PLoS ONE: Isolering af cancer stamceller fra Three humane glioblastom cellelinier: Karakterisering af to udvalgte kloner

Abstrakt

Kræft stamceller (CSC) blev isoleret via en ikke-klæbende neurosfære assay fra tre gliomcellelinier: LI, U87 og U373. Ved hjælp af en klonal assay to kloner (D2 og F11) blev udvalgt fra sfærer afledt af LI-celler og blev karakteriseret for: ekspression af stamcellemarkører (CD133, nestin, Musashi-1 og Sox2); spredning; differentiering kapacitet (bestemt ved ekspression af GalC, βIII-tubulin og GFAP); Ca

2+ signalering og tumorigenicitet i nøgne mus. Både D2 og F11 kloner udtrykte højere niveauer af alle stamcellemarkører i forhold til den parentale cellelinje. Kloner voksede langsommere end LI celler med en to gange stigning i overlapning tid. Markører for differentiering (βIII-tubulin og GFAP) blev udtrykt ved høje niveauer i både LI celler og i neurosfærer. Ekspressionen af ​​Nestin, Sox2, og βIII-tubulin blev nedreguleret i D2 og F11, når de dyrkes i serumholdigt medium, hvorimod Musashi-1 blev forøget. I denne tilstand, duplikering cirka D2 og F11 forøges uden at nå til denne med LI-celler. D2, F11 og forældrenes celler udtrykte ikke spændingsafhængige Ca

2 + -kanaler, men de udviste øget intracellulære Ca

2 + niveauer som reaktion på ATP. Disse Ca

2 + signaler var større i LI celler og i sfærer dyrket i serumholdigt medium, mens de var mindre i serum-frit medium. ATP behandling påvirkede ikke celleproliferation. Både D2 og F11 inducerede forekomsten af ​​tumorer, når de ortotopically injiceres i athymiske nøgne mus ved en densitet 50 gange lavere end den af ​​LI-celler. Alle disse data, at begge kloner har fællestræk CSC og har de samme stemness egenskaber. Resultaterne vedrørende udtryk for differentiering markører og Ca

2 + -kanaler viser, at både kloner ikke er i stand til at nå den terminal differentiering. Både D2 og F11 kan repræsentere en god model for at øge kendskabet til CSC i glioblastom og identificere nye terapeutiske tilgange

Henvisning:. Iacopino F, Angelucci C, Piacentini R, Biamonte F, Mangiola A, Maira G, et al. (2014) Isolering af cancer stamceller fra Three humane glioblastom cellelinier: Karakterisering af to udvalgte kloner. PLoS ONE 9 (8): e105166. doi: 10,1371 /journal.pone.0105166

Redaktør: Giovanni Camussi, University of Torino, Italien

Modtaget: Marts 7, 2014 Accepteret: 21 Juli 2014; Udgivet: 14 August, 2014

Copyright: © 2014 Iacopino et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde har modtaget en fransk regering støtte til CominLabs excellence laboratorium og forvaltes af National Research Agency i “Investering for the Future” program under henvisning ANR-10-LabX-07-01. Det blev også støttet af Rennes Universitetshospital (COREC Project opkaldt Connexion, 2012-14). Vi takker også Det Europæiske Forskningsråd for ERC-2011-ADG – tilskudsaftale N ° 290.901 – Forkortelse “NEUCOD”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

der er stigende tegn på, at tumorer hierarkisk organiseres af heterogene populationer, herunder en lille brøkdel af cancer stamceller (CSC). CSC deler mange ligheder med normale stamceller, såsom selvfornyende kapacitet og multilineage differentiering egenskaber [1]. Desuden CSC er yderst tumorigene og kan generere fænokopier af primære humane maligniteter hos immunkompromitterede mus [1]. Fra et klinisk synspunkt, CSC er ansvarlige for tumor vedligeholdelse, sustentation, gentagelse og resistens over for konventionelle behandlinger [2] -. [4]

