PLoS ONE: Quercetin Undertrykker resistente Spheres via p38 MAPK-Hsp27 apoptosecyklus i Oral Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Behandlingssvigt i oral planocellulært karcinom (OSCC), der fører til lokalt recidiv (er) og metastaser skyldes især medikamentresistens. Kræft stamceller (CSCS) menes at være ansvarlig for udviklingen af ​​resistens. Men korrelationerne mellem CSCS, resistens og ny strategi mod resistens i OSCC forblive undvigende.

Metoder

En resistent sfære (DRSP) model blev oprettet ved hjælp af ikke-klæbende kultur system til at inducere lægemiddelresistente celler fra SCC25 cancer oral celler. blev udført en sammenlignende analyse mellem forælder kontrol celler og DRSPs med et beslægtet behandling med fokus på ekspression af epitelial-mesenkymale overgang (EMT) associeret markører, lægemiddel-resistens-gener, og CSC egenskaber

in vitro

samt tumorigenicitet og regime for tumorregression

in vivo

.

Resultater

Vores data viser tilstedeværelsen af ​​et fænomen af ​​EMT med gradvise cellulære overgang fra en epithelioid til mesenchymale-lignende sfæroid morfologi under induktion af lægemiddelresistens. Karakteriseringen af ​​DRSPs afslørede opregulering af lægemiddel-resistens-gener

ABCG2

MDR-1

og CSC-repræsentative markører, hvilket tyder på, at DRSPs har større modstandsdygtighed over for cisplatin (Cis) og stærkere CSC egenskaber sammenlignet med kontrollen. Desuden overekspression af phosphoryleret varme-shock protein 27 (p-Hsp27) via aktivering af p38 MAPK signalering blev observeret i DRSPs. Knockdown af Hsp27 faldt Cis modstand og induceret apoptose i DRSPs. Desuden er en inhibitor af Hsp27, quercetin (Qu), undertrykt p-Hsp27-ekspression, med ændringer af EMT signatur, hvilket fører til fremme af apoptose i DRSPs. En xenographic undersøgelse bekræftede også forøgelsen af ​​tumorigenicitet i DRSPs. Kombinationen af ​​Qu og Cis kan reducere tumorvækst og mindske resistens i OSCC.

Konklusioner

p38 MAPK-Hsp27 aksen spiller en vigtig rolle i CSCS-medieret resistens lægemiddel i OSCC. Målretning denne akse ved hjælp Qu kombineret med Cis kan være en behandling strategi til forbedring prognosen hos patienter med OSCC

Henvisning:. Chen S-F, Nieh S, Jao S-W, Liu C-L, Wu C-H, Chang Y-C, et al. (2012) Quercetin Undertrykker resistente Spheres via p38 MAPK-Hsp27 apoptosecyklus i Oral kræftceller. PLoS ONE 7 (11): e49275. doi: 10,1371 /journal.pone.0049275

Redaktør: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, USA

Modtaget: Juli 20, 2012; Accepteret: 8 oktober 2012; Udgivet: November 12, 2012 |

Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Tri-service General Hospital og National Defense Medical Centre: Grant Nej TSGH-C101-076; Institut for Dental Hygiene, Kina Medical University: Grant Nej CMU99-N1-04-1; National Science Rådet, Kina (Taiwan): Grants Nej NSC-98-2314-B-016-019-MY3, NSC 99-2320-B-039-028-MY3 og NSC 100-2320-B-016- 009; Department of Health, Executive Yuan, Kina (Taiwan): DOH100-TD-PB-111-TM007-22. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Oral pladecellekræft (OSCC) er en af ​​de mest almindelige og dødelige hoved og hals maligniteter i Taiwan og på verdensplan [1], [2]. Aktuelle behandlinger for oral cancer er af begrænset effekt i forebyggelsen tumor tilbagefald og progression, og en betydelig del af patienterne udvikler lokal invasion og metastaser [3]. Prognosen for patienter med oral cancer er forholdsvis dårlig trods nylige terapeutiske fremskridt [4]. Cisplatin (Cis) -baseret kemoterapi er den vigtigste behandling for patienter med fremskreden kræft i mundhulen og anvendes i det mindste for palliativ formål. Imidlertid er effektiviteten af ​​kemoterapi begrænset på grund af

de novo

lægemiddelresistens. Derfor er det vigtigt at belyse de mekanismer, der ligger til grund for mægling af kemoresistens og udvikle en ny strategi for behandling af OSCC.

