PLoS ONE: Afvigende Hypermethylering af SALL3 med HPV Involvering Bidrager til Carcinogenese af Livmoderhalskræft Cancer

Abstrakt

Målsætning

Denne undersøgelse havde til formål at undersøge status methylering af promotor-regionen i Spalt-lignende transskription faktor 3 (

SALL3

) og udtryk for

SALL3

i livmoderhalskræft at udforske funktionen af ​​dette gen i livmoderhalskræft carcinogenese.

Metoder

status methylering af

SALL3

blev opdaget af methylering-specifikke PCR, og

SALL3

genekspression blev vurderet ved real-time kvantitativ PCR i livmoderhalskræft cellelinjer, SiHa, HeLa og C33A samt i livmoderhalskræft vævsprøver (n = 23), matchet pericarcinomatous vævsprøver (n = 23) og normale cervix vævsprøver (n = 17). MTT blev brugt til at måle cellernes levedygtighed og spredning kapacitet SiHa og HeLa-celler.

Resultater

SALL3

promotor var helt methyleret i SiHa celler, umethyleret i C33A celler og delvist methyleret i HeLa-celler. Efter behandling af SiHa og HeLa-celler med 5 uM og 10 uM 5-azacytidin (5-Aza) henholdsvis methylering af den

SALL3

promotor faldt og observerede stigning i graden af ​​unmethylation i en dosis -afhængig måde. Desuden den relative ekspression af

SALL3

mRNA steget som koncentrationen af ​​5-Aza steg i SiHa (

s

0,05) og HeLa (

s

0,05 ) celler. Denne ovennævnte stigning i

SALL3

mRNA i SiHa celler var mere bemærkelsesværdigt end hos HeLa-celler. Cell spredning kapacitet faldt også efter administration af 5-Aza til SiHa og HeLa-celler (

s

0,05). Methylering af

SALL3

promotor blev observeret i 15 ud af 23 (65,21%) livmoderhalskræft vævsprøver, 15 af 23 (65,21%) matchede pericarcinomatous vævsprøver og 5 af 17 (29,41%) normale cervikale vævsprøver (

s

0,05).

SALL3

mRNA-ekspressionen var signifikant lavere i livmoderhalskræft og pericarcinomatous væv sammenlignet med normale cervikale væv (

s

0,05). I alle livmoderhalsen vævsprøver blev HPV-infektion positivt forbundet med hypermethylering af promotor-regionen i

SALL3 Hotel (

s

0,05, r = 0,408), og udtryk for

SALL3

mRNA i HPV-positive væv var lavere end i HPV-negative væv (

s

0,05).

Konklusion

afvigende hypermethylering af

SALL3

sammen med HPV involvering inaktiveret sin funktion som en tumor suppressor og bidrog til carcinogenese i livmoderhalskræft

Henvisning:. Wei X, Zhang S, Cao D, Zhao M, Zhang Q, Zhao J, et al. (2015) Afvigende Hypermethylering af SALL3 med HPV Involvering Bidrager til Carcinogenese af livmoderhalskræft. PLoS ONE 10 (12): e0145700. doi: 10,1371 /journal.pone.0145700

Redaktør: Xuefeng Liu, Georgetown University, UNITED STATES

Modtaget: 9. juni 2015; Accepteret: December 6, 2015; Udgivet: 23 December, 2015

Copyright: © 2015 Wei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle data underliggende resultaterne i vores undersøgelse er frit tilgængelige i papiret og dets støtte Information fil

Finansiering:.. Denne forskning blev understøttet af en National Natural Science Foundation of China (nr 81.472.428)