A CSC fraktionen er blevet isoleret i mange cancere, herunder gliom [2 ] – [5], under anvendelse af forskellige metoder [5] – [9]. De fleste gliom CSC er udledt af kliniske tumor prøver [7], [10], [17], mens kun få er blevet afledt af etablerede cellelinjer: Rotte C6 celler og humane maligne gliom cellelinier (U373, A172, U87 og SU3 ) er blevet anvendt [9], [17] – [23], [24]. Nogle forfattere anbefaler ikke cellelinjer som en kilde til CSC fordi de vokser i serumholdigt medium, hvilket giver anledning til celler, der adskiller sig genetisk og biologisk fra beskrivelserne primære tumorer, hvorfra de blev afledt [25]. Alligevel cancercellelinier har nogle fordele i forhold til tumorvæv. Faktisk har de ikke udgør nogen kontaminerende normale stamceller, kan betragtes som en homogen prøve og det er let at opnå store mængder af dem [21]. Derfor kan identifikation og karakterisering af CSC fra etablerede cellelinjer give vigtige redskaber for at udforske biologi CSC [26]. Ingen enkelt markør er blevet vist at være tilstrækkelig til at give stamcelle-lignende egenskaber, er således en kombination af forskellige markører til at identificere og isolere CSC i gliom, herunder Nestin, Sox2 (SRY-beslægtet HMG-box-genet 2) og Musashi -1 (MSI-1). Disse molekyler udtrykkes ved høje niveauer i neurale stamceller og ofte betragtes som en kendetegnende for udifferentierede tilstand [27] – [30]

Ved udsættelse for føtalt bovint serum, CSC differentiere ned afstamning af forældrenes. tumor [6], [9], [12], [16] – [23]. Derfor CSC stammer fra gliomer fortrinsvis differentiere til astrocytter, men multilineage differentiering kan lejlighedsvis iagttages med neuronale slægter, og nogle unormale celler med blandede fænotyper. Det skal bemærkes, at disse slægter er karakteriseret på grundlag af molekylære markører, såsom astrocytiske markør GFAP, den oligodendrocytic markør GalC, og den neuronale markør (βIII-tubulin) [7], [9], [16] – [ ,,,0],23], [25], snarere end på funktionelle parametre. For eksempel bør den afgørende test for at identificere en neuron være at vurdere dets evne til at generere aktionspotentialer [31], [32], men denne test er normalt ikke udføres. Desuden har den vigtige rolle, Ca

2+ signaler i udviklingen af ​​glioblastom (GBM) for nylig blevet revideret [33].

Der er opnået nogle interessante resultater ved hjælp CSC afledt fra etablerede cellelinjer vedrørende invasive egenskaber, kemoresistens, drug screening, apoptose, proliferation, immunresponser, og genekspression [34] – [39].

i denne undersøgelse fandt vi, at U87, U373 og LI-cellelinier indeholder en brøkdel af celler, som kan danne tumor sfærer ved dyrkning i serumfrit neural stamcelle medium. Celler fra tumor sfærer besidder den evne til selvfornyelse og sekundære sfærer formation.

Det er velkendt, at i GBM der er en histologisk variabilitet og heterogenitet [40], [41], som resulterer i isolering af særskilte CSC subpopulationer, der opretholder den primære tumor fænotype og genotype, som for nylig beskrevet [19], [25]. Vores resultater viser tydeligt, at alle de menneskelige gliomcellelinier vi undersøgte indeholde CSC. Desuden blev to kloner udvalgt fra LI cellelinje karakteriseret til: udtryk for stemness markører, spredning, evnen til at differentiere, tilstedeværelse af spænding-gated Ca

2 + kanaler og ATP-afhængige Ca

2 + signaler, og tumorigenicitet efter orthotopisk transplantation. Så vidt vi ved, er tilgængelige i litteraturen om tilstedeværelsen af ​​CSC i denne LI cellelinie ingen data. Disse to kloner kan repræsentere modeller nyttige for fremtidige undersøgelser af maligne gliomer med det formål at finde nye behandlingsmetoder.