blev foreslået Begrebet kræft stamceller (CSCS) årtier siden baseret på lighederne mellem cancerceller og normale stamceller [5]. Eksistensen af ​​CSCS blev først karakteriseret i forbindelse med leukæmi [6]. CSC hypotese antyder, at tumorer omfatter et lille population af celler, der besidder tumor-dannende og selvfornyende evner [7]. Akkumulere beviser vist, at CSCS ikke kun kan føre til cancer tilbagefald og metastase men de bidrager også til modstanden af ​​tumorer for kemoterapi [8].

ABCG2 er den mest kendte gen og udtrykkes i en lang række af stamceller, som er blevet tjent som en markør for stamceller fra forskellige kilder [9], [10]. MDR1 udtryk er også blevet rapporteret i forskellige typer af kemoterapi tumor fænotyper [11], [12]. Flere mekanismer er blevet foreslået til cisplatin resistens nylig [13], [14], baseret på den kendsgerning, at cisplatin virker en flere cellulære mål, der udviste forskellige signaltransduktionsveje [13]. En af de andre end regulering af

ABCG2

vigtigste mekanismer og

MDR-1

i forbindelse med resistens over for cisplatin er reduceret intracellulær akkumulering skyldes forringet indtag stof involverer i vedligeholdelse af kobber homeostase såsom Menneskelig kobber transporter 1 og de to kobber effluxtransportører ATP7A og ATP7B der regulerer udstrømningen af ​​cisplatin [15] – [17]

på trods af sammenhængen mellem induktion af CSCS i tumorceller og erhvervelse af resistens. og gentagelse af tumorer, mekanismen bag disse fænomener er stadig stort set ukendt.

varmechokproteiner (HSP’er) er generelt fremkaldt af miljøbelastning og funktion som molekylære chaperoner, som er ansvarlige for at opretholde den korrekte konformation af andre proteiner . HSP’er er klassificeret i høj molekylvægt HSP’er, såsom Hsp90 og Hsp70, og lav molekylvægt HSP’er, herunder Hsp27 [18]. Ud over dens konventionelle funktion som en chaperone, er Hsp27 blevet rapporteret at være overudtrykt i bryst-, ovarie- og hoved og hals kræft [19] – [21]. Ekspressionen af ​​Hsp27 er blevet forbundet med dårlige prognoser og overlevelsesrater for patienter med forskellige cancere. Desuden har Hsp27 blevet påvist at være forbundet med kemoresistens og induktion af cancerceller, der bærer stamcelle-lignende egenskaber i brystkræft og mange andre maligniteter. Men rapporter inddragelse af Hsp27 i lægemiddelresistens i og prognose af, OSCC er begrænsede. Quercetin (Qu) er den vigtigste flavonoidforbindelse (3,30,40,5,7-penta-hydroxy-flavanon) almindeligt udvundet af tranebær, blåbær, æbler og løg. Det besidder et bredt spektrum af bio-farmakologiske egenskaber [22], og kan tilbyde lovende nye muligheder for udvikling af mere effektive kemoforebyggende og kemoterapeutiske strategier på grund af sin stærke antioxidant og fri-radikal-fjernende egenskaber [23]. En tidligere rapport viste også, at Qu spiller en rolle som en hæmmer af Hsp syntese og har beskyttende virkninger i mus leverskade for cellulær homeostase [24]. Men detaljerne i forholdet mellem Qu og Hsp27 om deres involvering i resistens i kræft har brug for yderligere undersøgelse.

