PLoS ONE: Ekspression af androgen receptor splejsningsvarianter i Prostata Cancer knoglemetastaser er associeret med Kastration-Modstand og Short overlevelse

Abstrakt

Baggrund

grundlæggende aktiv androgen receptor varianter (AR-V) mangler ligandbindingsdomænet (LBD) kan fremme udviklingen af ​​kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Ekspressionen af ​​AR-Vs i klinisk vigtigste metastatisk site, knoglen, har imidlertid ikke været veldokumenteret. Vores mål var derfor at sammenligne niveauer af AR-Vs i hormon-naive (HN) og CRPC knoglemetastaser i forhold til primær PC og ikke-malign prostata væv, såvel som i forhold til AR proteinekspression hel-genom transskriptionsprofiler og patient overlevelse.

Metodologi /vigtigste resultater

hormon-naive (n = 10) og CRPC knoglemetastaser prøver (n = 30) blev opnået fra 40 patienter på metastaser kirurgi. Ikke-maligne og maligne prostata prøver blev erhvervet fra 13 prostatectomized mænd. Niveauer af fuld længde AR (ARfl) og AR-Vs betegnet AR-V1, AR-V7, og AR-V567es mRNA blev målt med RT-PCR og hel-genom transskriptionsprofiler med en Illumina Beadchip array. Protein niveauer blev undersøgt ved Western blotting og immunhistokemi. blev påvist Afskrifter for ARfl, AR-V1, og AR-V7 i de fleste primære tumorer og metastaser, og niveauer blev øget betydeligt i CRPC knoglemetastaser. AR-V567es udskrift blev påvist i 23% af de CRPC knogle kun metastaser. En undergruppe af CRPC knoglemetastaser udtrykte LBD-trunkerede AR proteiner på niveauer kan sammenlignes med ARfl. Detekterbar AR-V567es og /eller AR-V7-mRNA i den øvre kvartil, set i 1/3 af alle CRPC knoglemetastaser, var forbundet med en høj score nukleart AR immunfarvning, forstyrret cellecyklusregulering og korte overlevelse.

konklusioner /Signifikans

Ekspression af AR-vs er forøget i CRPC sammenlignet med HN knoglemetastaser og forbundet med et særligt dårlig prognose. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at teste, om patienter, der udtrykker en sådan AR-Vs i deres knoglemetastaser større fordel af lægemidler, der virker på eller ned-strøm af disse AR-Vs end fra behandlinger hæmmer androgen syntese

Henvisning:. Hornberg E, Ylitalo EB, Crnalic S, Antti H, Stattin P, Widmark A, et al. (2011) Ekspression af androgen receptor splejsningsvarianter i Prostata Cancer knoglemetastaser er associeret med Kastration-Modstand og Short Survival. PLoS ONE 6 (4): e19059. doi: 10,1371 /journal.pone.0019059

Redaktør: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Februar 25, 2011; Accepteret: 23. marts 2011; Udgivet: 28 April, 2011

Copyright: © 2011 Hornberg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den svenske Cancer Society, Research Council svenske, Lions Cancer Research Foundation, og Nordsverige Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Androgener regulerer normal vækst og differentiering prostata væv, gennem aktivering af androgenreceptorer i epitel og stromaceller, og spiller også en vigtig rolle i alle faser af prostatacancer (PC) vækst. Den standardbehandling for patienter med fremskreden PC er derfor at reducere androgener, enten ved kirurgisk eller medicinsk kastration. Efter en periode med indledende remission tumorer med tiden tilbagefald, overvejende i knoglen, og derefter betegnes kastrationsresistent PC (CRPC). De mekanismer, der styrer CRPC vækst i knoglemetastaser er dog stort set ukendt, og sjældent udforsket ved faktisk at undersøge sådanne metastaser hos patienter.