Materialer og metoder

Cellelinjer

Kultur af gliomcellelinier .

humane cellelinie U373 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD, USA), astrocytoma grad III /glioblastom, blev venligst stillet til rådighed af professor Pierluigi Navarra, Institut for Farmakologi, katolske Universitet det Hellige heart, Rom.

humane cellelinie U87 (ATCC, USA), astrocytoma grad III /glioblastom, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Emilio Ciusani, National Neurological Institute “Carlo Besta”, Milan [42].

De menneskelige LI cellelinje, astrocytoma grad IV, er venligst doneret af professor Gabriella Zupi, Regina Elena Institute, Rom [43], [44].

De tre cellelinier (forældrenes cellelinjer ) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium /Hams F-12 (DMEM /F12) (Gibco, Carlsbad, CA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Euroclone, Milano, Italien), antibiotika (penicillin /streptomycin 100 IE /ml /100 um /ml, Euroclone), 4-2-hydroxyethyl-1-piperazinyl-ethansulfonsyre (10 mM, Euroclone), glutamin (2 mM, Euroclone) og glucose (0,3% vægt /volumen, Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, USA), herefter benævnt: standard medium. Cellerne, som vokser i monolag, blev videredyrket til sammenflydning, og holdt ved 37 ° C i fugtig atmosfære luft: CO

2. (95%: 5%)

neurosfære (NS) kultur

Alle monolag voksende cellelinjer, U373 (22-25

th passage), U87-MG (52-55

th passage) og LI (93-95

th passage) blev udsået ved en densitet på 100.000 celler /ml, i et defineret serumfrit medium, DMEM /F12 suppleret med antibiotika (penicillin 100 IU /ml, streptomycin 100 um /ml), HEPES (10 mM), glutamin (2 mM), glucose (0,3% vægt /volumen), rekombinant human epidermal vækstfaktor (rhEGF) (20 ng /ml, R D Systems) og N-2 Plus Media Supplement (R anti-Nestin (Chemicon, Tamecula, CA, USA); anti-Sox2 monoklonale, (R anti-Musashi-1 (monoklonale, R anti-galactocerebrosid (GalC, monoklonalt IgG3 Millipore Corp., Bedford, MA, USA); anti-gliafibrillært Acid Protein (GFAP, monoklonale, IgG3, Millipore), anti-Neuronal Klasse IIIβ-tubulin (monoklonalt IgG2a, TUJ1 Klon, Covance Research Group Inc.).

Flowcytometri

til bedømmelse CD133 ekspression ved flowcytometri blev cellerne dissocieret mekanisk, vasket to gange i en opløsning af ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) 2 mM i phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA), og derefter inkuberet med anti -CD133 /1 (AC133) -PE antistof (Miltenyi Biotec, Tyskland) 01:20 i 30 min. ved 4 ° C i mørke. Celler blev vasket og suspenderet i PBS til analyse. De blev derefter analyseret ved flowcytometri i en PCA-96 System maskine (Guava Technologies, Hayward, CA, USA).

Caco-2-cellelinje, en kontinuerlig linie af en heterogen human epithelial colorektal adenocarcinom, var anvendt som en positiv kontrol.

Immuncytokemi

Cryosectioning af NS.

Hele NS blev indsamlet fra dyrkningsflasker, vaskes med PBS for at fjerne overskuddet af dyrkningsmediet, og fast i 4%

paraformaldehyd

(PFA) i 10 min. ved stuetemperatur. NS blev derefter anbragt i en PBS /20% saccharose natten over ved 4 ° C. De blev derefter monteret i OCT (optisk skæring temperatur) forbindelse (Sakura, Tissue Tek, Torrance, CA), efterfulgt af nedfrysning ved -80 ° C. Skiver af 10 um blev opnået på en kryostat, og placeret på slides ( “Super Frost Plus”, Menzel-Glaser, Braunschweig, Tyskland).