Vores gruppe tidligere er fastsat en roman klæbende sfære kultur system, der tillod os at rense og berige en befolkning på OSCC celler med stamcelle-lignende egenskaber [25]. Her tog vi fordel af denne veletablerede kultur system til at undersøge modstand oral cancer til Cis og dets underliggende molekylære mekanisme. Baseret på etablering af resistente kugler (DRSPs), er formålet med den aktuelle undersøgelse var at validere den mulige rolle af Hsp27 og dens tilhørende signalvej i modulering af apoptose. Desuden valgte vi kombinationen af ​​Qu og Cis som en potentiel terapeutisk agent til at undersøge, hvordan Qu interagerer med Hsp27 og mekanismen bag den effektive Qu-medieret undertrykkelse af kemoresistens og tumorvækst i OSCC. Denne undersøgelse kan give et indblik i lægemiddelresistens og nye behandlingsstrategier mod resistens, som kunne anvendes til at forbedre prognosen og overlevelse hos patienter med OSCC.

Metoder

Cell og Sphere Kultur

den humane tunge cancercellelinie SCC25, blev opnået fra ATCC (ATCC nummer: CRL-1628) dyrket i RPMI suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær af 5% CO

2. Cellen blev dyrket i kultur plast bagværk med ikke-klæbende overflade. 10 cm skål er fremstillet af ikke-klæbende for celler ved coating med agarose tynde film. Celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

4 levende celler /10 cm skål, og dyrkningsmediet blev udskiftet hver anden dag, indtil kuglen formation, som set i vores tidligere beskrevet [25].

Induktion af lægemiddelresistens celler

SCC25 parentale celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

4 levende celler /10 cm skål, fortsatte behandler med Cis blev tilsat ved de endelige koncentrationer (1, 5, 10, 20 og 30 uM) for tre måneders følgelig. Efter behandling celler blev høstet og opretholde lav koncentration Cis (0,5 uM) dyrkningsmedium og dyrkningsmediet blev skiftet hver anden dag.

Cell Levedygtighed Analyse

SNG blev sat i en dosis på (5, 10, 20 og 30 uM). Celler blev podet på plader med 6 brønde med en tæthed på 2 x 10

4 per brønd i medium, efter behandling med Cis i 48 timer og analyseret ved MTT-assayet (Sigma-Aldrich).

RNA Interference

siRNA oligoer af Hsp27 bestod af tre mål specifikke siRNAs designet til at knockdown genekspression. Rækkefølgen af ​​tre mål blev vist i nedenstående: sc-29350A: forstand: 5’GAGUGGUCGCAGUGGUUAGtt -3 « antisense: 5′-CUAACCACUGCGACCACUCtt-3 ‘); sc-29350B: forstand: GACGAGCUGACGGUCAAGAtt; antisense: UCUUGACCGUCAGCUCGUCtt; sc-29350C: Sense: CCACGCAGUCCAACGAGAUtt; Antisense: AUCUCGUUGGACUGCGUGGtt eller negative kontrol siRNA oligoer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnologies, Inc. 2 × 10

6 celler blev transficeret med en slutkoncentration (100 nM) på Hsp27 siRNA under anvendelse af lipofectamin 2000 for 48 timer til at påvise protein-niveau. Celler, som blev transfekteret med ikke-specifik siRNA (MOCK gruppe) parallelisme påvist.

Western blot-analyse

Hele cellelysater blev adskilt ved elektroforese på 12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid membran. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk ved stuetemperatur i 1 time. De primære antistoffer blev anvendt: Hsp27 (Santa Cruz; sc-1049; 1:1000) GAPDH (ab9482; 1:5000 fortynding) (Abcam, Cambridge, MA, USA), okt-3/4 (sc-8630; 1: 1000), NANOG (sc-81.961, 1:1000), SOX2 (sc-17320; 1:500) (Santa Cruz Biotechnology), ATP-bindende kassette sub-familie G medlem 2 (ABCG2) (sc-8630; 1: 1000), MDR-1 (sc-8630, 1:1000), p38MAPK (sc-8630, 1:1000), pp38MAPK (sc-8630, 1:1000), Capase-3 (sc-8630; 1:1000) og PARP (sc-81.961; 1:1000) i TBST-puffer indeholdende 3% fedtfri mælk ved 4 ° C natten over og efterfølgende med anti-muse og kanin-anti-gede-sekundært antistof konjugeret med peroxidase (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) ved 25 ° C i 1 time. De immunoblots blev udviklet ved hjælp af et forbedret kemiluminescens-system, og luminescens blev visualiseret på røntgenfilm.