Interessant, androgen receptor (AR) er almindeligt aktiv i CRPC trods kastrationsniveauer af cirkulerende testosteron [1 ], [2] og intens nukleare AR immunfarvning i CRPC knoglemetastaser er relateret til en særlig kort overlevelse [3]. Forskellige mekanismer er blevet foreslået at bidrage til AR aktivering i CRPC, herunder intracrine syntese af androgener, genetiske og epigenetiske ændringer af AR, hvilket gør det mere følsomme over for aktivering med androgener eller andre ligander [1], [4], [5] og ekspression af konstitutivt aktive AR varianter (AR-V, se nedenfor). Disse resultater tyder på, at CRPC kan med held behandles med nye lægemidler nu i kliniske forsøg, der blokerer androgen syntese eller AR i metastaser (revideret i [6]), men at konstitutivt aktive receptorer kan stadig være et problem. Der er derfor behov Undersøgelser til at udforske, hvis disse AR-Vs almindeligt udtrykkes i CRPC knoglemetastaser eller ej.

Strukturelt mennesket

AR

gen er sammensat af otte exons koder en 110 kDa-protein, der består af en NH

2-terminalen trans-aktiveringsdomæne (NTD), et DNA-bindende domæne (DBD), en hængselregion, og COOH terminale domæne (CTD) som også er den ligand-bindende domæne (LBD) [7]. LBD, der kodes af exon 4-8, ikke er essentiel for transkriptionel aktivitet [8]. Trunkeret AR-Vs mangler LBD og foreslås at være konstitutivt blevet påvist aktive receptorer i PC cellelinier samt i kliniske prøver, herunder godartede, maligne og metastatiske væv, som skyldes alternativ splejsning eller non-sense mutationer af det humane

AR

gen [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Øget AR-splejsningsvarianter er blevet påvist i CRPC sammenlignet med hormon-naive (HN) PC [13], [14], [16]. Disse undersøgelser omfattede CRPC prøver fra primære tumorer ved kirurgi eller bløddele metastaser og et par knoglemetastaser indsamlet ved obduktion. Ekspressionen af ​​AR-Vs i klinisk mest relevante metastatisk site, knoglen, ikke er veldokumenteret.

Formålet med denne undersøgelse var derfor at analysere ekspression af fuldlængde AR (ARfl) og dens klinisk mest rigelige splejsningsvarianter her betegnet AR-V1, AR-V7 [14] (også benævnt AR3 [13], [17], og AR-V567es [16] i HN og CRPC knoglemetastaser i sammenligning med ekspression i primære PC og i ikke-maligne prostata væv. Desuden AR transkriptniveauer var relateret til AR proteinekspression, hel-genom transskription profiler og klinisk resultat.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af den lokale etik revision bestyrelse Umeå Universitet, og deltagerne gav skriftlig eller mundtlig samtykke.

Patienter

knoglemetastaser blev opnået fra en serie af frisk frosset og formalin fikseret paraffin indlejret biopsier indsamlet fra patienter med PC opereret for metastatisk rygmarvskompression eller patologiske frakturer på Umeå Universitetshospital (2003-2009). Disse patienter er blevet grundigt beskrevet i [3] og kliniske karakteristika og terapier er sammenfattet i tabel 1. Undersøgelsen omfatter også 13 patienter, som blev behandlet med radikal prostatektomi ved Umeå Universitetshospital, mellem feb 2005 og september 2006. Median alder for patienterne var 60 år (spændvidde 48-68 år) og median PSA var 6,6 ng /ml (interval 3,5-24 ng /ml). Elleve af patienterne havde tumorerne klassificeret som Gleason score (GS) 7 og to som GS 8. Fire af tumorerne var i trin T2 og ni i trin T3. Umiddelbart efter kirurgisk fjernelse af prostata blev bragt til patologien afdeling og skåret i 0,5 cm tykke skiver. Ud fra disse skiver 20 prøver blev udstanset fra hvert prostata under anvendelse af en 0,5 cm stålcylinder og nedfrosset i -70 ° C inden for 30 minutter efter operationen. Prostata skiver blev derefter fikseret i 4% formaldehyd i 24 timer, dehydrerede, indlejret i paraffin, skåret i 5 mikron tykke sektioner og farvet med hematoxylin-eosin. Arten af ​​de frosne vævsprøver (ikke-malign eller malign) blev bestemt ved deres beliggenhed på hel-mount sektioner, men også bekræftet ved lysmikroskopi af hematoxylin /eosin-farvede kryostatsnit fra hver af vævsprøverne analyseret som beskrevet nedenfor . I disse afsnit procentdelen af ​​tumorvæv blev kvantificeret og tumoren GS fastlagt.