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

livmoderhalskræft rangerer som den næststørste årsag til kønsorganerne kræft dødelighed blandt kvinder i hele verden, og resultater i cirka 266.000 dødsfald. hvert år i henhold til den seneste National Comprehensive Cancer retningslinjer (2015 udgave) [1] .over 99% af tilfældene er forbundet med infektion i kønsdelene med humane papillomavirus (HPV’er), der er blevet identificeret i ætiologien af ​​cervikal Network (NCCN) kræft og har inficeret omkring 660 mio mennesker [2]; imidlertid prævalensen af ​​HPV-infektion er stadig utilstrækkelig til at redegøre for alle tilfælde af cervikal carcinogenese. I de sidste par år, epigenetiske mekanismer, især DNA methylering, er dukket op og har efterfølgende givet nye indsigter i forekomsten af ​​tumorer [3, 4]. Ikke desto mindre, forskere fortsætte med at udforske mekanismerne i carcinogenese og udvikling af kræft i genomforskning.

Spalt-lignende transkriptionsfaktor 3 (

SALL3

) er medlem af

SAL

familie og ligger på 18q23.

SALL3

koder en sal-lignende C

2H

2-typen zink-finger protein. Mutationer i nogle af disse gener er forbundet med medfødte lidelser hos mennesker, hvilket indikerer deres betydning i fosterudviklingen [5-7]. Shikauchi

et al

[8] fandt, at

SALL3

blev stille ved DNA methylering og at proteinet produkt af dette gen (SALL3) direkte interagerer med PWWP domæne DNMT3A i human hepatocellulært carcinom ( HCC), som foreslog, at

SALL3

fungerer som en tumor suppressor i HCC. Kærlighed

et al

[9] sekventeret de exomes af 59 Burkitt lymfom tumorer, og resultaterne viste for første gang, at

SALL3

blev gentagne gange muteret i Burkitt lymfomer. Desuden i CD133 (+) kolorektal cancer celler (CRC),

SALL3

var signifikant opreguleret i forhold til CD133 (-) CRC celler [10]. Desuden er en nylig undersøgelse udnytter high-throughput DNA-methylering analyse viste også, at

SALL3

var en potentiel biomarkør for tyktarmskræft [11]. De ovennævnte resultater viser, at unormal ekspression af

SALL3

er forbundet med forekomsten af ​​adskillige cancerformer. Men om

SALL3

er involveret i carcinogenese af livmoderhalskræft fortsat ukendt.

I vores aktuelle undersøgelse, vi vist, at promotor-regionen i

SALL3

er hypermethyleret og sammen med HPV-infektion, er involveret i livmoderhalskræft; derudover ekspressionsniveauet af SALL3 mRNA blev nedreguleret. Vi foreslår, at DNA-methylering af

SALL3

hæmmer sin rolle som en tumor suppressor og bidrager til carcinogenese af livmoderhalskræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af “etiske komité for Første Tilknyttede Hospital i Xian Jiaotong Universitet” i Shannxi, Kina. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter til deltagelse i denne undersøgelse.

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

De tre humane livmoderhalskræft cellelinjer SiHa, HeLa og C33A blev givet til os af Dr. Jing Ji fra First Affiliated Sygehus af Medical School, Xian Jiaotong Universitet [12, 13]. Alle disse celler blev dyrket i høj glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (HyClone, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Si Ji Qing, Kina) ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2.

5-azacytidin Behandling

1,0 x 10

5 /brønd SiHa og HeLa-celler blev dyrket separat i 6-brønds plader i DMEM med 10% FBS, og efter 24 timer blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende 0, 5 eller 10 uM 5-azacytidin (5-Aza) (Sigma, USA). Mediet indeholdende 5-aza blev erstattet hver 24 timer i løbet af en 72-timers periode.

MTT assay

3 × 10

3 /brønd SiHa eller HeLa-celler blev podet i 96- brønds plader og dyrket med 0, 5 eller 10 uM 5-Aza. Igennem en periode på 5 dage blev mediet udskiftet hver 24. time, og den samme koncentration af 5-aza blev tilsat. A 3- (4, 5-dimethylthiazol-3-yl) -2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay blev anvendt til at vurdere proliferative kapacitet SiHa og HeLa-celler efter behandling med 5-azacytidin ifølge en standardprotokol. Cellernes levedygtighed blev målt ved absorbansen ved 490 nm.