In vivo

Tumorgenetisk Assay

in vivo

tumorgenicitet undersøgelse blev udført efter lokale etiske udvalg retningslinjer, der havde fuld akkreditering udstedt af Foreningen for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care i National Defense Medical center. Mus blev holdt ved 18-26 ° C, 30-70% fugtighed, og uafhængigt luftkonditioneret under en 12 timers mørke /12 timers lys cyklus for 7 dage før xenograft injektion. De parentale OSCC celler og kugler blev injiceret i BALB /c nøgne mus (6 uger). Cellesuspensionen (100 ml) blev injiceret subkutant i hver mus med forskellige celleantal fra 1 × 10

6, 1 x 10

5, og 1 × 10

4 celler. Tumorer blev dannet i 7 dage efter injektion. Tumorstørrelser blev overvåget og målt ugentligt ifølge formlen (længde x bredde

2) /2. Ved 30 dage efter eller orthotopisk inokulation blev musene aflivet under bedøvelse. Alle dyrene blev tilpasset og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg i National Defense Medical Center (IACUC-11-064).

Immunhistokemi

Vævssnit eller celle blok var de- voksbehandlet i xylen og rehydratiseret i alkohol. Antigen genfinding blev udført ved inkubation i 10 mM citratpuffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 40 min. Endogen peroxidase blev blokeret med 0,3% hydrogenperoxid i 10 minutter og derefter inkuberet med 5% normalt hesteserum i phosphatpufret saltvand (PBS) i 60 minutter ved stuetemperatur for at blokere ikke-specifik antistofreaktion. Efter en vask med Tris-pufret saltvand plus 0,1% Tween 20 (TBST) blev objektglassene inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer, E-cadherin (sc-8426; 1:800) og fibronectin (sc-18.825; 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA. USA). Efter at være blevet skyllet i TBST blev objektglassene inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med biotinyleret sekundært antistof efterfulgt af streptavidin-biotinyleret-enzymkomplekset (streptABComplexes kit, Dako, Glostrup, Danmark). Efterfølgende blev de farvet med 0,003% 3, 3-diaminobenzidintetrahydrochlorid, modfarvet med Mayers hematoxylin, dehydreret, og monteret.

Statistical Analysis

Den uafhængige Students t-test eller ANOVA blev anvendt til at sammenligne de kontinuerlige variabler mellem grupperne, mens Χ

2 test blev anvendt til sammenligning af dikotomisk variabel. Niveauet af statistisk signifikans blev sat til 0,05 for alle tests. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 12.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA).

Resultater

Karakterisering af DRSPs i OSCC Celler

Drug-resistent celler (DRCs), induceret fra SCC25-cellelinjen blev først etableres via flertrins Cis behandlinger i forskellige koncentrationer (0, 5, 10, 20 og 30 uM). Kun en lille del af DRCs (20%) blev opretholdt i lang sigt efter Cis behandling ved 25 uM (figur 1A). DRCs blev yderligere dyrket ved anvendelse af et ikke-klæbende dyrkningssystem, som beskrevet i vor tidligere rapport. Kultur i 7 dage gav en klumpformet fænotype betegnes en resistente sfære (DRSP). En gradvis morfologisk ændring af DRCs fra en epithelioid, polygonal udseende til en mesenchymal-lignende, spindel-konfiguration, som er repræsentativ for den EMT fænomen blev observeret under induktion fra forælder OSCC celler til DRCs (Figur 1B). Efter behandling med 25 um Cis i 48 timer, DRSPs var meget mere resistente over for Cis end var kontrol OSCC celler (figur 1C). Ud over de morfologiske forandringer tyder på EMT fænomen under induktion blev DRSPs kendetegnet ved øget migration og invasion evner sammenlignet med kontrolceller (Figur 1D). Karakteriseringen af ​​DRSPs bruger Western blot analyse viste opregulering af lægemiddel-resistens-gener

