PLoS ONE: afvigende ekspression af oncogen og Tumor-Smittespredningshæmmende MikroRNA’er i livmoderhalskræft kræves for Cancer Cell Growth

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft. Ved kloning og sekventering af et HPV16

+ CaSki celle lille RNA-bibliotek isolerede vi 174 miRNA (herunder det hidtil ukendte MIR-193C), der kan grupperes i 46 forskellige miRNA arter, med MIR-21, MIR-24, miR- 27a, og mIR-205 er mest udbredte. Vi valgte til yderligere undersøgelse 10 miRNA i henhold til deres kloning frekvens og tilhørende deres niveauer i 10 cervikal kræft- eller cervikal intraepithelial neoplasi-afledte cellelinjer. Ingen korrelation blev observeret mellem deres ekspression med tilstedeværelsen eller fraværet af et integreret eller episomalt HPV-genomet. Alle cellelinier undersøgt indeholdt intet påviseligt MIR-143 og MIR-145. HPV-inficerede cellelinjer udtrykte et andet sæt af miRNA ved dyrkning i organotypisk raft dyrket sammenlignet med monolag cellekultur, herunder ekspression af MIR-143 og MIR-145. Dette tyder på en sammenhæng mellem miRNA-ekspression og væv differentiering. Brug miRNA-array analyser for alder-matchede normale livmoderhalsen og livmoderhalskræft væv, i kombination med northern blot verifikation, vi identificeret markant deregulerede miRNA i livmoderhalskræft væv, med miR-126, miR-143, og miR-145 nedregulering og miR-15b , miR-16, miR-146a, og miR-155 opregulering. Funktionelle undersøgelser viste, at både MIR-143 og MIR-145 er undertrykkende at cellevækst. Når det indføres i cellelinjer, blev MIR-146a fundet at fremme celleproliferation. Tilsammen indikerer vore data, at nedregulering af MIR-143 og MIR-145 og opregulering af MIR-146a spille en rolle i cervikal carcinogenese

Henvisning:. Wang X, Tang S, Le SY, Lu R, Rader JS , Meyers C, et al. (2008) afvigende ekspression af oncogen og Tumor-Smittespredningshæmmende MikroRNA’er i livmoderhalskræft kræves for Cancer Cell Growth. PLoS ONE 3 (7): e2557. doi: 10,1371 /journal.pone.0002557

Redaktør: Dong-Yan Jin, University of Hong Kong, Kina

Modtaget: April 10, 2008; Accepteret: 13. maj 2008; Udgivet: 2 juli 2008

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, center for Cancer Research og NIH tilskud CA 94141 og CA 95713to JSR og CA 79.006 til CM

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer hos kvinder over hele verden, med en anslået global forekomst af 470.000 nye tilfælde og cirka 233.000 dødsfald om året [1], [2]. Livmoderhalskræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i mange ressourcesvage lande, hvor udbredt screening ved cervikal cytologi er ikke tilgængelig. Forekomsten er lavere i de udviklede lande som følge af livmoderhalskræft screening og af igangværende aktive programmer sundhedsuddannelser. Livmoderhalskræft satser i USA blev anslået som 10,370 nye tilfælde og 3.710 dødsfald i 2006 [3]. Den kausale sammenhæng mellem høj-risiko HPV (HR-HPV) infektion og livmoderhalskræft er veldokumenteret i epidemiologiske og funktionelle studier. Højrisiko-HPV’er, såsom HPV16, HPV18 og HPV31, er blevet påvist i op til 99,7% af livmoderhalskræft planocellulært karcinom og 94% -100% af livmoderhalskræft adeno- og adenosquamøst karcinomer [4], [5]. De HPV oncoproteiner, E6 og E7 højrisiko, bidrage til livmoderhalskræft carcinogenese ved at inaktivere cellulære tumor suppressor proteiner p53 og pRb henholdsvis [6] – [8].

