miR-887-3p bindende affinitet og dermed MDM4 udtryk. I den aktuelle undersøgelse, vi gennemførte et to-trins case-kontrol undersøgelse af SCLC rekrutteret fra Jinan byen (Shandong-provinsen, Kina) og Huaian byen (Jiangsu-provinsen, Kina). Endvidere at validere den biologiske funktion af denne polymorfi, vi undersøgte allel regulering af miR-191-5p og miR-887-3p på MDM4 i SCLC celler.

Materialer og metoder

Study fag

Denne undersøgelse bestod af to case-kontrol sæt: (i) Shandong case-kontrol sæt: 320 SCLC patienter fra Shandong Cancer Hospital, Shandong Academy of Medical Sciences (Jinan, Shandong-provinsen, Kina) og køns- og alder-matchede (± 5 år) 640 kontroller. Patienterne blev rekrutteret mellem juni 2009 og november 2014 Shandong Cancer Hospital. Kontrolpersoner blev tilfældigt udvalgt fra en pulje på 4500 personer fra et fællesskab kræft-screening program for tidlig påvisning af kræft gennemført i Jinan byen som beskrevet i detaljer tidligere [22]. (Ii) Jiangsu case-kontrol sæt: 200 SCLC patienter fra Huaian No. 2 Hospital (Huaian, Jiangsu-provinsen, Kina) og køns- og aldersmatchede 400 kontroller. Patienterne blev konsekutivt rekrutteret mellem januar 2009 og januar 2015 Huaian No. 2 Hospital. Controls var kræft-fri individer udvalgt fra et fællesskab kræft-screening-programmet (3600 personer) til tidlig påvisning af kræft gennemført i Huai’an byen som beskrevet i detaljer tidligere [22]. Personer, der røget en cigaret om dagen i over 1 år, blev anset for rygere [22]. Alle emner var ubeslægtede etniske han-kinesere. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Boards of Huaian No. 2 Hospital og Shandong Cancer Hospital, Shandong Academy of Medical Sciences. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver genstand ved rekruttering

SNP genotypning

PCR-baseret restriktionsfragment (RFLP) blev anvendt til at bestemme

MDM4

rs4245739A . C genotyper som beskrevet detaljeret tidligere [22,25,26]. Kort fortalt primerne anvendt til amplificering af DNA-segmenter med rs4245739 stedet (mismatch basen er understreget) var 5′-AAGACTAAAGAAGGCTGGGG-3 ‘og 5′-TTCAAATAATGTGGTAAGTGACC-3’. Restriktionsenzymanalyse

Msp

I (New England Biolabs) blev anvendt til at fordøje PCR-produkterne og skelne rs4245739 genotyper. En stikprøve på 10% blev gensidigt undersøgt af anden person, og reproducerbarheden var 98,7%. Derudover blev en 5% stikprøver også testet via Sanger sekventering, og reproducerbarheden var 100%.

Plasmidkonstruktion

MDM4

rs4245739A og rs4245739C allele reporter-konstruktioner var udarbejdet ved at forstærke en del af

MDM4

3′-UTR region fra fag homozygote for rs4245739AA eller rs4245739CC genotype. PCR primere var som følger: 5′-AACTCTAGAGGTAGTACGAACATAAAAATGC-3 ‘og 5′-AACTCTAGACTGCATAAAGTAATCCATGG-3’, som omfatter

Xba

Jeg begrænsning (understreget sekvenser). PCR-produkterne blev fordøjet med

Xba

I (New England Biolabs) og ligeret henholdsvis i et hensigtsmæssigt spaltet pGL3-kontrolvektor (Promega). Konstruktionerne blev betegnet aspGL3-rs4245739A og pGL3b-rs4245739C hhv. Indsatsene blev bekræftet ved DNA-sekventering.