ABCG2

MDR-1

og CSC-repræsentative markører, herunder OCT4, NANOG, og Sox2 , hvilket tyder på, at DRSPs har større modstandsdygtighed over for Cis og stærkere CSC egenskaber sammenlignet med kontrol- celler. En sammenlignende analyse afslørede ændringer af EMT-associerede markører, herunder nedsat ekspression af E-cadherin, forøget ekspression af fibronectin og Twist-1, og signifikant forøget ekspression af MMP-2 og MMP-9 i DRSPs sammenlignet med kontrolceller (fig 1E) .

(A) Drug-resistente OSCC celler (DRCs) foregik via flertrins Cis behandling i forskellige koncentrationer. Kun en lille del af DRCs blev opretholdt på længere sigt efter Cis behandling. (B) DRCs blev yderligere dyrket ved anvendelse af et ikke-klæbende dyrkningssystem, som gav en sfæroid fænotype betegnes lægemiddelresistente sfærer (DRSPs). Gradvise morfologiske ændringer af DRCs der var tegn på EMT fænomen blev observeret under induktion. (C) Efter behandling med Cis, DRSP celler var mere resistente over for Cis end var kontrol OSCC celler. (D) DRSPs blev yderligere karakteriseret ved øget migration og invasion evner sammenlignet med kontrol- celler. (E) Sammenligninger af EMT- og invasion-associerede markører, lægemiddel-resistens-relaterede genprodukter, og CSC-repræsentative markører afslørede ændringer af ekspressionen af ​​EMT-associerede markører og signifikant opregulering af MMP-2 og MMP-9, lægemiddel- resistens-relaterede genprodukter, og CSC-repræsentative markører i DRSPs sammenlignet med kontrol celler.

Inddragelse af p38 MAPK-Hsp27 antiapoptotisk Pathway i Drug Resistance i OSCC

udtrykket af p-Hsp27 blev dosisafhængigt korreleret med Cis behandling i OSCC celler (figur 2A). P-Hsp27 blev overudtrykt via aktivering af opstrøms p38 MAPK signalering i DRSPs. En yderligere undersøgelse via siRNA af Hsp27 modsat inducerede opregulering af CI-caspase 3 og CI-PARP, hvilket resulterer i fremme af apoptose i DRSPs. Men der var ingen effekt på p38 MAPK udtryk (figur 2B). Dokumentation fra Western blot-analyse viste, at knockdown af p38 MAPK direkte nedreguleret p-Hsp27, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​p38 MAPK-Hsp27 antiapoptotisk vej hos DRSPs (figur 2C).

(A) Ekspressionen af ​​p- Hsp27 blev dosisafhængigt korreleret med Cis behandling i OSCC celler. P-Hsp27 blev correspondently overudtrykt via aktivering af opstrøms p38 MAPK signalering i DRSPs. (B) Knockdown af Hsp27 modsat inducerede opregulering af CI-caspase 3 og CI-PARP, hvilket resulterer i forøget apoptose i DRSPs. Men der var ingen ændring af opstrøms p38 MAPK. (C) Knockdown af p38 MAPK direkte nedreguleret p-Hsp27, hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​p38 MAPK-Hsp27 antiapoptotisk vej hos DRSPs.

Qu-medieret Inhiberende virkning på p-Hsp27 Resulterende i Enhancement af apoptotiske Aktivitet i DRSPs

en MTT assay viste, at behandling med 100 uM Qu kombineret med 10 pM Cis reducerede DRSP vækst og markant chemosensitized DRSPs til Cis, hvilket fremgår af et fald i celle overlevelse efter Cis behandling i DRSPs (

P

0,01). Qu hæmmede produkter fra lægemiddel-resistensgener

ABCG2

i en dosis på 500 uM og også gradvist svækket

MDR-1

i en dosisafhængig måde.