miRNA er regulerende, ikke-kodende RNA om 21-23 nukleotider i længde og er udtrykt ved specifikke stadier af vævs- udvikling eller celledifferentiering, og har store virkninger på ekspressionen af ​​en række forskellige gener på post-transkriptionel niveau. Gennem baseparring med dens målrettede mRNA’er, et miRNA inducerer RNA-nedbrydning eller translationelle undertrykkelse af de målrettede transkripter [9], [10]. Cellular miRNA er transskriberet af RNA-polymerase II som lange, loft, polyadenyleret primære miRNA (pri-miRNA) udskrifter bærer en hårnåle-hårnål struktur -80-NTS [11]. Modne miRNA skyldes behandlingen af ​​pri-miRNA i to sekventielle spaltningsprodukter skridt medieret af to RNase III enzymer, drosha og Dicer [12]. Drosha, i kompleks med DGCR8, spalter PRI-miRNA ved en bestemt afstand (ca. 11 bp) fra stamme-enkeltstrenget RNA junction i kernen til dannelse af en præ-miRNA af et -60 nt hårnål med en 2-nt 3′-overhæng [13], [14]. Efter pre-miRNA eksporteres til cytoplasmaet ved exportin 5 [15], [16], er det så anerkendt af Dicer, i kompleks med dsRBD-holdige partner HIV-1 TAR RNA-bindende protein (TRBP) [17], at fjerne den terminale loop, efterlader en anden 2-nt 3 ‘overhæng [18]. De resulterende 21- til 23-nt miRNA produkter indeholder en 2-nt 3 ‘overhæng ved hver streng og fungerer som de funktionelle mellemprodukter af RNAi, at direkte mRNA spaltning og translationel dæmpning. Selv om deres biologiske funktioner stort set ukendt, de seneste undersøgelser tyder på, at miRNA bidrager til udviklingen af ​​forskellige kræftformer [19] og kan fungere som en vigtig del af cellens naturlige forsvar mod virusinfektion [20] – [22]. Det er blevet foreslået, at en unik miRNA ekspressionsprofil for en bestemt cancer ville være et nyttigt biomarkør for kræft diagnose [23] og prognose [24]. I denne undersøgelse anvendte vi forskellige tilgange til at profilere miRNA udtryk fra livmoderhalskræft væv og livmoderhalskræft-afledte cellelinier samt fra HPV-inficerede vaginale keratinocytter. Vi viser, at en delmængde af miRNA væsentligt dysreguleret i livmoderhalskræft og præ-neoplastiske læsioner.

Resultater

miRNA udtryk profil i livmoderhalskræft cellelinjer

For at undersøge udtrykket profiler af miRNA i cervicale cancerceller, isoleret vi totalt celle-RNA fra livmoderhalskræft-afledte CaSki C-2-celler, som indeholder ~500 kopier af HPV 16 genomet per celle. De fraktionerede RNA’er med størrelser på 15-30 NTS blev klonet og sekventeret ud fra en offentliggjort protokol [25]. Samlet set vi klonet i alt 174 miRNA fra 363 cDNA kloner, som blev kategoriseret i 46 forskellige miRNA arter (tabel 1), med miR-21, miR-24, miR-27a, og miR-205 er mest udbredte. Nr HPV16-afledte miRNA blev klonet i denne screening, alle miRNA var cellulære. Interessant fandt vi, at nogle kopier af den klonede MIR-21 og MIR-205 havde heterogen 3′-ender, med en ekstra C nukleotid på 3′-enden af ​​68% af MIR-21 kopier og en ekstra U på 3′ udgangen af ​​33% af MIR-205 eksemplarer, formentlig stammende fra wobble fordøjelse af præ-miRNA ved Dicer (fig. 1). Desuden en ny underart af miR-193, miR-193C (GenBank nummer: EF100863), blev identificeret tre gange fra screeningen og blev bekræftet ved northern blotting. MIR-193C underart afviger fra MIR-193b med ét nukleotid i position nt 21 og af manglen på tre Us at 3′-enden (MIR-193b, 5′-aacuggcccucaaagucccgcuuu-3 ‘; MIR-193C, 5’-aacuggcccucaaagucccga 3 ‘). Ekspressionsprofilen af ​​nyligt identificerede MIR-193C, som er 3-nt mindre end MIR-193b var svarende til den i MIR-21 i HeLa-celler og 293-celler, men mindre forekommende end MIR-27a. HeLa og 293 celler produceret nogen påviselig miR-205 som en dublet som set i CaSki celler (fig. 2A).

pile over pre-miRNA indikerer wobble-fordøjelse sites på pre-miR-21 i A og præ-mIR-205 i B, producerer produkter med yderligere nukleotider på 3′-enden. Resultaterne vist i rødt svarer sekvenser til modne miRNA mens der er vist i sort er den del af præ-miRNA som fjernes under behandlingen.

