PLoS ONE: Nedsat TUSC3 Fremmer kræft i bugspytkirtlen spredning, Invasion og Metastasis

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen er en aggressiv sygdom med dystre prognose. Det er af afgørende betydning for at forstå de underliggende ætiologiske mekanismer og identificere roman, konsekvent, og nem at anvende prognostiske faktorer for præcision terapi. TUSC3 (tumor suppressor kandidat 3) blev identificeret som et potentielt tumorsuppressorgen og tidligere undersøgelse viste TUSC3 er nedsat hos bugspytkirtelkræft på mRNA-niveau, men dens formodede tumorsuppressorfunktion stadig at blive verificeret. I denne undersøgelse blev TUSC3 ekspression sig at være undertrykt både mRNA og protein niveauer i cellelinie modeller samt i kliniske prøver; faldt TUSC3 udtryk var forbundet med højere patologisk TNM mellemstationer og dårligere resultat. I tre par cellelinier med forskellig NF-KB-aktivitet blev TUSC3 ekspression sig at være omvendt korreleret med NF-KB-aktivitet. TUSC3-lyddæmpet bugspytkirtelkræft cellelinje udstillet forøget potentiale for spredning, migration og invasion. I en orthotopisk implanteret musemodel, TUSC3 tavshed celler udviste mere aggressiv fænotype med mere levermetastaser. Afslutningsvis den aktuelle undersøgelse viser, at faldet immunologiske TUSC3 farvningen er en faktor prognostisk af dårlig overlevelse i bugspytkirtlen kræftpatienter og faldt TUSC3 fremmer kræft i bugspytkirtlen celleproliferation, invasion og metastase. Det omvendte korrelation mellem NF-KB-aktivitet og TUSC3 ekspression kan foreslå en hidtil ukendt mønster for dette molekyle regulering

Henvisning:. Fan X, Zhang X, Shen J, Zhao H, Yu X, Chen Y, et al. (2016) Nedsat TUSC3 Fremmer kræft i bugspytkirtlen spredning, Invasion og metastase. PLoS ONE 11 (2): e0149028. doi: 10,1371 /journal.pone.0149028

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: August 1, 2015; Accepteret: 26 Jan 2016; Udgivet: 12 Februar 2016

Copyright: © 2016 Fan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Shanghai Municipal 415 Kommissionen for sundhed og familieplanlægning (Grant No.201440345 til Xiaoqiang Fan) [https://www.wsjsw.gov.cn/WSJ /]. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en aggressiv sygdom med dystre prognose. Det er den niende mest almindelige kræftform i verden, men rangerer fjerdedel af kræftrelaterede dødsfald [1], med cirka 227.000 mennesker dør af denne sygdom hvert år [2]. Kirurgisk resektion er fortsat den eneste mulighed for helbredelse. Ikke desto mindre er størstedelen af ​​patienterne opdaget på et senere tidspunkt på grund af specifikke symptomer, miste chancen for kurativ resektion. Selv de, der undergår resektion med helbredende hensigt vil generelt tilbagefald inden for to år [3]. Konventionelle kemoterapeutiske midler og de nye molekylære target medicin har beskedne virkninger på sygdomsforløbet [4-6], og kun lidt forbedre sygdomsfri overlevelse i en adjuverende behandling indstilling [3, 7]. Stratificering af patienter efter recidiv risiko vil hjælpe maksimere personalisering af intervention og forbedre terapeutisk effekt med minimale bivirkninger. I de senere år er der blevet etableret mange patologiske faktorer til forudsigelse prognose herunder tumorstørrelse, tumorklassificering, vaskulær invasion, lymfeknudemetastase og perineural invasion [8]. Systemisk inflammatorisk indeks og cirkulerende tumormarkører såsom CA199 blev også undersøgt for deres prognostiske værdi [9-12]. Der er også nogle molekylære markører, der vides at kunne forudsige behandlingseffekt og langsigtet resultat såsom Kras [13], EGFR, og Her2 /neu et al [14]. Men de er stadig utilstrækkelige til patienter rådgivning og individualiseret terapi. Det er af afgørende betydning for at forstå de mekanismer, der bidrager til udviklingen af ​​sygdommen og identificere roman, konsekvent, og nem at anvende prognostiske faktorer for præcision terapi.