MDR-1

var mere sårbare over for Qu behandling end var

ABCG2

(figur 3A). Knockdown af Hsp27 eller anvendelse af Qu kombineret med Cis gav tilsvarende apoptotiske virkninger, hvilket fører til nedregulering af p-Hsp27 og opregulering af CI-caspase 3 og CI-PARP, men havde ingen virkning på p38 MAPK i DRSPs (figur 3B). Migration og invasion-assays viste, at behandling med Qu kombineret med Cis markant nedsat migration og invasion evner i DRSPs (figur 3C). Behandling med Qu kombineret med Cis vendt udtryk for EMT-associerede markører, hvilket giver opregulering af E-cadherin og nedregulering af vimentin, Twist-1, og fascin-1 (figur 3D).

(A) En MTT assay viste, at Qu behandling med en dosis på 100 uM kombineret med Cis kan undertrykke DRSPs. Qu svækket udtryk for produkterne af de lægemiddel-resistens-gener

ABCG2

MDR-1

i en dosisafhængig måde. (B) Både knockdown af Hsp27 og brugen af ​​Qu kombineret med Cis effektivt inducerede lignende apoptotiske effekter, der førte til faldet i pHsp27 og opregulering af CI-caspase 3 og CI-PARP i DRSPs. (C) Behandling med Qu kombineret med Cis markant nedsat migrationen og invasion evner i DRSPs. (D) Behandling med Qu kombineret med Cis vendt udtryk for EMT-associerede markører og induceret EMT fænomen.

Hæmning af tumorvækst og Dæmpning af Cis Resistance af Qu

in vivo

for at bekræfte tumor-initierende evner kugler

in vivo

begge forældre celler og kugler blev injiceret i mandlige nøgne mus for en analyse af transplanteret tumorgenicitet. Resultaterne af dette forsøg viste en højere kapacitet for tumorigenicitet i DRSPs sammenlignet med kontrolceller. DRSPs gav anledning til tumorer efter injektion af 1 x 10

4 celler i mus (to ud af tre mus). I modsætning hertil blev flere kontrolceller nødvendig for at generere tumorer (injektion af 1 x 10

6 celler i mus, tre ud af tre mus), hvilket antyder, at DRSPs er beriget til tumor-initierende celler med mindst 20 gange sammenlignet med kontrolceller (figur 4A). Størrelsen og omfanget af DRSP-inducerede tumorer var signifikant højere end dem af tumorer induceret af kontrolceller. Vækst forskelle i tumorerne genereret blev gradvist observeret i en tidsafhængig måde efter injektion af DRSPs vs kontrolceller (

P

0,05) (Figur 4B). Mus behandlet med Qu kombineret med Cis udviste signifikant hæmning af tumorvækst sammenlignet med gruppen behandlet med Cis alene og kontrolgruppen (figur 4C). En sammenlignende analyse af tilsvarende immunhistokemiske resultater for p-Hsp27 og EMT-associerede markører taget fra tumorknuder af mus efter behandling med Qu kombineret med Cis afslørede en markant nedregulering af p-Hsp27, vimentin, Twist-1, og fascin- 1 og opregulering af E-cadherin i DRSPs sammenlignet med den gruppe, der ikke modtog behandling (figur 4D).

(A) En højere kapacitet for tumorgenicitet blev vist i DRSPs sammenlignet med kontrol- celler. (B) Størrelsen og mængden af ​​DRSP-inducerede tumorer var signifikant højere end dem af tumorer induceret af kontrolceller. Vækst forskelle i tumorerne genereret blev observeret i en tidsafhængig måde DRSPs vs. kontrol celler (

P

0,05). (C) Gross udseende af en repræsentativ tumor dannes via inokulering af parentale celler og dissocierede DRSPs i NOD /SCID-mus (n = 3 i hver gruppe). Mus behandlet med Qu kombineret med Cis oplyses statistisk signifikant væksthæmning i forhold til gruppen behandlet med Cis alene og kontrolgruppen (