Celler vokser i monolag blev udsået på “Super Frost Plus” slides og , på de forskellige kultur tidspunkter, blev de fikseret i 4% PFA i 10 minutter. Efter vask med PBS blev objektglassene holdt ved -80 ° C, indtil de blev behandlet.

I immuncytokemisk analyse, efter rehydrering med PBS, den samme procedure blev fulgt for kryosnit og dækglas. Snittene blev dækket med blokerende opløsning (Super blok, UCS Diagnostics, Roma, Italia) i 8 min. eller med 0,3% (vol /vol) Triton X-100, 1% (vægt /volumen) BSA og 10% (v /v) “normal donkey serum” i PBS i 1 time. Efterfølgende blev de inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende primære antistoffer (fortyndet med blokerende opløsning): anti-Nestin (1:200); anti-Sox2 (1:50); anti-Msi-1 (1:200); anti-GalC (1:100); anti-GFAP (1:500); anti-βIII-tubulin (1:200). Efter skylning med saltvand puffer, blev skiver inkuberet med HRP polymer-konjugat (SuperPicture Polymer Detection Kit, Zymed, San Francisco, CA, USA), og efter et vasketrin, 3,3′-diaminobenzidin (Vector, Burlingame, CA, USA ) blev anvendt som chromogen. Kerner blev modfarvet med Harri hæmatoxylin. Negative kontroller blev udført ved at udelade primært antistof.

Western-blot-analyse

Celler fra både monolagskulturer og NS, efter 0-45 dages dyrkning, blev opsamlet i en lysepuffer (150 mM NaCI, 1% Nonidet P-40, 0,5% Triton X-100, 0,5 mM EDTA, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCI, pH 7,6), indeholdende proteasehæmmer cocktail (Sigma-Aldrich), og 17,4 ug /ml phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma-Aldrich). Proteinekstrakter blev kvantificeret ved Bradford Protein Assay. Til Western-blot-analyse, 50 ug totale proteiner blev opløst på denaturerende polyacrylamidgeler (SDS-PAGE): 10% (MSI-1, βIII-tubulin) og 8% (Nestin) og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF; Immobilon P , Millipore, USA) membran ved elektroblotting. Membraner blev blokeret med PBS-T (PBS-puffer saltopløsning med 0,1% Tween-20) indeholdende 5% BSA og derefter inkuberet natten over med primære antistoffer. Efter vask i 3 x 5 min., Blev membranerne probet 1 time ved stuetemperatur med sekundært antistof (anti-muse-IgG-peroxidasekonjugat, Sigma, 1:10,000). Afsløringen blev foretaget af kemiluminescens

Signalerne blev kvantificeret ved densitometrisk scanning (ChemiDoc dokumentationssystem /QuantityOne kvantificering software, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)..

Konfokal Ca

2+ billeddannelse

Konfokal Ca

2+ billeddannelse blev udført som tidligere beskrevet [32]. Kort beskrevet blev celler udpladet på dækglas inkuberes i 30 min. ved 37 ° C med Ca

2 + -følsom fluorescerende farvestof Fluo-4 AM (2,5 uM, Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italien) i Tyrodes opløsning indeholdende: 150 mM NaCl, 4 mM KCI, 2 mM MgC

2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES og 2 mM CaCl

2. PH blev justeret til 7,4 med NaOH. DYE-loaded celler blev vasket og opbevaret på dækglas i 30 minutter. ved stuetemperatur (23-25 ​​° C) i frisk Tyrodes opløsning for at tillade fuldstændig farvestof de-esterificering. Dækglassene blev derefter overført til en perfusion kammer placeret på scenen af ​​et omvendt mikroskop (DM IRE2, Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) fastgjort til et konfokalt laser scanning system (TCS-SP2, Leica). Fluo-4-loaded celler blev spændt med 488-nm linje i en Ar /ArKr laser og emission signalet blev opsamlet ved en fotomultiplikator i et vindue fra 500 til 535 nm. Intracellulær Ca