TUSC3 (tumor suppressor kandidat 3), var identificeret som et potentielt tumorsuppressorgen tidligere. Det er beliggende på kromosom band 8p22, som ofte slettet i flere tumortyper, herunder prostata [15] og bugspytkirtelkræft [16-18]. Derfor er TUSC3 formodes at være et tumorsuppressorgen. Det er en homolog af gær Ost3p subunit af oligosaccharyltransferase (OST) kompleks, et integreret membranprotein kompleks, der katalyserer N-koblet glycosylering af proteiner i det endoplasmatiske reticulum (ER) [19, 20]. Senere, TUSC3 viste sig også at være involveret i Magnesium transport og oxidoreduktaseaktivitet [21]. Som N-glycosylering er et allestedsnærværende posttranslationel modifikation af eukaryote proteiner ved modulering proteinfoldning, beskytte dem mod nedbrydning, og regulere deres funktion samt deres immunogenicitet, reduceret TUSC3 formodes at være impliceret i cancer patogenese via glycosylering [22]. Krainer og hans kolleger testede TUSC3 udtryk i 143 prostata patienter ved hjælp af et væv microarray, og fandt, at 13,3% af vævsprøver skarp demonstreret reduceret protein udtryk for TUSC3, men opfølgning af kohorten undladt at vise TUSC3 indflydelse på progressionsfri eller samlet overlevelse [23]. I æggestokkene blev TUSC3 også at være signifikant nedreguleret højere kvalitet ovariecancerprøver [24]. Yderligere undersøgelse viste sine lave udtryk resultater fra TUSC3 promotor hypermethylering og status methylering af TUSC3 promotor har en betydelig og uafhængig indflydelse på progressionsfri og samlet overlevelse for patienter med ovariecancer [25]. Så tidligt som i 2005 blev homozygot og heterozygot sletning af TUSC3 gen opdaget i bugspytkirtelkræft cellelinjer og prøver med genomiske array-baserede undersøgelser [16]. Ikke desto mindre forbliver dens formodede tumorsuppressorfunktion at være præget i denne sygdom. Hvad der også mangler at blive afklaret, om dens udtryk er forbundet med klinisk-patologisk iscenesættelse og om det bærer en prognostisk værdi for denne kræft enhed.

Vores mål er at undersøge, om TUSC3 udtryk er forbundet med kræft i bugspytkirtlen klinisk-patologiske træk og repræsenterer en prognostisk faktor for denne cancersygdom og yderligere at karakterisere funktionen af ​​molekylet i patogenesen af ​​sygdommen under anvendelse af cellelinje-modeller og en musemodel

Materialer Metoder

Patienter Prøver

Paraffin-indlejrede prøver fra 117 patienter med kræft i bugspytkirtlen (PC), som gennemgik kirurgisk resektion mellem januar 2002 december 2012 vores hospital blev hentet. Prøver fra 69 mænd og 48 kvinder med en gennemsnitsalder på 60,2 år (range, 42 til 71 år, median alder, 61 år) findes. Den mediane opfølgning var 19 måneder (interval, 1 til 69 måneder.) Undersøgelsen var i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i 1975 Helsinki-deklarationen og blev godkendt af udvalget af etik Jimin Hospital, Shanghai, Kina. Alle patienter underskrev en skriftligt informeret samtykke med denne undersøgelse.

Immunhistokemi

5 um tykke vævssnit blev deparaffineret ved opvarmning ved 60 ° C og efterfølgende rehydratiseres i xylen og graduerede alkoholer. Antigen genfinding blev udført med Depp-9 epitopgenfinding opløsning, efterfulgt af behandling med 0,3% H

2O

2 i PBS (pH 7,4) for at standse endogen peroxidaseaktivitet. Efter blokering med 10% sekundært antistof værtsserum i 10 minutter, blev sektionerne inkuberet i primært antistof (kanin polyklonalt til TUSC3, fortynding 1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, UK) i 1 time ved stuetemperatur. Primært antistof fortyndinger blev fremstillet i 10% sekundært antistof værtsserum. Sektionerne, efter 2 × gange vask med PBS, blev inkuberet i respektive biotinylerede sekundære antistoffer [biotinyleret anti-kanin IgG (BA-10000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA], fortyndet 1: 200 i 10% serum i 30 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt med 45 minutters inkubering i StreptABComplex /HRP (K0377 Dako, Glostrup, Danmark). Snittene blev igen vasket to gange med PBS og inkuberet i Dako Liquid DAB + Substrat-kromogen System (K3468), indtil udviklingen af ​​brun farve. Dette blev efterfulgt af modfarvning med Meyers hematoxylin, dehydrering, og montering ved hjælp EUKITT medium.