A. MIR-193C ekspression i CaSki, HeLa, og 293-celler. CaSki og dens subkloner C-V og C-2-celler [72] blev sammenlignet med HeLa (HPV18

+) og 293-celler (HPV

-) til ekspression af MIR-193C ved northern blotting. Totalt RNA (30 ug) fra CaSki, HeLa, og 293-celler blev separeret i en 15% denaturerende polyacrylamidgel, blottet på en Gene Screen Plus-membran, og derefter probet separat med en følelse (er) eller en antisense (as) miR -193c probe. Efterfølgende blev membranen probet igen med antisense-prober for MIR-21, MIR-27a, MIR-205, eller U6 hhv. B. miRNA udtryk i livmoderhalskræft-afledte cellelinjer. Totalt celle-RNA (30 ug) blev ekstraheret fra forskellige cellelinier med eller uden HPV-infektion. Northern blotting blev anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​10 miRNA fra otte cancercellelinjer to W12 celle subkloner, HaCaT-celler, normale cervix, og livmoderhalskræft væv (Ambion). C. nedregulering af miR-143 i livmoderhalskræft væv. Totale RNA’er fra to par normal (NT) cervix vs livmoderhalskræft (Ca) væv fra kliniske prøver og et par normale cervix og livmoderhalskræft købt fra Ambion blev sammenlignet for ekspression af MIR-143 ved northern blotting. U6 blev også udslettet som en intern kontrol for prøve lastning i panel A, B, og C.

På baggrund af disse kloning resultater, vi yderligere screenet flere tilgængelige livmoderhalskræft cellelinjer med eller uden HPV-infektion ved northern blotting for ekspressionen af ​​8 miRNA med relativt høj kloning frekvens og 2 miRNA (mIR-143 og mIR-145), som ikke blev isoleret i vores kloning (tabel 1). Otte livmoderhalskræft cellelinjer; to isolater af W12 cellelinje (20861 med integreret HPV16 genomer og 20863 med episomal HPV16 genomer) oprindeligt isoleret fra en cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) biopsi væv [26] og HaCaT celler (en udødeliggjort HPV-negative hudkeratinocyt linje) [27 ] blev undersøgt for ekspression af de 10 miRNA. En parret samlede RNA fra livmoderhalskræft og tilstødende normale cervikale væv kommercielt opnået fra Ambion blev også sammenlignet. Alle cellelinier og livmoderhalskræft væv viste en lignende miRNA ekspressionsprofil. Dette miRNA profil afveg fra normale cervikale væv med reduceret ekspression af miR-27a, miR-143, og miR-145 (Fig. 2B). I modsætning hertil livmoderhalskræft væv og cellelinier, bortset SiHa (HPV 16

+), HeLa (HPV18

+), og C33A celler (HPV

-) havde, forøget ekspression af MIR-205, når sammenlignet med normal cervikal væv (fig. 2B). SiHa, HeLa, og C33A celler har ingen ekspression af MIR-205. I alle de cellelinjer, ekspression af MIR-143 og -145 var mindre end det, der blev observeret i livmoderhalskræft væv. Trods tilstedeværelsen af ​​visse forskelle i ekspressionen af ​​individuelle miRNA fra én cellelinje til en anden, var vi ikke i stand til at angive en ekspressionsprofil af disse detekterede miRNA i korrelation med tilstedeværelsen af ​​integrerede eller episomale HPV-genomer. Nedreguleringen af ​​MIR-143, som er afledt af den samme miRNA precursor for MIR-145 [28], blev yderligere bekræftet at være kræftspecifikke ved sammenligning af dets ekspression i livmoderhalskræft væv til normale cervix (fig. 2C).