2+ transienter blev stimuleret ved enten udsættelse celle til ATP (50 uM) eller membran depolarisering (opnået ved at eksponere cellerne for en modificeret Tyrodes opløsning indeholdende 100 mM KCI). Intracellulær Ca

2 + transienter forårsaget af disse stimuli blev erhvervet ved 0,5 Hz og deres amplitude blev målt i bf /F-forhold, dvs. hvor F

max repræsenterer fluorescensen indspillet på toppen af ​​Ca

2+ transienter beregnet over hele det optagede foranstaltning (varighed 60 s) i et område af interesse spores omkring hver celle organ; F

pre er den gennemsnitlige fluorescensintensitet målt i før-stimulus periode (20 s); og F

bgnd er baggrundsfluorescens målt i et område af marken mangler farvestof-fyldte strukturer. I en undergruppe af nogle eksperimenter med henblik på at evaluere bidraget fra ekstra-vs. intracellulære Ca

2+ til den målte intracellulært Ca

2+ transienter blev to konsekutive ATP stimuleringer udført på celler ved differentiering dag 5. Den første anvendelse af ATP blev udført i normal Tyrodes opløsning. Efter 5-min., Blev ATP ansøgning gentaget i en modificeret Tyrodes opløsning, i hvilken Ca

2+ blev fjernet (det vil sige næsten Ca

2 + -fri opløsning). Før testning virkningerne af Ca

2+ fjernelse på ATP-induceret Ca

2 + transienter, stabiliteten af ​​Ca

2+ svar på to på hinanden følgende ATP stimuleringer gentages med 5-min. intervallet blev evalueret: forskelle mindre end 5% blev fundet

spredning assay

LI-celler blev podet i flerbrøndsplader i standard medium mens NS-kloner blev podet i NSCM (25.000 celler pr).. Celletællinger blev bestemt på dag 2, 4, 6, 8 og 10 efter podning anvendelse af en automatisk celletæller (NucleoCounter, ChemoMetec A /S, Allerød, Danmark). Mediet blev skiftet hver 2. dag.

vækstkurve blev genereret så vandret koordinere datum definerede dage og vertikale ordinat datum definerede celledensiteter. Cell fordobling gange i løbet logaritmisk vækst blev beregnet efter Hayflick formel: (T = befolkning fordoblingstid; t = fastsatte tid efter subkultur, N

t = antal celler på det aftalte tidspunkt, N

0 = antal celler i begyndelsen af ​​subkultur).

Et sæt forsøg cellevæksten blev udført for at teste effekten af ​​ATP på celleproliferation. Celler (LI, D2, F11, og D2 og F11 opsamlet efter 1 dag og 5 dage under differentiering medium) blev podet ved en densitet på 50.000 celler /brønd i 1 ml dyrkningsmedium til plader med 24 brønde og behandlet med ATP koncentrationer fra 0 til 100 ug /ml for 0, 1, 2, 3, 4, 5 og 7 dage. Celletællinger blev udført med et cytometer. Eksperimenter blev kørt i tre eksemplarer.

In vivo

analyse af tumorgenicitet

Etik erklæring.

Alle anvendte dyr blev eksperimenteret i nøje overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg retningslinjer, der gælder på det katolske universitet i det Hellige Hjertes og enhver indsats blev gjort for at minimere lidelse. Arbejdet blev udført under ledelse af Det Dyreetiske Udvalg, “A. Gemelli “, School of Medicine, Katolske Universitet Det Hellige Hjertes, Rom, Italien (godkendt projekt licens: prot.pdc.CESA /A /42/2011).

athymiske nøgne mus (nu /nu; 6 -8 uger gamle; Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) blev bedøvet med IP ketamin og xylazin, og stereotaktisk implanteret med enten isoleret D2, F11-celler (10.000 eller 1.000 pr mus) eller LI-celler (500.000 eller 10.000 pr mus) i 3 pi PBS i den højre striatum. En kontrolgruppe modtog kun vehikel (PBS). De implanterede mus, 4 dyr pr gruppe, blev vejet en gang om ugen, overvåget to gange om ugen og blev dræbt, da de udviklede neurologiske symptomer (ataksi /manglende koordination /svimlende /ubalanceret). Mus blev aflivet ved cervikal dislokation under en dyb anæstesi. Brain snit blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​tumorer, som beskrevet nedenfor.