Tissue forberedelse og RNA-ekstraktion

Repræsentative områder af knoglemetastaser, primær PC og ikke-maligne prostata væv blev cryo-snit i udvinding rør og RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-protokol (Invitrogen, Stockholm, Sverige). Procentdelen af ​​tumorceller i prøverne varierede mellem 25-95%. RNA-koncentrationer blev kvantificeret ved absorbansmålinger ved anvendelse af et spektrofotometer (ND-1000 spektrofotometer; NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE). RNA kvalitet blev analyseret med 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og verificeret til at have en RNA-integritet nummer ≥6.

Real time RT-PCR

To- hundrede (200) ng RNA blev tilbageført transkriberet med Superscript II revers transkriptase (Invitrogen) i et totalt volumen på 10 pi. Den efterfølgende PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af Biorad iQ5 iCycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Reaktioner blev udført i et 20 pi volumen under anvendelse IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories). De følgende primersæt blev anvendt; ARfl: 5′-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ‘og 5′-AGCTTCTGGGTTGTCTCCTCAGTGG-3′, AR-V1: 5’-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ‘og 5′-CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT-3′, AR-V7: 5’-CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC-3 ‘og 5’-TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT-3 ‘, og AR-V567es: 5′- CCAAGGCCTTGCCTGATTGC og 5′-TTGGGCACTTGCACAGAGAT-3′, hvilket resulterer i amplikoner af 143, 145, henholdsvis 125 bp, som tidligere beskrevet [14], [16]. Primere til husholdning genet RPL13A (5’-GTACGCTGTGAAGGCATCAA-3 ‘og 5’GTTGGTGTTCATCCGCTTG-3’) amplificerede en 125 bp fragment. Hver prøve blev kørt in duplo og korrigeret for tilsvarende RPL13A niveauer. Smeltekurveanalyse bekræftede de amplificerede produkter, som også blev analyseret ved 1% agarosegelelektroforese for at bekræfte den forventede størrelse (data ikke vist).

Western blot-analyse

frisk frosset knoglemetastaser og prostata prøver blev cryo-snit og proteiner blev ekstraheret fra 20 sektioner (10 uM hver) ved hjælp af AllPrep Mini kit, ifølge producentens instruktioner (Qiagen, Hilden, Tyskland). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-protein-assayet (Pierce Chemical Co., IL, USA). 22RW1 celler blev opretholdt i overensstemmelse med producentens instruktioner (ATCC) og proteiner blev ekstraheret som tidligere beskrevet [18].

Prøver (20 ug protein) var adskilt af 7,5 SDS-PAGE under reducerende betingelser og derefter overført til PVDF-membraner (Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA). Membranerne blev farvet med Ponceau rød at bekræfte lige prøve lastning og overførsel (resultater ikke vist). Membraner blev derefter blokeret i 5% mælk efterfulgt af anti-AR antistofinkubationer; N-20 (fortyndet 1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller PG-21 (fortyndet 1:1000, Upstate, Lake Placid, NY) for at detektere ARfl og AR-Vs, og C-19 (Santa Cruz) for at detektere ARfl men ikke ar-vs mangler LBD. Primære antistoffer blev fortyndet i 1% mælk /PBST og inkuberet i 4 ° C natten over. Det sekundære anti-kanin IgG (Dako, Glostrup, Danmark) antistof (fortyndet 1:20 000 i 2,5% mælk) blev påført efter vask i PBST og inkuberet i 1 time i RT. Proteinekspression blev visualiseret efter omfattende vask ved hjælp af ECL Advanced afsløring kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og kvantificeret med en ChemiDoc scanneren og Mængde One 4 software (Bio-Rad Laboratories).

Immunhistokemi

de knoglemetastaser undersøgt i denne undersøgelse er tidligere blevet immunfarvet for AR, Ki67 (celledeling), aktiveret caspase 3 (apoptotiske celler) og PSA-antigener (tabel 2) følgende protokoller, der er beskrevet før [3]. Nuklear AR og cytoplasmatiske PSA immunfarvning blev bedømt ifølge intensitet (0, 1, 2 eller 3) og fraktion af farvede celler (0, 1, 2, 3 eller 4). En total score (i området fra 0-12) blev opnået ved at multiplicere farvningsintensiteten og fraktion scores. En komplet AR score på 8 eller derover (median og ovenfor) er tidligere blevet defineret som høj og fundet at være forbundet med en kortere overlevelse efter ortopædisk kirurgi metastase end en AR samlet score under 8 [3]. En PSA score på 8 og nedenfor (median og nedenfor) var forbundet med en ugunstig resultat i CRPC patienter [3]. Fraktionerne (%) af Ki67 og aktive caspase 3 farvede tumorceller blev tidligere bestemt og fundet ikke at være forbundet med resultat i denne patient materiale [3].