Dual luciferase reportergenassay

A ildflueluciferase reporterplasmidet (pGL3-kontrol, pGL3-rs4245739A eller pGL3-rs4245739C), et Renilla luciferase vektor (pRL -SV40, Promega) plus 30 nMsmall RNA’er (MIR-191-5p efterligner, MIR-887-3p efterligner eller negativ kontrol RNA) (Genepharma, Guangzhou, Kina) blev cotransficeret ind SCLCH446 celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Luciferaseaktivitet blev bestemt ved 48 timer efter transfektion under anvendelse af et luciferase-assay-systemet (Promega) som beskrevet tidligere [27-29]. Tre uafhængige transfektionsforsøg blev udført, og hver blev udført tre gange. Dobling blev beregnet ved at definere aktiviteten af ​​tomme pGL3-kontrol vektor som 1.

statistiske analyser

Som beskrevet i detaljer tidligere [22, 30-32], forskelle i demografiske variable og genotype fordelinger af

MDM4

rs4245739 SNP mellem SCLC cases og kontroller blev beregnet ved hjælp af Pearsons χ

2 test. Foreninger mellem

MDM4

rs4245739 genotyper og SCLC risiko blev estimeret ved odds ratio (OR) og deres 95% konfidensintervaller (CIS) beregnet ved hjælp af ubetinget logistisk regressionsmodel. Alle yderste periferi blev justeret for alder, køn og rygning status, hvor det var hensigtsmæssigt. Vi testede nulhypoteser af multiplikativ gen-kovariat interaktion og evalueret afgange fra multiplikative interaktion modeller ved at inkludere de vigtigste effekt variabler og deres produkt vilkår i den logistiske regressionsmodel [30-32]. En

P

værdi på mindre end 0,05 blev anvendt som kriterium for statistisk signifikans, og alle statistiske tests var tosidet. Alle analyser blev udført med SPSS softwarepakke (Version 16,0, SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultater

Allelle frekvenser og genotype fordelinger af

MDM4

rs4245739SNP

Den mediane alder var 57 år (spændvidde, 25-82 år for Shandong sæt, rækkevidde, 23-79 år for Jiangsu sæt) for patienter og 57 år (interval, 19-80 år for Shandong sæt; range, 20-81 år for Jiangsu sæt) for kontrollerne (Shandong sæt:

P

= 0,615; Jiangsu sæt:

P

= 1,000). Der var ingen signifikant forskel mellem cases og kontroller i sex distribution (Shandong sæt: 78,4% hanner incases vs. 76,4% i kontroller;

P

= 0,480; Jiangsu sæt: 74,0% hanner incases vs. 71,3% i kontrol

P

= 0,479). Dette indikerer, at frekvensen matching var passende (tabel 1). flere rygere blandt SCLC patienter blev imidlertid konstateret i Shandong case-kontrol sæt sammenlignet med kontrolpersoner (Shandong sæt: 77,8% vs. 34,2%,

P

0,001). Tilsvarende er der flere SCLC patienter, der ryger end kontrol i Jiangsu sæt (78,5% vs. 21,5%,

P

0,001). Derudover blev der observeret flere patienter med begrænset sygdom end blandt dem med omfattende sygdom i to sæt (Shandong sæt: 56,9% vs. 43,1%; Jiangsu sæt: 56,5% vs. 43,5%).

Som vist i tabel 2, frekvensen for

MDM4

rs4245739 C allel var 0,038 og 0.073among SCLC patienter og raske kontrolpersoner fra Shandong sæt, og 0,043 og 0,101 fra Jiangsu sæt. Alle observerede genotypefrekvenser i både SCLC og kontrolpersoner overensstemmelse med Hardy-Weinberg ligevægt. Udlodning af disse

MDM4

genotyper blev derefter sammenlignet blandt SCLC sager og kontroller. Hyppigheden af ​​

MDM4

rs4245739 AA og AC eller CC genotyper blandt patienter var signifikant forskellige fra dem blandt kontroller i Shandong sæt (χ

2 = 10,70,

P

= 0,005,

df

= 2) (tabel 2). Tilsvarende frekvenserne af

MDM4

rs4245739 AA og AC eller CC genotyper blandt sager var signifikant forskellige fra dem blandt kontrolpersoner i Jiangsu sæt (χ

2 = 12,84,

P

= 0,002 ,

df

= 2) (tabel 2).

associering mellem

MDM4

rs4245739SNP og SCLC risiko

Foreninger mellem genotyper af

MDM4

rs4245739 A C polymorfi og SCLC risiko blev beregnet ved hjælp ubetingede logistiske regressionsanalyser (tabel 2). Som vist i tabel 2,

MDM4

rs4245739 C allel fungerer som en beskyttende allel af SCLC. Forsøgspersoner med AC genotypen havde en OR på 0,52 (95% CI = 0,31-0,87,