Hematoxylin-eosin og immunhistokemisk farvning af hjernesektioner

tumor-celle-implanterede mus hjerner blev fikseret med 4% paraformaldehyd og skæres med en mikrotom i koral sektioner. For hæmatoxylin-eosin-farvning, blev hjernesnit monteret på objektglas farvet med Harri hematoxylin for 2 min. først, og derefter modfarvet med alkoholisk eosin. For at karakterisere hjernevæv ved immunhistokemi blev snit farvet med primære antistoffer til human-specifikke anti-Nestin (1:200), anti-βIII-tubulin (1:200), og anti-GFAP (1:500), efter samme procedure som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

Alle værdier i de tal og tekst blev vist som middel ± SD. Eventuelle væsentlige forskelle mellem middelværdier blev evalueret af Students t-test eller envejs ANOVA. En to-sidet p 0,05 blev accepteret som signifikant

Resultater

Isolering af CSC ved neurosfære (NS) dannelse assay

Under dyrkningsbetingelser for NSCM, kugler ligner. typiske NS hurtigt dannet oven på monolag af alle cellelinier (figur 1A). Omkring 3 dage senere, U87 og LI cellelinier voksede helt sfærisk (10-20 celler) uden vedhæftede celler (primær NS), mens nogle adhærente celler fastholdt U87 cellelinie. Efter 1-2 ugers dyrkning blev dannelsen af ​​tumor sfærer detekteret og fotograferet under et inverteret mikroskop. Kuglerne kunne opformeres og kontinuerligt dyrket i en fritflydende form, (figur 1A). Derfor er alle cellelinjer dannet selvstændige vedvarende sfærer i kultur

(A):. Top, forældrenes cellelinjer (LI, U87 og U373 celler) dyrket i deres standard medium tilsat 10% serum. Middle, dannelse af neurosfærer oven på monolag af U373 cellelinje. Billeder blev taget efter 1, 2 og 3 dage i neurosfære medium. Bund, billeder af primære NS genereret af LI, U87 og U373 celler ved dag 8. (B) Kloner afledt af LI (D2 og F11) og U87 (C7 og E8) primære NS. Original forstørrelse 200 × eller 400 ×. Scale bar = 100 um.

Begrænsning Fortynding /Spheres Tumor Indledning (TS-CI) Analyse

Til bestemmelse af evnen af ​​de tre cellelinjer at danne NS, en TS-CI analyse blev udført. Hyppigheden af ​​TS-ICs var 1,56% for U373-celler (1 celle hver 64 viste evnen til at danne primære NS), 1,45%, for U87-MG-celler (1 celle hver 69 viste evnen til at danne primære NS), og 2,74% for LI-celler (1 celle hver 36 udstillet evnen til at danne primær NS).

Single kolonidannelse analyse

for at vurdere selvfornyelse kapacitet af primære NS, en klonogene assay blev udført. Effektiviteten af ​​kolonidannelse var 9,5%, 10,5% og 33,3% for NS afledt fra U373, U87 og LI hhv.

Voksende kloner blev udvalgt, opdelt, og vedligeholdt gennem mange subkulturer. To kloner (D2 og F11) blev opnået fra primære IF afledt af LI og to (C7 og E8) fra U87 som dannede selvstændige vedvarende kugler i kultur (figur 1B). Ingen af ​​klonerne afledt fra U373 kunne forblive i kultur, selv når et andet medium blev anvendt. Morfologien af ​​klonerne var variabel. F11, C7 og E8 voksede helt sfærisk, mens D2 havde tendens til at danne både sfæriske eller aflange aggregater (figur 1B).