Hver slide blev farvet i serielle snit og undersøges af 2 patologer. Intensiteten af ​​farvningen blev scoret som følger: 0, negativ; 1+, svag farvning; 2+, moderat farvning; 3+, stærk farvning. For semikvantitativ analyse blev H-score [26] anvendes i denne undersøgelse. Kort fortalt blev mere end 500 tumorceller talt i hvert tilfælde, og H-score blev efterfølgende genereret ved at addere værdierne af procentdele af stærk farvning ganget med 3 plus procentdel af moderat farvning multipliceret med 2 plus procentdel af svag farvning multipliceret med 1. , hvilket giver en mulig vifte af 0-300. H-score mere end 100 blev noteret som høj ekspression. Vi undersøgte også TUSC3 udtryk i lymfeknude (LN) metastaser i 24 sager, og sammenlignede TUSC3 udtryk forskelle mellem den primære læsion og lymfeknude metastaser. Ki 67 blev scoret på måden ifølge procentdel, dvs. mærkning indeks, uanset immunofarvning intensitet.

Cell dyrkningsbetingelser Salg

Femten humane PC cellelinier og en immortaliseret ikke-tumorigen pancreas epitelcellelinje ( HPNE) blev valgt til denne undersøgelse. Alle cellelinjer blev opnået som gaver fra Dr. Paul J. Chiao laboratorium i MD Anderson, Texas University. ASPC-1, AsPC-1 mu [27], MDA pan28, MDA P28 mu [28], BxPC-3, Colo357, L3.6pl, MiaPaCa-2, PANC-1, PTAC43, PTAC50, PTAC53, PTAC66, og Capan -1 Celler blev dyrket som et monolag cellekultur i DMEM indeholdende 4,5 mg /ml D-glucose og L-glutamin tilsat 10% føtalt bovint serum. HPNE celler blev dyrket i Medium D med en blanding af M3-medium og DMEM indeholdende et volumen M3 Base F dyrkningsmedium (Incell Corp., San Antonio, USA), tre volumener glucose DMEM, 10% FBS, 5,5 mM glucose , 10 ng /ml EGF, og 50 mg /ml gentamycin. The 293T-cellelinjen blev dyrket i komplet DMEM. HPNE /Kras /p16shRNA og HDPE /Kras /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA var kræft i bugspytkirtlen cellelinier (en gave fra Dr. Paul J. Chiao laboratorium, The University of Texas MD Anderson Cancer Center) ved transfektion af relevant plasmidet i HPNE og HDPE celle henholdsvis [29]. Æske med HDPE /Kras /Her2 /p16shRNA /smad4shRNA celler blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium.

Celleproliferation og klongenicitetsassayet

I cellen vækstkurve assay celler blev udpladet i 24-brønds plader (1 × 10

4 celler /brønd) i tre eksemplarer i vækstmedium. Celler blev talt på dag 1, 3, og 5. Resultater blev udtrykt som middel ± standardfejl på middelværdien fra tre uafhængige forsøg. For at teste clonogenecity af TUSC3 tavshed PC celler, trypanblåteksklusion testede levedygtige TUSC3 knockdown cellelinier og de scramble kontrolceller blev udpladet (100 /brønd) i en seks-brønds plade og derefter inkuberet i ca. 10-12 dage ved 37 ° C i en CO 5%

2/5% O

2/90% N

2 inkubator. Kolonierne blev farvet med 2% krystalviolet. Et repræsentativt felt for hvert forsøg blev fotograferet ved 100 × forstørrelse. Mindst tre uafhængige assays blev udført tre gange. Data blev vist som middelværdien af ​​antallet af kolonier /pr felt ± standardafvigelsen på middelværdien fra tre uafhængige forsøg.

Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellerne ved at anvende TRlzol ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen). RNA kvalitet og kvantitet blev målt ved en ND-2000 spektrofotometer (NanoDrop). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af PrimeScript RT Master Mix (Bio-Rad). cDNA (20 ng) blev udsat for real-time PCR udført med SYBR reagenser under anvendelse af IQ5 PCR-system (Bio-Rad, Hercules, CA). β-actin blev anvendt som intern kontrol genet. Specifikke primere blev syntetiseret af Sigma-Aldrich og sekvenserne blev beskrevet som følger: hTUSC3: forward primer: 1275-AGACGGATAATTTGCCTAGTGGG-1297, revers primer: 1417-AGTGCCATGGTCCAAATCACA-1397. Plottet sammenligner relative ekspressionsniveauet af mRNA i adskillige pancreatiske tumorcellelinier sammenlignet med den immortaliserede ikke-tumorigene pancreas epitelcelle HPNE. Hvert eksperiment blev udført tre gange, og hver gang med tre gentagelser.

Lentiviral transduktion

Knockdown af TUSC3 i bugspytkirtelkræft cellelinje Colo357 blev udført ved lentiviral levering hjælp Plko.1 vektor indeholdende TUSC3 shRNA ( SKU: SR305331, OriGene Technologies, CO USA), og HEK293T pakkecellelinien.. Transducerede celler blev selekteret og opretholdt i medium indeholdende puromycin (3 ug /ml).

Matrigel assay

50.000 celler blev udsået in triplo på en 24-brønds plade med modificerede Boyden kamre (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Det nedre kammer indeholdt 10% FCS /dyrkningsmedium som kemoattraktant. Cellerne blev inkuberet i 18 timer, farves med krystalviolet og talt under et mikroskop.

Immunoblotting

Celler blev lyseret med RIPA buffer suppleret med komplet proteaseinhibitorcocktail Tabletter (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland ) og PhosSTOP Phosphatase-cocktail Tabletter (Roche Diagnostics). Efter inkubation i 10 minutter på is blev cellelysater klares ved centrifugering ved 15.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-absorbans-assay (Sigma-Aldrich). Ens mængder af proteinlysater (40 pg) blev separeret ved SDS-PAGE, blottet på PVDF-membraner (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK), inkuberet med det passende primære antistof og peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer og detekteret med forøget kemiluminescens påvisningssystem (Pierce ECL Western Blotting Substrate, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Følgende antistoffer og fortyndinger blev anvendt: p-actin (1: 500, sc-1616 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), TUSC3 (1: 300, ab65213, Abcam, Cambridge, UK).

Dyr og ortotop Implantation af pancreas tumorceller

Balb /C nøgne mus blev købt fra Animal Production området med National Cancer Institute Frederick Cancer Research og Development center (Frederick, MD). Musene blev opstaldet under specifikke patogenfrie betingelser, der er godkendt af den amerikanske Association for akkreditering af Laboratory Animal Care og i overensstemmelse med gældende regler og standarder for det amerikanske Department of Agriculture, US Department of Health og Human Services, og National Institutes Sundhedsstyrelsen. Musene blev anvendt i overensstemmelse med institutionelle retningslinier, da de var 8 til 12 uger gamle.

At producere pankreatiske tumorer, TUSC3 tavshed PC celler blev høstet fra subkonfluente kulturer af en kort udsættelse for 0,25% trypsin og 0,02% EDTA . Trypsinisering blev standset med medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, og cellerne blev vasket en gang i serumfrit medium og resuspenderet i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS). Kun suspensioner bestående af enkeltceller med mere end 90% levedygtighed blev anvendt til injektionerne. En million celler suspenderet i 50 pi HBSS blev injiceret i pancreas fra nøgne mus som beskrevet tidligere. Musene blev aflivet efter 5 ugers injektion og obduceret. Størrelsen og vægten af ​​levermetastaser blev registreret.