genanalyse

To hundrede halvtreds (250) ng af total RNA per prøve blev anvendt til cRNA produktion af Illumina TotalPrep RNA-amplifikation kit (Ambion Inc., St. Austin, TX, USA) i overensstemmelse med billede protokol. Kvaliteten af ​​cRNA blev evalueret under anvendelse af RNA 6000 pico kit (Agilent Technologies) og Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). I alt 750 ng cRNA blev anvendt til hybridisering til en human HT12-v3 Illumina Beadchip genekspression array (Illumina, San Diego, CA, USA), herunder 48803 prober og 37846 kommenterede gener, ifølge fabrikantens protokol. Opstillingerne blev scannet og fluorescenssignaler opnået ved anvendelse af Illumina Bead Array Reader (Illumina, San Diego, CA, USA). Array dataanalyse blev udført med GenomeStudio software (version 2009.1, Illumina). Prøverne blev normaliseret ved den kubiske spline algoritme og sonder med alle signaler lavere end to gange de gennemsnitlige baggrundsniveauer blev udelukket fra analysen. Differentielt udtrykte gener blev identificeret med Mann-Whitney differentiel ekspression algoritme (

P

0,05) og defineret til at have en fold ændring i-mellem grupper større end 1,5. Gene ontologi Analysen blev udført med Metacore software (GeneGoInc. St. Joseph, MI, USA).

Statistisk analyse

Korrelationer mellem variabler blev analyseret under anvendelse af Spearman rank test. Grupper blev sammenlignet under anvendelse af Mann-Whitney U test for kontinuerlige variable og Chi-square test for kategoriske variable. Kaplan-Meier overlevelse analyse blev udført med død PC som begivenhed og opfølgning tid som tiden mellem metastaser kirurgi og de seneste opfølgende undersøgelse. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af statistiske pakke for Social Sciences, SPSS 17,0 software (SPSS, Inc., Chicago, USA). En P-værdi mindre end eller lig med 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

High mRNA niveauer af AR splejsningsvarianter i CRPC knoglemetastaser

Udskrifter for den normale ARfl og de mest udbredte AR splejsningsvarianter hidtil kendte [16]; AR-V1, AR-V7, og AR-V567es blev opdaget og deres niveauer kvantificeres i ikke-maligne og GS7-8 væv dele af primære prostatatumorer og knoglemetastaser prøver, ved hjælp af real-time RT-PCR-analyse. Som vist i tabel 3, blev det ARfl, AR-V1, og AR-V7 transkripter påvist i de fleste af de ikke-maligne, primær tumor, og metastaser undersøgte prøver, mens AR-V567es transkript blev påvist i 7 (23%) af CRPC knoglemetastaser kun.

Der var en tendens til højere niveauer af ARfl, AR-V1, og AR-V7 mRNA i HN knoglemetastaser end i den primære PC væv, men forskellene var ikke signifikant (figur 1). Klart forhøjet ARfl, AR-V1 og AR-V7 transkriptniveauer blev dog ses i CRPC knoglemetastaser, som viste 8, 44, henholdsvis 120 gange højere median niveauer end HN metastaser (

P

≤0.001, figur 1). The ARfl, AR-V1, og AR-V7 mRNA-niveauer i de ikke-maligne prostata prøver var sammenlignelige med niveauerne i de primære prostatatumorer (figur 1).

Alle mRNA niveauer blev justeret for tilsvarende housekeeping-gen ( RPL13a) mRNA niveauer, normaliseret til medianværdien for de primære tumorer prøver, og transformeret af den naturlige logaritme. Niveauer i ikke-maligne prostata væv (

n

= 13), primær prostata tumor (

n

= 13), hormon-naive knoglemetastaser (

n

= 10) og kastrationsresistent knoglemetastaser (

n

= 30) prøver er vist i hvid, lysegrå, mørkegrå og sort, henholdsvis. Målbart niveauer er ikke angivet, men repræsenteret ved søjler symboliserer det lavest målbare i RT-PCR-analyse af hver udskrift variant.