miRNA ekspressionsprofil i normale og cancerøse cervikale væv

Da vores kloning tilgang har en begrænsning i isoleringen af ​​lave rigelige miRNA og northern blotting er begrænset af den valgte probe kan de to metoder ikke være bedst at skelne en forskel fra én cellelinje til en anden i miRNA ekspressionsprofil. For yderligere at undersøge, om miRNA udtrykkes forskelligt i livmoderhalskræft væv, vi samlet fem par alderskategori normale og kræft cervikale væv og sammenlignet deres udtryk profiler ved hjælp af en miRNA array analyse indeholder 455 miRNA. Kun fire prøvepar kvalificeret sig til den endelige klyngedannelse analyse, som bestemt ved prøve konsistens analyser. Et udtryk overflod analyse, baseret på et signal tæthed ≥20,000, viste, at både normale og kræft cervikale væv havde rigelig udtryk for miR-23a, miR-23b, lad-7a, lad-7c, og lad-7d, hvorimod høj ekspression af mIR-26a, mIR-29a, mIR-99a, mIR-100, mIR-125b, mIR-143, mIR-145, miR195, og mIR-199a blev kun observeret i normale cervikale væv, og høj ekspression af mIR-16, miR-21, miR-205, og lad-7f blev kun observeret i livmoderhalskræft væv, på trods af at relativt lave niveauer af miR-16 og miR-21 blev bemærket fra en homogen cellepopulation i nogle cellelinjer (fig. 2B). Ekspression af MIR-143 og MIR-145 viste mere end 2,7 gange reduktion mod cervixcancer væv. Ved hjælp af en clustering analyse, vi observeret en signifikant øget udtryk af 18 miRNA i livmoderhalskræft og 15 miRNA i normal cervix (P 0,05, t-test) (figur 3A, miRNA i rød farve.). Til verifikation, blev et sæt udvalgte miRNA prober anvendes til at udføre en Northern blot-analyse for to normale og to cancer prøver. Vi var i stand til at bekræfte, at de cancervæv havde reduceret ekspression af MIR-126 og MIR-424, og forøget ekspression af MIR-15b, MIR-16, MIR-146a, MIR-155, og MIR-223 (fig. 3B og 3C), efter individuel miRNA-niveau i hver prøve blev kvantificeret og normaliseret til U6 udtryk.

Totalt RNA (5 ug) isoleret fra aldersmatchede normale cervikale væv (NT) og livmoderhalskræft væv (CA) blev analyseret af miRNA array analyse. Cancervævet 1, 3 og 5 blev inficeret med HPV16 og kræftvæv 4 blev inficeret med HPV45. A. En clustering graf blev oprettet ved hjælp af en hierarkisk metode fra disse miRNA med signal tæthed på mere end 1000 og shows steget (rød) eller nedsat (grøn) udtryk (P 0,05) af individuelle miRNA fra 4 alder-matchede normale og kræft livmoderhalskræft væv (tabel S1). overskrift Kolonnen angiver individuel prøve kode i analysen. Hver række viser udtrykket mønster af individuelle miRNA som log2-transformeret udtryk ratio, med den mest nært beslægtede udtryk følgeskab af en filial og grupperet med gennemsnitligt-linked algoritme. Branch længder afspejler grader af lighed mellem miRNA ekspressionsmønstre. Farveskala på toppen af ​​panelet repræsenterer graden af ​​ekspression baseret på en kalibreret forhold. Grøn angiver lavere ekspression sammenlignet med middelværdien (nul), sort indikerer ekspression lig med middelværdien, og rød indikerer højere ekspression i forhold til middelværdien. B. Kontrol af miRNA udtryk profil ved northern blotting. Totalt celle-RNA (30 ug) isoleret fra hvert væv blev probet med individuel antisense oligo til hvert angivet miRNA. Et yderligere bånd i hver blot indikerer en wobble produkt fra Dicer fordøjelse. C. Bar grafer viser de relative niveauer af de undersøgte miRNA normaliseret til U6 RNA i hvert væv i panel B.