Patienter og prøver

Tyve-tre livmoderhalskræft vævsprøver, 23 matchede pericarcinomatous vævsprøver og 17 normale cervikale vævsprøver blev opnået fra First tilknyttet Sygehus Xian Jiaotong Universitet fra januar 2014 og december 2014. Alle patienter blev diagnosticeret ved patologisk undersøgelse, og ingen havde modtaget kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. Hver patient var frivillig for denne forskningsundersøgelse og forudsat skriftligt informeret samtykke.

De livmoderhalskræft prøver blev indsamlet fra midten af ​​tumorerne, mens prøver af pericarcinomatous væv stammer 1,0 cm væk fra kræft væv. Sytten prøver af normal cervix blev opnået fra livmoderhalsen af ​​patienter, som gennemgik en total hysterektomi på grund af benigne uterine sygdomme. Den gennemsnitlige størrelse af hver prøve var 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm. Efter vævene blev dissekeret, blev hver prøve vasket med steriliseret PBS og opbevaret ved -80 ° C. Alle procedurer blev udført på is.

DNA ekstraktion, bisulfit modifikation og methylering-specifik PCR (MSP)

Genomisk DNA blev isoleret fra celler og væv under anvendelse af en TaKaRa Mini BEST Universal Genomisk DNA Extraction Kit (Takara, Kina) ifølge producentens instruktioner. I alt 500 ng af det ekstraherede DNA var bisulfit modificeret med EZ DNA-methylering-Gold ™ Kit (Zymo Research, USA). Primerparrene anvendt i MSP var som følger:

SALL3

: 5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTCGTC-3 ‘(fremad), 5′-ATAACCTCCTAAAACTTCCCCGAA-3′ (revers) for methylering og 5’-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTTGTTG-3 ‘ (frem), 5’-AAATAACCTCCTAAAACTTCCCCAAA-3 ‘(tilbage) for unmethylation. Begge PCR-produkterne var 197 bp. Termocyklusapparatet programmer var som følger: 95 ° C i 10 minutter og 40 cykler ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing temperatur i de methylerede primerpar var 51 ° C, medens det for de ikke-methylerede primerpar var 50 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder efterfulgt af en inkubation ved 72 ° C i 7 minutes.The PCR-produkter blev separeret på en 2% agarosegel, farvet med Gelview og visualiseres under ultraviolet belysning. Hver reaktion blev udført tre gange.

HPV-DNA-test

HPV-DNA af treogtyve livmoderhalskræft vævsprøver og sytten normale cervix vævsprøver blev testet ved polymerasekædereaktion (PCR) og flow-through hybridisering. 21 HPV-genotyper blev kvalitativt testet af HPV genotypeundersøgelse kit ifølge alkalisk fosfatase-system (HybriBio, Kina), herunder høj-risiko typer HPV-16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58 , 59 og 68, med lav risiko typer HPV-6,11,42,43,44 og almindelige typer i Kina HPV-53,66 og CP8304.

RNA ekstraktion og real-time kvantitativ PCR (Q- PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler og væv under anvendelse af TRIzol Reagent (Life Technologies, USA) ifølge producentens anvisninger. De anvendte primere til real-time kvantitativ PCR er som følger:

SALL3

: 5′-CAAAGCGAGCTCAGAAACAG-3 ‘(fremad), 5′-CCTGATGCTCCAACTTCAAA-3’ (tilbage);

GAPDH

:

5 ‘

-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′ (fremad), 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ‘(tilbage). Reaktionsbetingelserne var som følger: 95 ° C i 30 sekunder, 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder og 60 ° C i 30 sekunder. Vi anvendte tærskelcyklen (CT) som repræsentativt punkt. Den relative udtryk for

SALL3

mRNA i hver gruppe (fold-ændring sammenlignet med kontrol) blev beregnet ved hjælp af formlen: RQ = 2

– △△ Ct. Hver reaktion blev udført tre gange.