Angivelse af LBD-afkortet AR proteinvarianter i CRPC knoglemetastaser

Proteiner niveauer af AR-vs blev undersøgt under anvendelse af Western blot-analyse af 13 prøver af CRPC knoglemetastaser tilfældigt udtaget til tilfælde med høj AR-V7 mRNA-niveauer (niveauer i den øvre kvartil, Q4), sager med lav og middel niveauer af AR-V7 mRNA (niveauer i laveste, Q1, og mellemliggende; Q2-Q3, kvartiler henholdsvis) samt påviselige /ikke-påviselige niveauer af AR-V567es mRNA (figur 2). Den 22Rv1 cellelinie kendt for at udtrykke AR-V7 variant [13], men også yderligere splejsningsvarianter [15] tjente som en positiv kontrol. En primær prostata prøve med udetekterbar AR-V7 mRNA tjente som en negativ kontrol (figur 2). Proteinbånd med den forventede molekylvægt på ca. 110 kDa (ARfl) og 80 kDa (presumingly AR-V1, AR-V7 eller -V567es) blev påvist i CRPC knoglemetastaser, med antistoffer rettet mod det N-terminale domæne af AR, mens den 80 kDa AR-vs blev ikke påvist under anvendelse af antistof rettet mod det C-terminale LBD domæne (figur 2A). De mest intense 80 kDa bånd blev detekteret i prøver med Q4 AR-V7 mRNA-niveauer, mens CRPC knoglemetastaser med lavere AR-V7 mRNA-niveauer udviste lavere til ikke-detekterbare niveauer uanset tilsvarende AR-V567es mRNA-niveauer (figur 2B). Baseret på blot-intensiteter, de AR variantproteinerne udgøres i median 32% af proteinniveauet ARfl (interval 0 til 95%,

n

= 13, data ikke vist). Dette var i modsætning til tilsvarende nøgletal på RNA-niveau, hvor AR-V7 og AR-V567 udskrifter repræsenteret i median kun 0,4% (interval 0,03 til 7%, data ikke vist) og 1,0% (interval 0,3 til 1,2%, data ikke vist), henholdsvis af ARfl mRNA niveau i overensstemmelse med forskellen i RT-PCR-ct-niveauer. Vores resultater tyder således at AR-Vs mangler LBD domæne er mulige post-transkriptionelt stabiliseret i CRPC knoglemetastaser i forhold til ARfl.

A) Antistoffer (N-20 og PG-21) rettet mod N- terminale domæne (NTD) af AR detekteres ARfl og AR-varianter (AR-V presumingly AR-V1, AR-V7, og /eller AR-V567es). Antistof C-19 målretning LBD opdaget ARfl af ~110 kDa, men ikke de LBD-trunkerede AR varianter af ca. -80 kDa. B) Analyse af CRPC knoglemetastaser repræsenterer prøver med høje niveauer af AR-V7 mRNA (Niveauer i den højeste kvartil, Q4, ifølge RT-PCR-analyse), samt prøver med AR-V7 mRNA-niveauer i Q1, Q2, og Q3, ved at bruge N-20-antistof. 22Rv1 celle ekstrakt tjente som positiv kontrol for ARfl og -80 kDa AR varianter og en primær prostatacancer prøve (P) tjente som negativ kontrol for AR-varianter.

Angivelse af AR-V7 og AR- V567es mRNA er forbundet med en dårlig prognose

De AR-V1, AR-V7, og ARfl mRNA niveauer blev korrelerede i alle undersøgte prøver (data ikke vist,

n

= 66), og i undergruppen af ​​CRPC knoglemetastaser (AR-V1 vs. AR-V7;

Rs

= 0,91,

P

0.001, AR-V1 vs. ARfl;

Rs

= 0,47,

P

0,01, og AR-V7 vs ARfl;

Rs

= 0,58,

P

0,001,

n

= 30). Knoglemetastaser med påviselig AR-V567es mRNA havde omkring 3 gange højere ARfl median mRNA niveau end de andre CRPC metastaser (

P

= 0,004).