miRNA udtryk profil i HPV-inficerede, keratinocytafledte tømmerflåde væv

for at undersøge om de observerede miRNA signaturer i livmoderhalskræft væv er specifikke for livmoderhalskræft, vi undersøgte miRNA udtryk i præneoplastiske læsioner. Manglen på konventionelle cellekulturer for HPV multiplikation har stort set behersket vores forståelse af HPV livscyklus og patogenese. Imidlertid har infektiøse HPV’er blevet fremstillet af flåder kulturer afledt fra humane keratinocytter [29], [30] og induktion af præneoplastiske læsioner i raft væv ved HPV-infektion med morfologien svarende til den i cervikal intraepithelial neoplasi [31] gør dette system med stor fordel for vores studier. Brug miRNA-array analyser, vi sammenlignet udtrykket profiler af 455 menneskelige miRNA i HPV18-inficerede primære humane vaginale keratinocytter (HVKs) i monolagskulturer og i stratificerede og differentierede tømmerflåde væv. Et udtryk overflod analyse, baseret på et signal tæthed ≥20,000, viste, at miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26a, miR-205, lad-7c, og lad-7F rigeligt udtrykt i HVKs både monolag kulturer og tømmerflåde kulturer. Tre miRNA rigeligt udtrykt kun i monolagskulturer (MIR-24, miR-29a, og miR-221) og 11 miRNA rigeligt udtrykt kun i de lagdelte og differentierede tømmerflåde kulturer (miR-27a, miR-27b, miR-200 mia, miR- 200c, miR-203, miR-638, lad-7a, lad-7b, lad-7d, lad-7e, og lad-7g). Ved hjælp af en klyngedannelse analyse, vi yderligere bestemt, at 16 miRNA blev opreguleret (fig. 4A, raft i rødt) og 25 miRNA blev nedreguleret (fig. 4A, raft med grønt) i forslagspakke kulturer sammenlignet med de ekspressionsniveauer i det tilsvarende monolag kulturer (P 0,05, t-test). For at bekræfte observationerne blev de parrede prøver analyseret for miRNA-ekspression ved northern blotting hjælp af et sæt specifikke miRNA sonder (fig. 4B og 4C). Kvantificering af hvert miRNA niveau i hver prøve blev normaliseret til U6 udtryk. Vi bekræftede, at ekspressionen af ​​MIR-26b, MIR-195, og MIR-200C blev forøget i forslagspakke kulturer, men ekspressionen af ​​MIR-143 og MIR-145 blev reduceret (Fig. 4B og 4C). Den øgede forekomst af MIR-200C viser 67% mere ekspression i klumper end i monolag (P 0,08) ved array analyse blev verificeret ved Northern blotting. Selv om der blev observeret opregulering af MIR-15a og MIR-223 og nedregulering af MIR-218 og MIR-424 både i klumper (præneoplastiske læsioner) og i livmoderhalskræft væv, de fleste af de miRNA ekspressions underskrifter viste ingen sammenhæng mellem to væv (sammenlign fig. 4A til fig. 3A). Imidlertid nedregulering af MIR-146a blev bemærket i forslagspakke kulturer snarere end opregulering set i livmoderhalskræft væv og blev yderligere bekræftet ved northern blotting (fig. 5), hvilket indikerer, at opregulering af MIR-146a-ekspression er livmoderhalskræft-specifik. I modsætning hertil blev en let forøget ekspression af MIR-21 og MIR-26b observeret i både præ-neoplastiske læsioner (HPV-inficerede flåder) og livmoderhalskræft væv og dermed deres ekspression forekommer ikke cancer-specifik (Fig. 5).

Raft væv (kulturer) med HPV18 infektion blev afledt fra humane vaginale keratinocytter (HVKs) i monolagkulturer med HPV18 DNA transfektion. Totalt celle-RNA (5 ug hver), der udvindes fra hver type celler blev sammenlignet parallelt for miRNA ekspression under anvendelse miRNA-array analyser. A. En clustering graf blev skabt af en hierarkisk metode fra disse miRNA med et signal tæthed på mere end 1000 opnået fra tre uafhængige transfektioner i hver gruppe (tabel S2). Grafen viser faldt (grøn) eller forøget (rød) udtryk (p 0,05) af individuelle miRNA fra udifferentierede HVKs i monolag (Mono) versus stratificerede og differentierede HVKs i flåder. Se andre detaljer i fig. 3A. B. Kontrol af miRNA udtryk fra udifferentierede HVKs i monolag og stratificeret og differentierede HVKs i flåder ved nordlige blotting. Total celle-RNA (30 ug hver) isoleret fra differentierede eller udifferentierede HVKs blev probet med udvalgte miRNA sonder. C. Bar grafer viser de relative niveauer af de undersøgte miRNA normaliseret til U6 RNA i hver prøve i panel B. M = monolagskultur, R = tømmerflåde.

A. Totale RNA’er fra HVKs i to redningsflåder og to monolag (mono) kulturer blev sammenlignet med to livmoderhalskræft (Ca) væv til ekspression af MIR-146a ved northern blotting. Ekspressionsniveauerne af MIR-21 og MIR-26b blev undersøgt som miRNA kontroller. Lille nukleare RNA U6 blev også udslettet som en intern kontrol for prøve læsning. B. Bar grafer viser de relative niveauer af de undersøgte miRNA normaliseret til U6 RNA i hver prøve i panel A. M = monolagskultur, R = tømmerflåde.