Statistical Analysis

Alle data blev analyseret med SPSS udgave 18.0.Consecutive data blev analyseret ved Wilcoxon rank sum test, Kruskal-Wallis H test eller en- ANOVA-analyse. Kategoriske data blev sammenlignet ved Pearson Chi-square test. Alle statistiske tests var to-sidet, og forskelle, hvor

s

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Påvisning af status methylering i promoter regioner

SALL3

i livmoderhalskræft cellelinjer

DNA methylering altid forekommer i områder, der er rige på CpG øer såsom promotorregioner. En almindelig årsag til mange maligniteter er unormal hypermethylering eller hypometylering af promotor- CpG-øer, hvilket resulterer i transkriptionel repression af mange tumorsuppressorgener eller reaktivering af onkogener. Vi brugte den online software “MethPrimer” at profilere en CpG ø i regionen, der er placeret fra -1859 til -54 bp opstrøms fra ATG, transkriptionsstartsitet (TSS) i

SALL3

promotor (Fig 1A ). Et par primere designet til at amplificere

SALL3

promotorregion. For at identificere status methylering af denne region i livmoderhalskræft cellelinjer, vi brugte methylering-specifik PCR (MSP) til at bestemme

SALL3

status promotor methylering i SiHa, C33A og HeLa-celler. Resultaterne viste, at denne region i SiHa-celler var helt methyleret, hvorimod denne region var helt methyleret i C33A og delvist methyleret i HeLa-celler (Fig 1B).

(A) Predicted CpG-øer i promotorregionen af ​​

SALL3

. Numre angiver positionerne i bp i forhold til transkriptionsstartsitet. Den blå region repræsenterer CpG øer og de røde lodrette bjælker er CpG loci i disse input sekvenser. (B) Påvisning af

SALL3

methylering status ved MSP i SiHa, C33A og HeLa-cellelinjer. (M: methyleret; U: umethyleret)

5-Azacytidin behandling demethylerer

SALL3

promoter regionen og vender udtryk for

SALL3

I de fleste tilfælde, DNA-methylering er en reversibel proces. At identificere, om methylering status i promotorområdet den regulerer ekspressionen af ​​vores gen af ​​interesse på transskription niveau, opdaget vi udtryk for

SALL3

i cellelinier, hvor

SALL3

promotor er kraftigt methyleret (SiHa og HeLa) efter behandling med 5-azacytidin (5-Aza), som kan forårsage DNA-demethylering. Vi målte methyleringen af ​​MSP og real-time Q-PCR. Resultaterne viste, at intensiteten af ​​methylering af

SALL3

promotor i både SiHa og HeLa cellelinier faldet, mens unmethylation af

SALL3

gradvist øges efterhånden som koncentrationen af ​​5-aza forøget (fig 2). Desuden fandt vi, at ekspressionen af ​​

SALL3

mRNA i SiHa og HeLa-celler steg betydeligt i en dosisafhængig måde efter administration af 5-Aza (

s

0,05); den forøgede ekspression, der blev observeret i SiHa-celler var mere bemærkelsesværdigt end hos HeLa-celler (tabel 1, figur 3). Disse resultater tydede på, at ekspressionen af ​​

SALL3

blev vendt med 5-Aza, som demethyleres

SALL3

promotor og fremmet udtryk for

SALL3

gen på transkriptionsniveauet .

(M: methyleret; U: umethyleret)..