P

= 0,013) for at udvikle SCLC, sammenlignet med emner med AA genotype. Faldt betydeligt SCLC risiko blev også observeret blandt rs4245739 AC eller CC luftfartsselskaber i forhold til AA luftfartsselskaber (OR = 0,53, 95% CI = 0,32-0,89,

P

= 0,014). De sammenslutninger af SCLC risiko med

MDM4

rs4245739SNP blev yderligere valideret i et uafhængigt Jiangsu case-kontrol sæt. En signifikant nedsat SCLC risiko var også forbundet med rs4245739 (AC: OR = 0,48, 95% CI = 0,26-0,88,

P

= 0,019, AC eller CC: OR = 0,47, 95% CI = 0,26-0,87 ,

P

= 0,017). I de poolede analyser, fandt vi, at rs4245739 AC genotypen havde en 0,49-folddecreased risiko for SCLC forhold til AA-genotypen (95% CI = 0,32-0,75,

P

= 0,001), og den rs4245739 AC eller CC genotype havde en 0,50-folddecreased risiko sammenlignet med AA-genotypen (95% CI = 0,32-0,76,

P

= 0,001) (tabel 2). Alle yderste periferi blev justeret for køn, alder og rygning status.

Vi undersøgte yderligere SCLC risiko forbundet med den

MDM4

rs4245739genotypes ved stratificering for alder, køn, rygning status og sygdom scenen ved hjælp af den poolede data fra to kinesiske case-kontrol sæt (tabel 3). I stratificeret analyser med alderen, blev rs4245739AC og CC genotyper signifikant forbundet med nedsat risiko hos forsøgspersoner i alderen 57 år eller yngre (OR = 0,40, 95% CI = 0,21-0,74,

P

= 0,003), men ikke i personer i alderen ældre end 57 år (OR = 0,63, 95% CI = 0,35-1,15,

P

= 0,134). Der var ingen signifikant gen-alder interaktion (

P

interaktion = 0,274). En signifikant nedsat risiko for SCLC var forbundet med AC og CC genotyper kun blandt kvinder (OR = 0,33, 95% CI = 0,15-0,74,

P

= 0,007), men ikke blandt mænd (OR = 0,63, 95 % CI = 0,38-1,06,

P

= 0,083) sammenlignet med

MDM4

rs4245739 AA genotype. Ingen signifikant gen-sex interaktion blev observeret (

P

interaktion = 0,135). Vi fandt ikke signifikant nedsat risiko (OR = 0,73, 95% CI = 0,42-1,28,

P

= 0,274) for de luftfartsselskaber med AC og CC genotyper i forhold til personer med AA genotypen hos rygere. Men thers4245739AC og CC genotyper gjorde vise et 0,30 gange nedsat risiko for at udvikle SCLC (95% CI = 0,14-0,64,

P

= 0,002) i forhold til AA-genotypen hos ikke-rygere. En multiplikativ gen-ryger interaktion eksisterede (

P

interactioin = 0,048). Foreninger mellem rs4245739 AC og CC genotyper og SCLC risiko blev observeret i både patienter med den begrænsede stadie sygdom (OR = 0,52, 95% CI = 0,32-0,84,

P

= 0,008) eller omfattende fase sygdom (OR = 0,48, 95% CI = 0,24 til 0,97,

P

= 0,040) (tabel 3).

Funktionel relevans ofrs4245739 om miRNA-medieret

MDM4

regulering

SNPrs4245739A C kunne føre til højere affinitet mellem miR-191-5p /miR-887-3p og

MDM4

mRNA og faldt

MDM4

udtryk i flere maligniteter [19 -22]. Men dens virkninger på

MDM4

regulering i SCLC er stadig uklart. Som et resultat, vi undersøgt, om der er en allel-specifik effekt af rs4245739polymorphismon

MDM4

udtryk i SCLC celler ved miR-191-5p og miR-887-3p. Relative Luciferaseekspression analyser viste, at miR-191-5p kan signifikante lavere luciferaseaktiviteter i SCLC H446 celler transficeret med rs4245739C allele reporterkonstruktioner forhold til negativ kontrol RNA (

P

= 0,003) (Fig 1). Tilsvarende miR-887-3p regulerer også

MDM4

3′-UTR region med væsentligt lavere luciferaseaktiviteter i H446 celler, der udtrykker rs4245739C allele konstruktioner i forhold til negativ kontrol RNA (

P

= 0,014) ( fig 1). Der var imidlertid ikke en sådan depression i H446 celler med transfektion af rs4245739A allel reporter konstruerer af begge miRNA efterligner (Fig 1).