Angivelse af stamcelle markører og afstamning-specifikke markører

CD133, Nestin, Sox2 og Msi-1 blev vurderet for at vurdere staminal karakter af udvalgte kloner. Under anvendelse af immuncytokemi, 50% af LI-celler og 100% af U87 var Nestin-positive og farvningen var placeret på den cytoplasmatiske niveau. I både D2 og F11 kloner afledt fra primære NS Li-celler, blev der observeret en stigning i stamcellemarkør ekspression. Mere end 80% af cellerne fra begge kloner var positive for Nestin. Ingen stigning i Nestin farvning blev observeret i begge kloner afledt fra U87-celler i forhold til den parentale cellelinje (figur 2).

Indsatsene refererer til negative kontroller. Original forstørrelse 400 ×. Scale bar = 100 um.

På grundlag af denne dokumentation og morfologiske aspekt er blevet udført efterfølgende eksperimenter kun på kloner D2 og F11 med det formål at kontrollere, om de observerede forskelle kunne svare til forskelle i adfærd.

Analyse CD133 ekspression ved flowcytometri, vi har registreret 0,04, 0,13, og 1,44% CD133-positive celler i LI, D2 og F11-celler, henholdsvis (figur 3A). Disse værdier persisteret efter forskellige cyklusser af nedfrysning. Under anvendelse af immuncytokemi, fandt vi, at 30% LI celler til stede i små grupper i monolagskultur var positive for Sox-2, der typisk blev lokaliseret i kerner; endelig 100% LI celler viste svag Msi-1 cytoplasmisk farvning (figur 3B). I begge D2 og F11-kloner, blev der observeret en stigning på stamcellemarkør ekspression. Firs procent af celler fra begge kloner var positive for Nestin og 100% for Sox-2. En stærkere ekspression af Msi-1 blev påvist i 100% af cellerne (figur 3B). Nestin ekspression i begge kloner blev bekræftet ved Western blot analyse. Figur 4C refererer til data opnået i F11 klon

A:. Flowcytometrianalyse at måle CD133 ekspressionen af ​​celler fra LI monolagskulturer og D2 og F11-kloner. CaCo

2 celler er positive kontrol. CD133 ekspressionen blev vurderet i begge kloner på 5

th passage (5

BBE) og 16

th passage (16

BBE). B: Data fra et repræsentativt eksperiment af immuncytokemisk farvning for Msi-1 og Sox2 udtryk i LI, D2 og F11 celler. Indsatsene refererer til negative kontroller. Original forstørrelse 400 ×. Scale bar = 100 um

A:. Immuncytokemisk farvning for Nestin, Msi-1, Sox2 og βIII-tubulin udtryk i D2 og F11 celler dyrket i neurosfære medium (uden serum) eller i differentiering medium ( tilstedeværelse af serum) i 5-45 dage. Original forstørrelse 400 ×. Scale bar = 100 um. B: Nogle βIII-tubulin positive celler udviser en typisk neuronal-lignende morfologi. Original forstørrelse 630 ×. Scale bar = 50 um. C: Western blot analyse af Nestin, Msi-1 og βIII-tubulin ekspression i F11-celler dyrket i forskellige tidspunkter i differentiering medium. Proteiner niveauer blev analyseret ved immunoblotanalyse og blev kvantificeret ved densitometri og standardiseret over niveauerne β-actin som et loading kontrol. Værdier er middelværdien ± SD af træ uafhængige forsøg. Tilsvarende resultater blev opnået fra D2-celler. Immunoblottings fra repræsentative eksperimenter er vist. * P 0,05 Students