(*

s

0,05)

Demethylering af

SALL3

promotor kunne hæmme spredning af livmoderhalskræft celler

Vi brugte en MTT assay for at undersøge, om spredning kapacitet SiHa og HeLa-celler blev foretaget af

SALL3

methylering. Efter blev svækket behandling med 5-aza, cellelevedygtigheden af ​​både SiHa og HeLa-celler på en dosis-afhængig måde (

s Restaurant 0,05) (figur 4), som påviste, at demethylering af

SALL3

i promoter region kan øge ekspressionen af ​​

SALL3

og føre til et fald i cellernes levedygtighed og spredning kapacitet i livmoderhalskræft cellelinjer SiHa og HeLa.

SALL3

promotor-regionen blev hypermethyleret i livmoderhalskræft væv

for yderligere at bekræfte status methylering af promotor-regionen i

SALL3

i livmoderhalskræft væv, vi udførte MSP i 23 livmoderhalskræft væv, 23 matchede pericarcinomatous væv og 17 normale cervikale væv. Som vist i tabel 2, i livmoderhalskræft væv blev 15 methyleret (65,21%) og 8 var umethyleret (34.78); i pericarcinomatous væv, 15 blev methylerede (65,21%) og 8 var umethyleret (34,78%); i normale cervikale væv, blev 5 methyleret (29.41%) og 12 var umethyleret (70,59%). Forskellen mellem grupperne var signifikant (

s

0,05) (tabel 2), bortset fra at der blev observeret nogen signifikant forskel mellem kræft og pericarcinomatous væv (p 0,05). Men den gennemsnitlige grå-skala niveau var højere i de cancervæv (data ikke vist). Disse resultater viste, at

SALL3

promotor blev hypermethyleret i kræft væv, som kunne spille en rolle i carcinogenese af livmoderhalskræft (figur 5).

Hypermethylering af

SALL3

promotor hæmmede genekspression på transkriptionsniveauet

Vi har registreret udtryk for

SALL3

mRNA i de 23 livmoderhalskræft væv, 23 matchede pericarcinomatous væv og 17 normale cervikale væv af real-time Q-PCR. Sammenlignet med den normale cervix, den gennemsnitlige relative udtryk for

SALL3

var lavere i livmoderhalskræft væv (

s

0,05) og pericarcinomatous væv (

s

0,01 ), men ingen signifikant forskel blev observeret mellem de tumorvæv og pericarcinomatous væv (

s Restaurant 0,05) (fig 6A)

Disse data er repræsenteret ved medianen med en interkvartile område (. *

s

. 0,05)

Derudover har vi adskilt disse prøver i to grupper. Den ene gruppe bestod af de væv, hvor promotorregionen af ​​

SALL3

blev methyleret, og den anden bestod af vævene når regionen var umethyleret. Den gennemsnitlige relative ekspression af

SALL3

mRNA i de methylerede væv var lavere end i de ikke-methylerede væv (

s Restaurant 0,05) (Fig 6B). Disse resultater viste, at hypermethylering af

SALL3

hæmmede

SALL3

genekspression på det transskriptionelle niveau.

Høj-risiko HPV-infektion var positivt associeret med hypermethylering af

SALL3

promoter region i livmoderhalskræft

i betragtning af at høj-risiko HPV-infektion er involveret i ætiologien af ​​livmoderhalskræft, vi nærmere forholdet mellem HPV-infektion og hypermethylering af

SALL3

promotor region i livmoderhalskræft. I livmoderhalskræft væv, 14 af 18 HPV-positive prøver blev methylerede (77,78%), og fire var umethyleret (22,22%); 1 af 5 HPV-negative prøver blev methyleret (20,00%), og 4 var umethyleret (80,00%). I normale livmoderhalsen væv, 2 af 6 HPV-positive prøver blev methyleret (33,33%), og 4 var umethyleret (66,67%); 3 af 11 HPV-negative prøver blev methyleret (27.27%), og 8 var umethyleret (72,73%). De kombinerede statistiske resultater blev vist i tabel 3. Forskellen mellem disse to grupper var signifikant (

s

0,05). Desuden fandt vi en positiv sammenhæng mellem HPV-infektion og hypermethylering af

SALL3

promotorregion i livmoderhalsen væv (p = 0,010, r = 0,408) (tabel 3), hvilket viste, at HR-HPV-infektion har en tæt relevans med methylering i

SALL3

promotorområder.