Statistisk analyse

Alle statistiske beregninger blev udført ved hjælp af Graph Prism 5.0 software (San Diego, CA, USA). Cox regression blev udført med SPSS-version 19.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Sammenligning af midler i normalfordelte data blev udført under anvendelse Students ‘t-test ellers ikke-parametriske Mann-Whitney U test blev anvendt eller som anført. P-værdier lig med eller mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle søjlediagrammer er afbildet med midler og standardafvigelser som fejllinjer, medmindre andet er angivet.

Resultater

TUSC3 udtryk i kliniske prøver

immunhistokemisk, TUSC3 er fraværende i bugspytkirtlen stroma celler, men næsten alle pankreatiske duktale epitelceller, acinære celler og øer viste immunreaktivitet (fig 1A og 1C). Vi evaluerede sammenhængen mellem udtryk data og kliniske parametre, herunder patientens alder, køn, tumorstørrelse, placering, klasse, primær tumor klassifikation (PT), lymfeknudemetastase (PN), fjernmetastaser (pM). TUSC3 ekspression blev observeret i forskellige grader i pancreas carcinomceller i cytoplasma (Fig 1B og 1C). TUSC3 blev påvist i 38/117 (32,48%) pT prøver med H-score 83,42 ± 2,882, i 14/58 (24,14%) pN prøver med H-score 66,81 ± 4,265, og i 4/11 (36,36%) pM prøver med H-score 79,55 ± 7,818. Ekspressionen af ​​TUSC3 er faldet drastisk i metastatiske LN sammenlignet med de parrede primære tumor prøver (H-score: p 0,001). (Fig 1D)

(A) TUSC3 udtryk i ikke-neoplastiske pancreas væv (acinære , kanal og holme). (B) TUSC3 udtryk i bugspytkirtelkræftceller. (C) Lav TUSC3 udtryk i bugspytkirtelkræftceller forhold til holme. (D) Sammenligning af TUSC3 farvning i primær PC og LN metastase (parret t-test, p 0,001, n = 58). Original forstørrelse × 200.

Nedsat TUSC3 udtryk er forbundet med højere patologisk TNM mellemstationer og dårlig prognose

Alt i alt 69 mandlige og 48 kvindelige patienter med PC blev inkluderet i denne undersøgelse kohorte. Den gennemsnitlige alder ved diagnose var 64,6 ± 10,3 år. Median overlevelse var 19 måneder (interval: 3-78 måneder). Tumoren fase defineres som T

1N

0M

0 i 8 patienter (6,84%), T

2 N

0M

0 i 20 patienter (17,09%), T

3N

0m

0 i 24 patienter (20,51%), T

1N

1M

0 i 9 patienter (7,69%), T

2 N

1M

0 i 18 patienter (15,38%), T

3N

1M

0 i 21 patienter (17,95%), T

4 N

0m

0 i 2 patienter (1,71 %), T

4N

1M

0 i 4 patienter (3,42%), T

2-3N

0M

1 i 5 patienter (4,27%) og T

1-4N

1M

1 i 6 patienter (5,13%). 101 patienter fik kemoterapi, herunder 75 patienter, som fik adjuverende kemoterapi, og 26 patienter, som fik palliativ kemoterapi. For 11 patienter med levermetastaser opdaget under drift blev alle synlige metastatiske læsioner fjernet.

Forholdet mellem TUSC3 ekspressionsniveau og klinisk-patologiske karakteristika patienter med PC er vist i tabel 1. Lav TUSC3 ekspression var forbundet med større tumorstørrelse (p = 0,039), højere serum CA199 niveau (p = 0,034), mere lymfatisk permeation (p = 0,031), og højere Ki-67 mærkning indeks (p 0,001)

Til. undersøge, om TUSC3 proteinekspression niveau og andre klinisk-patologiske faktorer er forbundet med kliniske resultat af PC patienter, univariate og multivariate Cox proportional hazard modeller for CSS (Cancer Specific overlevelse) og RFS (Gentagelse overlevelse) blev beregnet. Blandt de 117 patienter, døden indtraf i 62 af 79 (78,5%) patienter med lav TUSC3 proteinniveau og i 22 af 38 (57,9%) patienter med høj TUSC3 proteinekspression niveau (P 0,021). Figur 2A viser Kaplan-Meier-kurver for CSS og afslører, at lave TUSC3 niveau er en faktor prædiktiv for dårlig prognose i PC-patienter (p = 0,0416, log-rank test). Blandt de 117 patienter, gentagelse forekom i 69 af 79 (87,3%) patienter med lav TUSC3 proteinniveau og i 24 af 38 (63,2%) patienter med høj TUSC3 proteinekspression niveau (p 0,0001). Figur 2B viser Kaplan-Meier-kurver for RFS og afslører, at lave TUSC3 niveau er en faktor prædiktiv for større risiko for tilbagefald i PC-patienter (p = 0,0043, log-rank test).