H446 celler blev cotransficeret med pRL-SV40 at standardisere transfektion effektivitet. Fold stigning blev målt ved at definere aktiviteten af ​​celler co-transficeret med både pGL3-rs4245739A eller pGL3-rs4245739Creporter konstruere og NC-RNA’er som 1. Alle forsøg blev udført in triplo i hvert fald i tre uafhængige transfektionsforsøg og hver værdi repræsenterer middelværdi ± SD . *

P

0.05compared med hver af de luciferase konstruktion af

t

-tests. NC-RNA, negativ kontrol RNA; SCLC, småcellet lungekræft.

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi sammenhængen mellem

MDM4

rs4245739 funktionel SNP og SCLC risiko via en sag -styring tilgang. Vi observerede, at personer med

MDM4

rs4245739 AC eller CC genotyper viser faldt betydeligt SCLC risiko sammenlignet med AA genotype luftfartsselskaber. For at afsløre miR-191-5p /miR-887-3p medieret allel-regulering af denne SNP, undersøgte vi luciferaseaktiviteter i SCLC celler transficeret med forskellige allel reporter-konstruktioner. Genotype-fænotype korrelation analyser indikerer, at begge miRNA kunne hæmme

MDM4

udtryk kun i SCLC celler med C-allel konstruktioner udtryk, men ikke A-allel konstruktioner. Disse resultater fremhæve inddragelse af funktionelle genetiske varianter i miRNA-bindingssteder i SCLC ætiologi.

Akkumuleret beviser vist, at genetiske makeup kan have direkte bidrag til SCLC risiko [33-35]. Interessant henvisning til databaserne for genekspression profil til at identificere gener, der er dereguleret i SCLC og deres SNP’er i 3′-UTR, Xiong et al identificeret en SCLC modtagelighed SNP rs3134615 G T kan inhibere interaktionen af ​​MIR-1827 med

MYCL1

3′-UTR, hvilket resulterer i højere konstitutiv ekspression af MYCL1 [35]. I overensstemmelse med dette begreb, vi fandt også en

MDM4

3′-UTR SNP ramt af miRNA er forbundet med SCLC modtagelighed.

MDM4

rs4245739 polymorfi viste en konsistent sammenhæng med SCLC risiko intwo uafhængige case-control-apparater, som sandsynligvis ikke vil kunne tilskrives ukendte forstyrrende faktorer som følge af at have signifikant øget ulige forhold med små

P

værdier. Derudover genotypen-fænotype forhold mellem rs4245739 polymorfi og reportergenekspression understøtter vores konklusion. Desuden

MDM4

rs4245739 SNP kan være en fælles genetisk risiko komponent til forskellige kræftformer, som er blevet bevist af vores gruppe og andre via enten kandidat gen tilgang eller GWAS [19-26]. For eksempel, vi tidligere fundet, at rs4245739 AC og CC genotyper var signifikant forbundet med nedsat risiko for kræft i spiserøret [22], en malignitet med tilsvarende miljømæssige ætiologi SCLC (dvs. tunge rygning). Dog kan der være flere begrænsninger i den aktuelle case-kontrol undersøgelse. For eksempel, da alle SCLC sager blev rekrutteret fra hospitalet, kan iboende selektionsbias eksisterer. Derfor, for at resultaterne af vores undersøgelse warrant valideret i en populationsbaseret prospektiv undersøgelse i fremtiden. Relativt lille stikprøve af ikke-rygere bør analyseres yderligere i en større population.

Sammenfattende vores resultater antydede, at funktionel

MDM4

rs4245739 SNP var forbundet med en signifikant nedsat SCLC risiko i kinesisk Han populationer. Foreningerne mellem SNPs og SCLC risiko er bemærkelsesværdige i ikke-rygere. I betragtning af dette faktum, er der behov for en yderligere indsats for at undersøge, om

MDM4

rs4245739 genetisk polymorfi kan bruges som en potentiel diagnostisk markør for SCLC.