t

-test vs. forældrenes cellelinjer, * p. 0,01 vs. F11 celler

Kugler blev dyrket under differentiering betingelser for forskellige tidspunkter og analyseret til ekspression af stamcelle markører og afstamning-specifikke markører. Efter inkubation natten over i differentiering medium, de neurosfære-celler var klæbende til dyrkningspladen og voksede i monolag. Ekspressionen af ​​neural-specifikke βIII-tubulin, GFAP, og GalC blev evalueret ved immuncytokemi. Både βIII-tubulin og GFAP blev højt udtrykt i parentale cellelinje og i begge kloner, mens GalC ikke blev udtrykt (data ikke vist). Ved differentieringstilstande, ekspressionen af ​​neural-specifikke βIII-tubulin faldt (figur 4A), medens den af ​​GFAP ikke ændrede signifikant (data ikke vist). Især nogle af βIII-tubulin udtrykkende celler havde en neuron-lignende morfologi (figur 4B), mens andre var flerkernede celler.

Faldet i βIII-tubulin ekspression blev også vurderet ved Western blot-analyse i både D2 ( data ikke vist) og F11 (figur 4C) kloner.

i D2 og F11-kloner et fald i både Nestin og Sox-2 immunopositivitet indtil målbart niveauer blev observeret efter længerevarende NS cellekultur i differentiering medium (figur 4A ). Den slående reduktion af nestin niveauer blev yderligere bekræftet ved Western blot analyse (figur 4C refererer til data opnået i F11-klon). Nr tilsyneladende variation i Msi-1-ekspression, analyseret ved immunocytokemi, blev observeret, men dens placering ændret mellem kerne og cytoplasma afhængigt af tidspunktet på permanens i serumholdigt medium (figur 4A). Western blot analyse viste, at LI-celler og begge kloner udviste en lignende ekspression af Msi-1, mens celler fra begge kloner under differentiering viste en højere grad af proteinet. Figur 4 viser data opnået i F11-klon.

Konfokal Ca

2+ billedbehandling

I udifferentierede celler (nævnt som tiden-point dag-0), KCl stimulation produceret Ca

2+ transienter i mindre end 10% af de samlede celler (

n

= 9 ud af 127), og den gennemsnitlige amplitude af disse transienter var 0,36 ± 0,02. En lav modtagelighed for depolariserende stimuli blev også observeret i differentierende celler. Faktisk procentdelen af ​​celler der reagerer på KCI stimulering med Ca

2+ transienter var lavere end 10% på dag-5, dag-15 og dag-30 også med gennemsnitlige amplituder af 0,75 ± 0,25 [

n

= 7 ud af 287], 0,42 ± 0,07 [

n

= 10 ud af 418] og 0,34 ± 0,02 [

n

= 7 ud af 418], hhv. Disse resultater indikerer, at LI-afledte humane stamceller enten udifferentierede eller på forskellige stadier af differentiering, ikke udviser funktionelle spænding-gated Ca

2 + kanaler. Men når disse cellepræparater blev udsat for 50 uM ATP, klart kan spores intracellulær Ca

2 + transienter blev observeret. I udifferentierede celler (dag 0), ATP produceret Ca

2+ signaler i 16,1 ± 9,8% af totale celler (39 ud af 127) med gennemsnitlig amplitude på 0,79 ± 0,10. Efter 1 dag kultur i differentiering medium, procentdelen af ​​responderende celler steg til 89,2 ± 7,2% (

n

= 115 ud af 132) og den gennemsnitlige amplitude af transienter blev tilsvarende forøget (1,49 ± 1,13). På dag-5, ikke stige yderligere i andelen af ​​responderende celler blev observeret (86,3 ± 3,5%;

n

= 430 ud af 492), men forbigående amplitude nåede en maksimal værdi på 2,69 ± 0,07. Ingen væsentlige ændringer i Ca

2+ signalamplituder blev observeret i løbet af de følgende dage om differentiering op til 30 dage: de bf /F-værdier er 2,48 ± 0,07 på dag-15 (77,8 ± 7,1% af reagere celler;

n

= 334) og 2,55 ± 0,11 på dag-30 (80,5 ± 5,1% af reagere celler;

n

= 306).