Patienter med AR-V7 mRNA-niveauer i 4. kvartal havde signifikant kortere kræftspecifikke overlevelse efter metastase kirurgi end de andre CRPC patienter og en lignende resultat sås for patienter med påviselige niveauer af AR-V567es sammenlignet med resten (figur 3A-B). Ti patienter med CRPC knoglemetastaser blev enten inkluderet i AR-V7 Q4 undergruppe og /eller havde påviselige niveauer af AR-V567es, og er yderligere omtalt som AR-V høje patienter. AR-V høje patienter havde en gennemsnitlig overlevelsestid efter metastase kirurgi på kun 2 måneder sammenlignet med 8 måneder for de øvrige CRPC patienter (figur 3C). Ingen association blev fundet mellem ARfl eller AR-V1 mRNA niveauer og overlevelse efter metastase kirurgi (data ikke vist).

Patienter med A) AR-V7 [14] mRNA-niveauer i den højeste kvartil (Q4), B ) påviselige AR-V567es [16] mRNA niveauer, og C) påviselig AR-V567 og /eller AR-V7 Q4 (AR-V høj) mRNA niveauer havde kortere overlevelse end andre patienter med CRPC sygdom.

metastaser med høje niveauer af de AR-splejsningsvarianter viser intense nukleare AR immunfarvning

som vi tidligere har fundet, at høj AR immunofarvning scoringer var forbundet med en særlig kort overlevelse efter metastaser kirurgi og nu, at AR-V høje patienter havde en dårlig prognose, vi ønskede at undersøge, om high AR farvning score var forbundet med niveauer af AR-vs. De AR-V høje metastaser alle havde høj AR farvning scoringer i sammenligning med andre CRPC knoglemetastaser, som viste variable farvning spænder fra svag til stærk (tabel 2,

P

= 0,02).

Desuden , AR-V høje metastaser viste signifikant lavere PSA immunfarvning score (tabel 2,

P

= 0,038) og tendenser har højere fraktioner af prolifererende og apoptotisk tumor epitelceller (

P

= 0,12 og

P

= 0,085, henholdsvis) end andre CRPC metastaser (tabel 2).

Angivelse af AR splejsningsvarianter er forbundet med forstyrret cellecyklus kontrol

genekspression profil undergruppen af ​​AR-V høj knoglemetastaser blev sammenlignet med profilen af ​​andre CRPC knoglemetastaser, ved hjælp af en Illumina baseret cDNA-array med 48803 genprober. Omkring 17700 sonder blev defineret til at give signaler over baggrund i PC knoglemetastaser. Et hundrede og femoghalvfems (195) prober blev differentielt udtrykt mellem AR-V høj knoglemetastaser og andre CRPC knoglemetastaser efter en fold-ændring på mindst 1,5 i-mellem grupper (

P

0,05) og yderligere indbefattet i ontologi analyse til vurdering af berigede processer. Mange (60) af de differentierende genprodukter blev foreslået at være direkte interagere via AR, C-MYC og CDK1 proteiner (figur 4 og tabel S1). C-MYC og CDK1 er to centrale regulatorer af cellecyklus og følgelig top 5 beriget proces netværk findes i AR-V høj knoglemetastaser var; Celle cyklus Core, Cell cyklus S-fasen, cellecyklus mitose Cytoskellet spindel mikrotubuli og cellecyklus G2-M. C-MYC og CDK1 er også pro-overlevelsesfaktorer inhiberer apoptose og derudover har vi fundet øget transkript-niveauer af anti-apoptotiske proteiner survivin og BCL2L12 i AR-V høj sammenlignet med de andre CRPC knoglemetastaser (figur 4). Især imidlertid niveauer af andre vigtige regulatorer af apoptose, såsom dødsreceptorer, BAX, BCL2, og caspaser blev ikke ændret betydeligt, og desuden blev apoptose-relaterede proces net ikke signifikant beriget i vores data (data ikke vist). Adskillige gentranskripter vides positivt reguleret af AR blev fundet i høje niveauer i AR-V høje metastaser, såsom CDK1, CYCLINA2, HSP27, C-MYC, UGT2B17, CDC20, UBE2C, mens andre såsom KLK3 (PSA) , KLK2, NKX3-1, FKBP5 og TMPRSS2 var ikke (figur 4).

Røde cirkler angiver højere og blå cirkler angiver lavere transkriptniveauer i AR-V højt end i andre CRPC knoglemetastaser. Bemærk, at mange af de differentierende genprodukter direkte interagere via AR, C-MYC og CDK1.