P

0,05). (D) En sammenlignende analyse af tilsvarende immunhistokemiske resultater for p-Hsp27 og EMT-associerede markører taget fra tumorknuder af NOD /SCID-mus efter behandling med Qu kombineret med Cis afslørede en markant nedregulering af p-Hsp27, vimentin, vrid 1, og fascin-1 og opregulering af E-cadherin i DRSPs (forstørrelse, 100 ×).

diskussion

Cis kemoterapi er meget brugt til den kliniske behandling af fremskreden kræft. Det forbedrer prognosen og overlevelsen hos patienter med OSCC. Udviklingen af ​​Cis resistens er blevet betragtet som en væsentlig årsag til tumortilbagevenden, hvilket fører til svigt af kliniske behandling. Rolle CSCS inden tumorer i induktionen af ​​kemoresistens under kemoterapi er kendt [26]. Derfor synes afgørende for kontrol af sammenhængen mellem tilbagefald, Cis modstand, og CSCS i OSCC identifikationen af ​​den molekylære mekanisme, der medierer kemoresistens. I denne forbindelse har vi brugt en klæbende sfære kultur-system til at isolere celler med stamcelle egenskaber blandt Cis-resistente celler og genererede DRSPs. Under induktion af DRSPs, bemærkede vi et interessant og speciel EMT fænomen, som det fremgår af den gradvise morfologisk ændring fra forælder OSCC celler til DRCs. Dette indebærer, at DRCs besidder den egenskab at resistens via EMT. Tidligere undersøgelser har vist, at EMT er omdrejningspunktet mekanisme af cancer aggressivitet og har vist sig at korrelere med udviklingen af ​​kemoresistens [27] – [29]. Disse velformede DRCs med mesenchymale-lignende fænotype kan gennemgå yderligere sfære dannelse i en ikke-klæbende sfære kultur system. Den modgang mødt med kugler i en ikke-klæbende, ophængt tilstand kan ikke kun blive stimuleret af EMT men også tilskynde til indskrivning af potentialet i CSC egenskaber, som beskrevet i vores tidligere undersøgelse og andre [25], [30].

Baseret på vores studie, udover de morfologiske ændringer sammen med ændringerne i ekspressionen af ​​EMT-associerede markører, DRSPs blev karakteriseret ved opregulering af

ABCG2

MDR-1

. Disse to gener er velkendte og er udtrykt i en lang række CSCS som har været tjent som kemoresistent markører [9]. DRSPs viste også overekspression af CSC-repræsentative og stemness markører, herunder OCT4, NANOG, og Sox2, hvilket indikerer, at DRSPs udvise større Cis-modstand evne og stærkere CSC egenskaber end gøre kontrol OSCC celler. Disse data ikke blot vise, at DRSPs er en nyttig model for et lægemiddel resistens undersøgelse, men også give god dokumentation til støtte for den hypotese, at CSCS bidrager til resistens i tumorceller, som bevist ved vores undersøgelse, og også rapporteret af andre tidligere [25] , [31]. Ved at udnytte DRSPs som et studie model for medikamentresistens, vi fandt også en signifikant stigning i ekspressionen af ​​p-Hsp27 i DRSPs, der var negativt korreleret med ekspressionen af ​​CI-caspase 3 og CI-PARP-proteiner, hvilket indikerer, at p -Hsp27 kan deltage i lægemiddel-induceret antiapoptotisk effekt. Som tidligere nævnt, Hsp27 bidrager til de maligne egenskaber af cancerceller, herunder øget tumorgenicitet, modstandsdygtighed over for behandling, og inhibering af apoptose [32]. Prognose indikatorer, såsom Hsp27 som er tæt korreleret med patienternes overlevelse eller respons på behandling, kan tjene som nye terapeutiske mål baseret på deres kemoresistens ejendom [33]. Der er stigende tegn af den rolle, Hsp27 i lægemiddelresistens og CSC dannelse i en række forskellige kræftformer [29], [34]. Desuden er funktionen af ​​Hsp27 kontrolleres af posttranslationelle modifikation, såsom phosphorylering; p38 MAPK signalering er ansvarlig for phosphorylering af Hsp27, hvilket fører til dets funktionelle induktion [35]. I den aktuelle undersøgelse blev opregulering af phosphoryleringen af ​​Hsp27 via aktivering af p38 MAPK signalering observeret i DRSPs. Det foreslås, at aktiveringen af ​​Hsp27 udløses af en kanonisk p38 MAPK kaskade. Endvidere knockdown af Hsp27 i DRSPs faldt Cis modstand og induceret apoptose via aktivering af caspase-signalering. Taget sammen viser disse resultater, at blandt de mange signalveje, kan p38 MAPK-afhængig signalering være den kritiske mål for Hsp27. Derfor Hsp27 spiller en væsentlig rolle i Cis-resistente DRSPs, sandsynligvis via den antiapoptotisk signalvej. En yderligere undersøgelse tilmelding kliniske tilfælde i forbindelse med dårlig prognose med recidiverende eller metastatisk OSCC er i gang og har til formål at dissekere den særskilte rolle Hsp27 om lægemiddel-resistens i vævssnit ved immunhistokemi.