immunhistokemisk farvning af TUSC3 er forbindelse med den samlede overlevelse (A) og tilbagefald overlevelse (B) indlæg helbredende resektion af kræft i bugspytkirtlen

univariat analyse identificeret høj tumor stadie (fase i + II vs III vs IV P 0,001)., højt serum CA199 niveau (CA199 300IU /ml vs CA199≥00IU /ml, p = 0,034), ingen administration af kemoterapi (kemoterapi vs ingen behandling, p = 0,025), og nedsat TUSC3 udtryk niveau (p = 0,015) som dårlig prognostisk faktorer for RFS i denne undersøgelse kohorte. Og disse faktorer er også prædiktiv for dårlig samlet overlevelse i denne kohorte. Køn, alder ved diagnose og tumor klasse var ikke signifikant associeret med klinisk resultat (tabel 2).

For at bestemme den uafhængige prognostiske værdi af TUSC3 for CSS og RFS, en multivariat analyse ved hjælp af en Cox proportional hazard model blev udført. I den multivariate analyse, der omfattede alder, tumor klasse, tumor stadie, administration af kemoterapi, serum CA199 niveau og TUSC3 ekspressionsniveauet, vi identificeret tumor stadie, administration af kemoterapi, og lav TUSC3 proteinekspression niveau som uafhængige prognostiske faktorer for CSS og RFS ( TUSC3 udtryk for RFS, p = 0,020; TUSC3 udtryk for CSS, p = 0,027, tabel 2)

TUSC3 udtryk er faldet i bugspytkirtelkræft cellelinjer medieret af NF-KB

for at karakterisere.

in vitro

funktion af TUSC3, vi først undersøgt TUSC3 udtryk for forskellige bugspytkirtelkræft cellelinjer. Real-time PCR afslørede TUSC3 blev reduceret på mRNA niveau i alle de testede 11 pancreatiske tumor cellelinier (fig 3A). Western Blotting afslørede, at det også var deprimeret på proteinniveau i disse cellelinjer (Fig 3B).

TUSC3 er faldet i bugspytkirtelkræft cellelinjer både på mRNA-niveau (A) og protein niveau (B).

for at undersøge, om TUSC3 udtryk er korreleret med NF-KB-aktivitet, vi undersøgte TUSC3 udtryk både på RNA-niveau og protein niveau i tre par bugspytkirtelkræft cellelinjer med forskellige NF-KB-aktivitet. AsPC-1 mu er en datter celle fremstillet af Paul J. Chiao et al ved transfektion IκBαM (S32,36A) ind den parentale pankreatisk cancercellelinie AsPC-1, hvilket resulterer i en tumorcellelinie med nedsat NF-KB-aktivitet og nedsat lever- metastaser potentiale [27]. I dette par celle model, blev det påvist, at TUSC3 ekspression af AsPC-1 mu er højere end den for AsPC-1 (fig 4A), hvilket antyder, at TUSC3 reguleres af NF-KB-aktivitet. Det samme ekspressionsmønster er fundet i et andet par af cellelinier, MDA P28 og MDA P28 mu (Fig 4B). MDA P28 mu er en datter cellelinie også produceret i Dr. Paul J. Chiao laboratorium ved transfektion IκBαM (S32, 36A) Iκ mu i MDA P28 cellelinie, hvilket resulterer svækket NF-KB-aktivitet og undertrykt levermetastaser (data ikke offentliggjort). TUSC3 ekspression er forøget i MDA P28 mu sammenlignet med MDA P28. L3.6pl er en datter cellelinje med meget mere potentiale levermetastaser fra hinanden følgende injektioner af forældrenes Colo357 i nøgne mus. Det blev demonstreret tidligere, at L3.6pl udviser højere NF-KB-aktivitet end Colo357 [30]. Og interessant, TUSC3 ekspression er højere i Colo357 end i L3.6pl både mRNA og proteinniveau (figur 4C). Alle disse tre par cellelinier syntes at vise det samme mønster af TUSC3 ekspression i relevans for NF-KB-aktivitet som indebærer, at TUSC3 negativt korreleret med NF-KB-aktivitet.