Discussion

Dette papir beskriver for første gang, ekspressionsmønsteret for den LBD-afkortet AR splejsning varianter AR-V1, AR-V7 [14] og AR-V567es [16] i PC knoglemetastaser hos patienter, og desuden, at niveauet af disse varianter er steget i CRPC knoglemetastaser, og at ekspressionen af ​​AR -V567es og /eller meget høje niveauer af AR-V7 findes hos personer med særlig dårlig prognose.

Flere strukturelt forskellige, har grundlæggende aktiv AR-vs blevet hidtil identificeret i kliniske pc prøver [10], [11], [13], [14], [16], [17], og vi viser her berigelse af LBD-afkortet AR splice varianter i PC knoglemetastaser. I modsætning til Sun og medarbejdere, der fandt AR-V567es at være den mest udbredte splejsningsvariant undersøgt [16], fandt vi AR-V7 til at være mere almindeligt udtryk end AR-V567es i CRPC. Denne forskel kan muligvis teknisk forklares med forskellige følsomheder af RT-PCR-teknikker, der anvendes, men kunne muligvis også afspejle heterogene i AR splejsning variant udtryk mellem forskellige væv oprindelser, som vi undersøgte CRPC i knogler, mens Sun et al inkluderet CRPC fra forskellige steder. Vi har også vigtigt bemærkes, at flere af de undersøgte CRPC knoglemetastaser (AR-V høje tilfælde) udtrykte LBD-afkortet AR proteiner på niveauer kan sammenlignes med ARfl protein niveauer, selvom de tilsvarende AR variant udskrifter blev fundet ved relativt meget lavere niveauer end den ARfl mRNA. En post-transkriptionel stabilisering af AR splejsningsvarianter i forhold til ARfl i selektive CRPC knoglemetastaser er derfor plausibelt, selvom mekanismen for denne ikke er kendt.

dårlig prognose for patienter med CRPC metastaser udtrykker AR- V567es og /eller høje niveauer af AR-V7 transkripter sandsynligvis relateret til den postulerede konstitutiv aktivitet af disse varianter. AR-V567es indeholder kernen lokalisering (NLS) i hængselregionen i exon 4 [16] og AR-V7, i modsætning til AR-V1, er blevet postuleret at indeholde en NLS i sin kryptiske exon [14]. Følgelig AR-V7 og AR-V567es har vist, at translokere ind i kernen, for at binde AR responsive elementer, og aktivere /undertrykke gentransskription

in vitro

uden behov for ligandbinding [14], [ ,,,0],16], [17]. Interessant, Watson og kollega nylig viste en øjeblikkelig stigning af AR-V7 og AR-V1-mRNA-niveauer i xenograftmodeller til PC efter kastration, samt et fald efter androgen tilskud, hvilket indikerer, at nogle AR-Vs kan reguleres direkte af androgener og dermed sandsynligvis induceret i patienter kort efter kastration terapi [17]. Det er fristende at spekulere, at disse og andre AR-Vs vil blive udvalgt til også under udviklingen af ​​kastrationsresistent sygdom og dermed bidrage til tilbagefald fra behandlinger der sigter mod at reducere steroid niveauer eller ligand binding til den normale AR. Derfor fandt vi højere niveauer af de AR splejsningsvarianter i CRPC end i HN knoglemetastaser. De AR-V1 og AR-V7 udskrifter blev dog opdaget også i en væsentlig del af de ikke-maligne og maligne radikal prostatektomi prøver, om end på et lavere niveau end i knoglemetastaser, og andre har vist, at niveauet af AR-V7 ( AR3) i primære prostata tumorer var forudsigeligt for resultatet efter radikal prostatektomi, med en kortere tid til kemisk tilbagefald hos personer med højere niveauer [13], [14]. Grunden til dette er ikke kendt, men indikerer, at grundlæggende aktiv AR-Vs kunne være en del af den normale prostata fysiologi og at et udvalg af de varianter forekommer under PC progression.