Desuden relative udtryk for

SALL3

mRNA i HPV-positive væv var lavere end i HPV-negative væv (Fig 7). Resultaterne af HPV typer 40 cervix vævsprøver blev vist i S1 Tabel

Disse data er repræsenteret ved medianen med en interkvartile område (*

s Restaurant 0,05)..

diskussion

på verdensplan, incidensraten af ​​livmoderhalskræft udgør 13% af alle maligne tumorer hos kvinder og overgås kun af brystkræft [14, 15]. Selvom genital HPV har vist sig at have et tæt samarbejde med ætiologien af ​​livmoderhalskræft, og på trods af den udbredte brug af screeningsmetoder og vacciner [16], forekomsten og dødeligheden er stadig høj, især i de mindre udviklede lande [17-19 ]. Derfor belysning af patogenesen af ​​livmoderhalskræft er af stor betydning.

DNA-methylering er den mest almindelige form for epigenetisk modifikation og er væsentlig for forskellige udviklingsmæssige processer gennem dens regulering af genekspression, genomisk prægning og epigenetisk nedarvning [20]. Nylige undersøgelser har vist, at afvigende DNA-methylering i promotorregioner (og CG øer i særdeleshed) er nært beslægtet med tilblivelsen af ​​mange cancere, fordi en reduktion i methylering af hele genomet eller hypermethyleringen af ​​promotorområder af tumorsuppressorgener påvirker genekspression [21, 22]. Som følge heraf er den unormale methylering af tumor-relaterede gener spiller en væsentlig rolle i carcinogenese [23]. Opdagelsen af ​​specifikke methylering markører for forskellige kræftformer kunne have en dybtgående indvirkning.

SALL3

er medlem af SAL familien lokaliserer på 18q23 [24], en væsentlig gen i udviklingen af ​​menneskekroppen . Sletning af 18q23 forårsaget tab af audition, hjerte problem, mental retardering, væksthæmning, lemmer deformitet og så videre [7, 24] .For de seneste par år, forskere rettet mod relevansen mellem

SALL3

udtryk og carcinogenese . Yu

et al

[25] havde fundet

SALL3

hypermethyleret i promotorregioner rige på CG dinukleotid i blære cancer cellelinjer og væv, som kunne være en roman DNA methylering markør til påvisning af blæren kræft. Hvad mere er, initiativtagerne til

SALL3

blev hypermethyleret i H719 cellelinje [26]. Desuden Yang

et al

[27] opdagede, at hypermethylering af

SALL3

bidraget til faldet af

SALL3

mRNA i HCC.

I vores undersøgelse, har vi undersøgt muligheden for at detektere hypermethyleret

SALL3

i promotorområder som en screeningsmetode til livmoderhalskræft. I livmoderhalskræft cellelinjer SiHa og HeLa, hvoraf begge blev HPV positive cellelinier blev methylerede i

SALL3

promotorregioner men C33A, en HPV negativ cellelinie,

SALL3

var umethyleret i promotorregionen. I mellemtiden, i livmoderhalskræft væv, matchede pericarcinomatous væv og normale livmoderhalsen væv viste resultaterne hypermethylering af

SALL3

i livmoderhalskræft og pericarcinomatous væv sammenlignet med i normale livmoderhalsen væv (

s

0,05 ) .Vores resultat var i overensstemmelse med Shikauchi

et al

[8] og Yang

et al

[27].