Reduceret miR-143 og miR-145 i cervikale læsioner og livmoderhalskræft er undertrykkende i livmoderhalskræft cellevækst

Efter at have demonstreret en betydelig nedregulering af miR-143 og miR-145 i livmoderhalskræft og præ-neoplastiske læsioner, vi undersøgt, om denne nedregulering er vigtig i udviklingen af livmoderhalskræft. For at løse dette spørgsmål blev syntetisk MIR-143 og MIR-145 precursorer forbigående transficeret ind i HeLa-celler, og virkningen af ​​overekspression af deres modne miRNA på HeLa cellevækst blev vurderet ved celletælling. Som vist i fig. 6, blev begge miR-143 og miR-145 fundet undertrykkende (p 0,005 for miR-143 og p 0,008 af miR-145,

t

-test) til HeLa cellevækst. Denne undertrykkende virkning på cellevæksten var ikke en øjeblikkelig cellerespons; snarere, blev brug for to på hinanden følgende celletransfektioner med hver miRNA ved et interval på 48 timer. Dataene tyder på, at både miR-143 og miR-145 sandsynligvis nødt til at blive nedreguleret i cervikale celler til tumor progression.

A. MIR-143 og MIR-145 er suppressive for HeLa cellevækst. Pile angiver tidspunkterne, når cellerne modtaget en særlig miRNA (30 nM) transfektion. Levedygtige celler i hver gruppe blev talt i de angivne tidspunkter. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af to forsøg, hver udført in triplo. B. Relative niveauer af MIR-143 og MIR-145 i HeLa-celler ved 96 timer efter første transient transfektion. Totalt celle-RNA ekstraheret blev undersøgt ved miRNA ligering assay. Et tRNA-niveau i hver prøve blev anvendt som en belastning kontrol.

Øget miR-146a i livmoderhalskræft fremmer celledeling

I betragtning af en 6-dobling af miR-146a udtryk i livmoderhalskræft væv, vi den hypotese, at et højt niveau af mIR-146a kan spille en rolle i cervikal vækst kræftcelle. Vores indledende fremgangsmåde ved anvendelse af anti-MIR-146a inhibitorer eller ved anvendelse af en morphonino-oligo at blokere MIR-146a modning at vælte MIR-146a ekspression i cervicale cancercellelinier inducerede ikke en fænotypisk virkning (data ikke vist). Til vores overraskelse, fandt vi, at alle cervicale cancercellelinier undersøgte udtrykte ingen detekterbar MIR-146a (fig. 7A). Efterfølgende blev MIR-146a indført ved transient transfektion i HeLa-celler, en HPV18

+ livmoderhalskræft cellelinie, og HCT116-celler, en kolorektal cancer cellelinje (fig. 7B). En langsom, men signifikant forøget celleproliferation af både HeLa (p 0,009,

t

-test) og HCT116 (P 0,019,

t

-test) celler blev bemærket i nærvær af exogen mIR-146a. Ved beregningen af ​​celletal fra hver gruppe, demonstrerede vi, at både HeLa-celler og HCT116 celler indeholdende MIR-146a havde en fordoblingstid 2-3 timer hurtigere end for cellerne med MIR-kontroller (Fig. 7C og 7D). Disse data tyder på, at miR-146a fungerer som en vækstfaktor i livmoderhalskræft.

A. Ingen ekspression af MIR-146a i livmoderhalskræft-afledte cellelinjer og i en human hud-afledt keratinocytlinie, HaCaT celler. Totalt celle-RNA blev ekstraheret fra individuelle cellelinie og undersøgt for MIR-146a og MIR-21 ekspression ved northern blotting. U6 i hver prøve tjente som prøve loading kontrol. B. relative MIR-146a i HeLa og HCT116-celler ved 96 timer efter den første transfektion. Totalt celle-RNA ekstraheret fra hver gruppe blev undersøgt ved northern blotting. C og D. MIR-146a fremmer celleproliferation. Pile angiver tidspunkterne, når cellerne fik transfektion med MIR-146a eller MIR-kontrol (30 nM). Levedygtige celler i hver gruppe blev talt i de angivne tidspunkter. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD af to eksperimenter, hver udført i tre eksemplarer.