berigelse af strukturelt forskellige, konstitutivt aktiv AR-vs under udviklingen af ​​CRPC metastaser påpeger komplekse og heterogene molekylære begivenheder, som ved forskel betyder synes at sikre AR aktivering i fraværet af testikelkræft androgener. Patienter, der udtrykker konstitutivt aktiv AR-Vs vil på lang sigt sandsynligvis ikke drage fordel af anti-androgen terapier, der skal reducere steroid syntese, såsom kirurgisk kastration, LHRH-analoger, eller den nyligt indførte agent abiraterone som inhiberer CYP17 og derved steroidsyntese ikke kun i testis men også i binyrerne og i tumorvæv [19], [20]. Overraskende, det hidtil ukendte AR antagonist MDV3100 målretning LBD af ARfl og i øjeblikket i kliniske forsøg for CRPC [21], [22], viste sig at inhibere kastrationsresistent vækst induceres ved ekspressionen af ​​konstitutiv AR-V7 i en dyremodel til PC [17]. Dette er opmuntrende som nye AR-antagonister hæmmer receptor translokation ind i kernen dermed kan have terapeutiske virkninger også hos patienter, der udtrykker konstitutivt aktiv AR-Vs. Ikke alle CRPC patienter gør dog reagere på abirateron og MDV3100 narkotika, og selv dem, der efterfølgende tilbagefald inden for et par måneder [20], [22]. Hvis denne form for terapi resistens er relateret til ekspression af konstitutivt aktive AR-Vs i knoglemetastaser (det primære mål for terapi) er i øjeblikket ikke kendt og kan ikke bestemmes indtil de kliniske studier begynder at omfatte biopsier fra knoglemetastaser. Desuden terapeutiske stoffer som hæmmer dem AR-Vs eller deres ned-stream effekter skal udvikles [23], [24]. En anden mulig forklaring på resistens over for kastration terapi er tilstedeværelsen af ​​AR negative tumorceller, og således AR bypass under tumorprogression [25]. Fuldstændig mangel på AR udtryk findes kun i en lille sub-population af CRPC knoglemetastaser, men AR negative tumorceller spredt blandt de positive findes i de fleste CRPC knoglemetastaser [3], og dermed vægt behovet også for behandlinger ikke kun stole på en funktionel AR.

i de kliniske prøver undersøgt i den foreliggende undersøgelse, påviselige niveauer af AR-V567es og /eller høje niveauer af AR-V7 udskrifter var forbundet med deregulerede niveauer af kendte AR-kontrollerede gener , men specifikt ikke af nogle klassiske androgen regulerede gener såsom KLK3 (PSA), TMPRSS2, og FKBP5 som blev fremkaldt af overekspression af AR-V7 eller AR-V567es i LNCaP celler

in vitro

[14] , [16]. Følgelig viste AR-V høje tilfælde mindre PSA immunfarvning end andre CRPC metastaser. I stedet fandt vi gentranskriptet niveauer, som differentierede AR-V høj knoglemetastaser fra andre CRPC knoglemetastaser ved at angive høj C-MYC og CDK1 aktivitet, og en forstyrret kontrol cellecyklus vedrørende G1-S samt G2-M overgang trods en ikke signifikant stigning i Ki67-mærkning. Udviklingen af ​​CRPC har været kendetegnet ved en skæv proliferation for apoptose-forhold og modstandsdygtighed over for apoptotiske stimuli [26], [27]. I slutningen af ​​stadium af sygdommen undersøgt i denne undersøgelse gjorde vi dog ikke, med få undtagelser, finde nogen klare tegn på ændret udtryk for apoptose-regulerende gener eller en yderligere deregulering af den apoptotiske proces AR-V høj sammenlignet med andre CRPC knoglemetastaser. Baseret på vores data, er vi ikke i stand til at diskriminere hvis forstyrret cellecykluskontrol fundet i AR-V høj knoglemetastaser virkelig er relateret til ekspressionen af ​​AR-Vs, den ARfl, eller bare forbundet med særligt fremskreden sygdom i disse CRPC sager. Ikke desto mindre kunne en yderligere forståelse af biologiske processer dereguleret i tilfælde med høj ekspression af konstitutivt AR-Vs være nyttig i udviklingen af ​​nye terapier for CRPC. For eksempel kunne det C-MYC protein være et terapeutisk mål i selektive patienter med pc som allerede foreslået [28].

Som konklusion er LBD-afkortet AR-Vs ofte udtrykt i knoglemetastaser, med højere niveauer i CRPC end i HN tilfælde.