(A) AsPC-1 og AsPC -1 mu med deprimeret NF-KB-aktivitet. (B) MDA P28 og MDA P28 MU med deprimeret NF-KB-aktivitet. (C) Colo357 og datter L3.6pl cellelinjen med forbedret NF-KB-aktivitet. For hver figur, venstre graf repræsenterer RT-PCR resultat, højre graf repræsenterer Western blot for TUSC3.

Nedsat TUSC3 fremmer celleproliferation, migration og invasion

For at undersøge tumor undertrykkende funktion af TUSC3 blev shRNAs designet til at knockdown ekspression af TUSC3 i

in vitro

bugspytkirtelkræft model. Som parentale cellelinje af en meget metastatisk dattercelle med sammenlignelige NF-KB aktiviteter blev Colo357 valgt af følgende eksperiment. Både mRNA og protein niveauer blev påvist at bekræfte effektiviteten af ​​silencing (fig 5A og 5B). Vi undersøgte effekten af ​​TUSC3 tavshed på celleproliferation, kolonidannelse, migration og invasion betingelser. Især Efter 72 timer af dyrkning, tjente de TUSC3 tavshed celler en betydelig overlevelse fordel i modsætning til kontroller (Fig 5C og 5D). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011). Flere og større kolonier dannet for TUSC3 tavshed tumorceller (fig 5E og 5F). Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). Derefter blev Matrigel baseret assay anvendes til at analysere virkningerne af TUSC3 knockdown om migration og ekstracellulære matrix (ECM) invasion af bugspytkirtelkræftceller. Med 10% FCS som lokkemiddel, TUSC3 tavshed celler udviste øget migration og invasiv gennem indsatsen membranen i modsætning til kontrol-celler (Fig 5G, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001 Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001; Fig 5H og 5I, Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001)). En sårhelende assay understøttes yderligere af disse resultater, som viser øget migration og deraf følgende forbedret lukning af epithel- monolag af celler i lavt serum betingelser (5% FCS) efter 18 timer (fig 5J).

(A, B ) TUSC3 er effektivt bankede-down i Colo357 cellelinier vist med (A) RT-PCR og (B) Western-blot. (C, D) Proliferation er forbedret med TUSC3 knockdown, celle nummer tæller er signifikant forskellige på 72 timer (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p = 0,0086, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p = 0,0011) (D). (E, F) Colony Formation er forbedret med TSUC3 knockdown (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (G) Migration Test (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (H, I) Invasion Test (Colo357 TUSC3 shRNA2 vs Colo357 Scramble p 0,0001, Colo357 TUSC3 shRNA3 vs Colo357 Scramble p 0,0001). (J) sårheling test viste hurtigere lukning af hullet i TUSC3 tavshed celler. Alle forsøg blev udført tre gange med repræsentative tallene som ovenfor.

Nedsat TUSC3 fremmer levermetastaser i ortotopisk implanteret musemodel

For yderligere at undersøge effekten af ​​TUSC3 på PC metastase, vi injiceret TUSC3 tavshed tumorceller orthotopisk i pancreas i nøgne mus og etablerede dyremodeller. Fem uger efter injektion af Colo357 shRNA2 og Colo357 shRNA3 celler, alle musene blev syge og blev aflivet. Fra billeder kan vi tilsyneladende se levermetastaser af TUSC3 tavshed tumor er større end kontrollen én (Fig 6A). Derefter levermetastaser blev vejet og sammenlignet med t-tekst, Colo357 shRNA2 vs Colo357 Scramble (p = 0,0444), Colo357 shRNA3 vs Colo357 Scramble (p = 0,0443). Tilsammen TUSC3 tavshed celler udviste mere aggressiv fænotype med mere metastase forekommer i lever efter musene blev aflivet. Vi udførte IHC samt RT-PCR at sammenligne TUSC3 plan mellem den primære foci og metastatiske læsioner fra ortotopisk injicerede model prøver. Sammenlignet med prøver fra mus injiceret med TUSC3 scramble cellelinjer, der fra TUSC3 shRNA2 og TUSC3 shRNA3 show faldt ekspressionsniveauer af TUSC3 både med IHC (S1 Fig) og på mRNA-niveau (S2 Fig).