Diskussion

I denne undersøgelse, vi demonstrerede miRNA udtryk profiler i livmoderhalskræft og HPV-infektion fremkaldt præ- neoplastiske læsioner i tømmerflåde væv. Selvom både cervikal cancer væv og HPV-inficerede Gummibåd væv med præneoplastiske læsioner viste en opregulering af MIR-15a og MIR-223 og nedregulering af MIR-143, MIR-145, MIR-218 og MIR-424, de fleste miRNA udtryk viste ingen sammenhæng mellem de to væv og kan afgrænse sygdomsprogression. Imidlertid blev et højt niveau af MIR-146a-ekspression sig at være livmoderhalskræft-specifik, da dets ekspression blev nedreguleret både i normale væv og i HPV-inficerede Gummibåd væv med præneoplastiske læsioner.

Finding af nedregulering af MIR-143 og MIR-145 og opregulering af MIR-146a i livmoderhalskræft var især attraktive af to grunde: (1) MIR-143 og MIR-145 er udtrykt fra samme miRNA precursor [28] og nedjusteres også i HPV-inducerede præneoplastiske forandringer, i vores tilfælde i HPV-inficerede tømmerflåde væv, hvilket tyder på, at deres reduktion finder sted i et tidligt trin, før udviklingen af ​​kræft. Nedregulering af MIR-143 og MIR-145 er blevet fundet i flere andre cancerformer, herunder colorectal cancer [32], B-celle lymfom [33], og for nylig i livmoderhalskræft [34], [35]. Således er vores fund er vigtigt for at forstå de mekanismer, hvormed MIR-143 og MIR-145 er involveret i carcinogenese. Inhibering af MIR-143 og MIR-145 i HeLa cellevækst indebærer, at MIR-143 og MIR-145 sandsynligvis skal nedreguleres, for cancervækst. (2) opregulering af MIR-146a i livmoderhalskræft væv, men ikke i HPV-inducerede præneoplastiske læsioner eller i cancer-afledte cellelinjer viser, at MIR-146-ekspression er livmoderhalskræft-specifik. Forskellige undersøgelser viser, at MIR-146a er en NF-kappaB-afhængig gen [36] – [38]. Ekspression af MIR-146a synes at variere i forskellige cancervæv, hvor et forøget niveau af MIR-146a blev observeret i Burkitts ‘lymfom linjer med EBV-LMP1 (latent membranprotein 1) ekspression [37], [38], men en nedsat niveau i hormon-refraktær prostatacancer [39] og papillær thyreoideakarcinom [40]. I livmoderhalskræft, opregulering af miR146a udtryk synes relateret til nogen af ​​HPV genekspression siden sit udtryk selv blev reduceret i produktivt HPV-inficerede tømmerflåde væv. Interessant alle cervicale cancercellelinier og en hudkeratinocyt linje undersøges, indeholder ingen påviselig MIR-146a, hvilket antyder, at MIR-146a i livmoderhalskræft væv opreguleres med en faktor mangler i en homogen cellepopulation eller udtrykkes af en anden type celler i cancer væv. , Konkluderer således vi, at opregulering af miR-146a udtryk i livmoderhalskræft er til gavn for vækst kræft som indførelsen af ​​miR-146a til kræftceller øget celle fordoblingstid og fremmet celledeling.

Ca. 800 menneskelige miRNA er blevet forudsagt . Af disse har mere end 450 (https://microrna.sanger.ac.uk/sequences, 2006) nu blevet identificeret i den menneskelige [41], [42] [43], er [44], og deres funktioner begynder at blive belyst [45]. I denne undersøgelse, vi klonet og identificeret 174 miRNA, som blev inddelt i 46 forskellige miRNA arter. En ny underart af miR-193, miR-193C, blev også klonet og identificeret fra vores miRNA bibliotek screening. Screening af 10 cellelinier afledt fra livmoderhalskræft eller CIN væv til ekspression af 10 miRNA foreslået, at tilstedeværelsen eller fraværet af integrerede eller episomale HPV-genomer har ingen virkning på ekspressionen af ​​analyserede miRNA. Desuden kunne vi ikke identificere en enkelt HPV16-afledt miRNA fra HPV16

+ CaSki celler ved denne fremgangsmåde, selv om andre nukleare DNA-virus gøre indkode miRNA [46], herunder EBV [47]; KSHV [48] – [50]; HSV-1 [51], [52]; og SV40 [53]. En negativ kloning for HPV16-afledte miRNA tyder på, at den integrerede HPV16 genom i CaSki celler synes ikke at udtrykke virale miRNA. En anden undersøgelse ved anvendelse af differentierede HPV31

+ LKP1 celler indeholdende -50 kopier af et episomalt HPV31 genom per celle heller ikke identificere virusafledte miRNA [54].