En nylig undersøgelse viste, at udtrykket af Hsp27 blev forøget i lunge CSCS og at behandling af disse celler med en kombination af cisplatin /gemcitabin kemoterapi og planten flavonoidforbindelse Qu inhiberede Hsp27 ekspression og undertrykte tumorvækst og ekspressionen af ​​stemness gener, herunder

Oct4

,

Nanog

, og

Sox2

[24]. En anden rapport viste, at Qu hæmmer klumpformet dannelse, celle overlevelse, og invasion i prostata cancer stamceller [36]. At forene rolle Qu som coadjuvans i OSCC og en inhibitor af Hsp27, vi yderligere valideret den hypotese, at Qu udøver sin apoptotisk aktivitet gennem undertrykkelse af varmechok faktor aktivitet og dens associerede molekylære signalering, hvilket er kritisk for OSCC, som rapporteret i andre cancere [34]. Konklusionen om, at Qu fungerer som et effektivt kemoforebyggende middel i OSCC var baseret på dokumentation for, at Qu øger aktiviteten af ​​caspase 3 og PARP, direkte påvirke downstream apoptosecyklus involverer Hsp27 /caspase 3 /PARP signalering. Vi viste, at Qu kan dæmpe udtryk for

ABCG2

og

MDR-1

gen-relaterede produkter i en dosisafhængig måde og vende ekspressionen af ​​EMT-associerede proteiner. Enten knockdown af Hsp27 eller anvendelse af Qu kombineret med Cis udøvede lignende apoptotiske virkninger, som det fremgår af nedregulering af p-Hsp27 og opregulering af CI-caspase 3 og CI-PARP i DRSPs. Desuden Qu kombineret med Cis signifikant inhiberede celleproliferation, migration og invasion, som var ledsaget af ændringer i ekspressionen af ​​fascin-1 og EMT-associerede proteiner i DRSPs. Endvidere Qu kombineret med Cis svækkede tumorigeniciteten af ​​DRSPs, angiver dens kraftige inhiberende virkning i reducering af tumorvækst og faldende lægemiddelresistens

in vivo

som følge af nedregulering af p-Hsp27 og ændringer i EMT fænomen. Til vores viden, nærværende undersøgelse er den første til at vise, at de specifikt designet DRSPs er vist sig at være en anvendelig model, der validerer den molekylære mekanisme, der ligger til grund for Hsp27-medieret resistens og den tilhørende behandlingsstrategi hjælp Qu som coadjuvans både

In vitro

in vivo

.

Som konklusion, vores undersøgelse giver et indblik i den mekanisme underliggende resistens i OSCC. Den p38 MAPK-Hsp27 aksen spiller en væsentlig rolle i CSC-medieret Cis modstand i kræft i mundhulen. Målretning denne akse ved hjælp af Qu kombineret med traditionel kemoterapi kan repræsentere en behandlingsstrategi for at forbedre prognosen for patienter med OSCC.