(A) Gross udseende resektion lever prøver fra mus injiceret med to grupper af TUSC3 tavshed PC (Colo357 shRNA2 og Colo357 shRNA3) og kontrol (Colo357 Scramble). Store levermetastaser er synlige i gruppen Colo357 shRNA2 og Colo357 shRNA3. (B) De levermetastaser blev vejet og sammenlignet ved hjælp af t-test.

Diskussion

Den aktuelle undersøgelse viser, at TUSC3 udtryk er nedsat i bugspytkirtelkræft primære prøver og dets nedregulering er prognostisk af dårlig langsigtede resultat.

In vitro

cellelinje undersøgelse og

in vivo

dyremodel giver direkte beviser tyder rolle tumorsuppressorfunktion i bugspytkirtelkræft initiering og progression. Endvidere undersøgelsen afslører, TUSC3 ekspression formindskes med forbedret NF-KB-aktivitet, indikerer en ny regulering model for dette molekyle.

Selvom det er blevet rapporteret TUSC3 mRNA reduceres i bugspytkirtelkræft prøver sammenlignet med den tilstødende ikke -cancerous væv, og tilbagevendende tab af 8p22, som indeholder TUSC3 genet findes i bugspytkirtelkræft [17, 18], er der ikke tidligere undersøgelse nogensinde opdaget TUSC3 udtryk på proteinniveau i sygdommen. Dette er i virkeligheden helt nødvendigt, da protein er den egentlige eksekutor af genet og genetisk information. I denne undersøgelse har vi ikke kun detekteret TUSC3 mRNA under anvendelse cellelinjer, men også detekteret dets ekspression på proteinniveauet med immunhistokemi i kliniske prøver og western blotting i cellelinier. Resultaterne er konsistente og bekræftede, at TUSC3 er dramatisk deprimeret i bugspytkirtelkræft, både i primære prøver og i tumorcellelinjer, både på mRNA-niveau og proteinniveau. Mere interessant, TUSC3 havde omvendt korrelation med NF-KB-aktivitet i det mindste i nogle pancreatiske tumorcellelinjer og er i konsistens med de forskellige grader af malignitet. IκBαM-transficerede AsPC-1 mu og MDA P28 mu er mindre malign med svækket NF-KB-aktivitet, og deres TUSC3 ekspression øges. Det er bemærkelsesværdigt, at denne negative forhold også er fundet i et andet par af cellelinier, for hvilke datter cellelinien blev erhvervet via konsekutive injektioner af parentale cellelinje i nøgne mus frem for ved transfektion manipulation. Alle disse resultater antyder TUSC3 ekspression kan reguleres ved NF-KB-aktivitet, i det mindste i nogle tumorcellelinjer. Tidligere har TUSC3 nedregulering blevet påvist på grund af homozygot og heterozygot deletion i prostatacancer, promotor hypermethylering i ovariecancer [25]. Selv om det ofte viser sig at blive slettet i bugspytkirtelkræft [16-18], vores resultater tyder på en roman transkriptionel regulering for dette molekyle i denne kræft enhed. Det er muligt, at TUSC3 Nedregulering mekanismer variere afhængigt af forskellige tumortyper. For eksempel viste tidligt studie TUSC3 ikke hypermethyleret i kolorektal cancer [31], men hypermethylering er den største mekanisme for TUSC3 nedregulering i kræft i æggestokkene, og selv bærer en prognostisk værdi [25]. Det er også muligt at TUSC3 ekspression kan reguleres af forskellige midler selv i den samme tumortype afhængigt af forskellige patienter eller cellelinier. Det betyder ikke udelukke andre mulige mekanisme for regulering, såsom mikro-RNA-medieret lyddæmpning.