taget disse sammen, infektion af HPV kan deltage i den mekanisme af

SALL3

methylering-relateret carcinogenese. High-risk HPV (hrHPV) -induceret immortalisering og malign transformation er ledsaget af DNA methylering af værten gener. Schütze

et al

[28] fandt, at HPV-induceret udødeliggørelse var forbundet med en sekventiel og progressiv forøgelse promotor methylering af en delmængde af gener, herunder hTERT, mir124-2, PRDM14 og så videre, som var hovedsagelig uafhængigt af det virale immortalisering kapacitet. I vores undersøgelse overraskende ved hjælp af en analyse af forholdet mellem HPV-infektion og

SALL3

status for methylering i livmoderhalsen væv, demonstrerede de resultater, genomisk hypermethylering og lavere mRNA-ekspression i transkription niveau af

SALL3

i HPV-positive livmoderhalskræft væv sammenlignet med i HPV-negative væv (

s

0,05) og hr-HPV-infektion positivt associeret med hypermethylering af

SALL3

promoter region (

p

0,05, r = 0,408), hvilket var i overensstemmelse med Schütze og vores tidligere undersøgelse af livmoderhalskræft cellelinjer, bringer os nye beviser, at HPV-infektion havde deltaget i carcinogenese af livmoderhalskræft. Men i vores nuværende undersøgelse, rækkefølgen af ​​to begivenheder-timers-HPV-infektion og

SALL3

methylering fandt sted, og om de havde direkte interaktion (med E6 /E7 eller andet gen loci) stadig ukendt. Vi vil holde på at søge efter den mekanisme af carcinogenese induceret af HPV-infektion og DNA methylering i de følgende undersøgelser.

For yderligere at verificere forholdet mellem methylering og genekspression, vi behandlede SiHa og HeLa, der var stærkt

SALL3

methyleres i promoter regionen, med 5-azacytidin, kunne en agent spille en rolle på DNA demethylering på en genom-plan. Resultaterne antydede, at når koncentrationen af ​​5-Aza forhøjet generelt er niveauet af methylering af

SALL3

faldt off samt umethyleret udtryk steget betydeligt i SiHa og HeLa (

s

0,05 ). Samtidig, mRNA relative ekspression af

SALL3

i SiHa og HeLa øges også, og den øgede grad i

SALL3

helt methyleret cellelinie SiHa var mere bemærkelsesværdig end i HeLa,

SALL3

delvis-methylerede cellelinje, der foreslog, at demethylering af

SALL3

effektivt kunne vende sit udtryk i transskription niveau. Derefter viste MTT assay, at efter behandlet med 5-Aza, cellens levedygtighed og spredning af SiHa og HeLa betydeligt svækket som illustreret en kræft-hæmmende funktion af

SALL3

i livmoderhalskræft celler. I vævsprøver, Q-PCR-resultater antydede, at mRNA ekspressionen af ​​

SALL3

blev højere i kræft og pericarcinomatous væv end i normale livmoderhalsen væv (

s

0,05), der delte lignende idé med tidligere undersøgelser [27]. Hertil kommer, statistisk analyse af mRNA-ekspression mellem methylerede og umethylerede væv viste, at i

SALL3

denatureret væv, mRNA af

SALL3

var højere end i umethylerede væv (

s

. 0,05) .Taken sammen, viste resultaterne

SALL3

hypermethylering bidraget til nedregulering af genekspression i transskription niveau i livmoderhalskræft

som konklusion, vores forskning først vist, at promotor af

SALL3

var hypermethylering, og på grund af denne mekanisme nedreguleret mRNA ekspression og accelererede cellevækst i livmoderhalskræft væv og cellelinier. High-risk HPV-infektion som en ætiologi af livmoderhalskræft deltaget i

SALL3

methylering. Denne afvigende methylering status på hele genomet skala inaktiveret sin funktion som en tumor suppressor og bidrog til carcinogenese af livmoderhalskræft.

Støtte Information

S1 Table. HPV typer 40 livmoderhals vævsprøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0145700.s001

(DOCX)

Tak

Denne forskning blev understøttet af en National Natural Science Foundation of China (No.81472428).