Nylige rapporter har antydet, at miRNA bidrager til en række cellefunktioner [41] og er involveret i udviklingen af ​​humane cancere [19]. For eksempel MIR-32 styrer celle resistens overfor en retroviral infektion [55]. En klynge af seks miRNA på humant kromosom 13 reguleres af c-Myc, og c-myc-reguleret MIR-17-5p og MIR-20a negativt modulerer ekspressionen af ​​E2F1, en transkriptionsfaktor [56]. miRNA er også karakteriseret nylig som potentielle onkogener, der fremmer udviklingen af ​​den menneskelige B-celle lymfom (miR-17-92 klynge) [57] og spredning og tumorigenese af primære humane celler (miR-372 og miR-373) ved neutralisering p53-medieret CDK inhibering [58]. En anden undersøgelse foreslået, at overekspression af miR-17-5p, miR-20a, miR-21, miR-92, miR-106a, og miR-155 kunne anses en miRNA signatur af fast kræft [59]. I denne rapport blev 18 miRNA opreguleres og 15 miRNA blev nedreguleret i livmoderhalskræft væv. Den forøgede ekspression af MIR-15b, MIR-16, MIR-146a, MIR-155, og MIR-223, som vi observerede i livmoderhalskræft væv har også været impliceret i udviklingen af ​​andre humane cancere: MIR-15 og MIR-16 regulere apoptose ved at målrette BCL2 [60] og deres mutation er blevet forbundet med kronisk lymfatisk leukæmi [61]; miR-16 er også involveret i kontrollen af ​​cytokin-RNA ustabilitet [62]; MIR-146 B med oprindelse niveauer er stærkt forøget i papillær thyreoideakarcinom [40]; MIR-155 er for nylig blevet impliceret i udviklingen af ​​lymfoblastisk leukæmi /high-grade lymfom [63] og lungekræft [24] og ved regulering af human fibroblast angiotensin II type 1 receptor-ekspression [64]; miR-223, sammen med transskription faktorer C /EBPa og NFI-A, deltager i reguleringen af ​​granulocytisk differentiering ved at undertrykke transskription af NFI-A mRNA [65].

Selvom modne miRNA er afledt af deres primære udskrifter gennem drosha og Dicer fordøjelse i to separate trimning reaktioner indeholde en 2 nt 3 ‘overhæng på hver streng, er Dicer fordøjelse af det før-miRNA ikke altid udført præcist. Dette blev afspejlet i miR-21 og miR-205 isoleret i dette studie. Vi fandt, at mere end 68% af MIR-21 isoleret fra CaSki-celler havde en yderligere C ved 3 ‘enden og 33% af MIR-205 isoleret indeholdt en ekstra U ved 3’ enden, men ingen ekstra nukleotid var nogensinde identificeret fra 5 ‘enderne af enten miRNA. Når sammenlignet med det tilsvarende præ-miRNA sekvens, blev fundet yderligere C på MIR-21 og U på MIR-205 skal afledes direkte fra nukleotid 3 ’til spaltningsstedet, hvilket antyder, at Dicer fordøjelse har en wobble mekanisme . Denne observation ved små RNA-kloning kan yderligere verificeres som dobbelt bånd for MIR-21 (fig. 5A og fig. 7A) og for MIR-205 (fig. 2A og 2B) i Northern blot-analyser. Vore resultater stemmer overens med andre rapporter opnået fra biokemiske analyser, som Dicer anvender en 3′-ende optælling regel og måler en afstand på -22 nt fra 3′-terminus til at spalte begge strenge af RNA, med 1- til 2-nt skift i den foretrukne spaltning holdning [18], [66].

Materialer og metoder

celler, væv og tømmerflåde kulturer

Otte livmoderhalskræft cellelinier blev anvendt til analyser : HPV16

+ CaSki og SiHa, HPV18

+ HeLa og C4II, HPV68

+ ME180 [67], og HPV31

+ CIN612 6E og 9E celler. To HPV16

+ W12 subkloner (20861 og 20863) oprindeligt isoleret fra en lav-grade cervikal læsion histologisk diagnosticeret som CIN I [26] blev også anvendt til sammenligning. Blandt disse cellelinier, 20863 og 9E celler indeholder et episomalt form af HPV-genomet, og 20.861 og 6E celler har en integreret HPV-genom [68], [69].