PLoS ONE: den onkogene rolle microRNA-130a /301a /454 i Human Tyktarmskræft via Målretning Smad4 Expression

Abstrakt

transformerende vækstfaktor (TGF) -β /Smad signalering spiller en vigtig rolle i tyktarmskræft udvikling, progression og metastase. I denne undersøgelse viste vi, at microRNA-130a /301a /454 familie opreguleres i colon cancer væv sammenlignet med parrede tilstødende normale slimhinde, der deler den samme 3′-untranslational region (3′-UTR) bindende frø sekvens og er bygger til at målrette Smad4. I kolorektale cancer HCT116 og SW480 celler, overekspression af miRNA-130a /301a /454 efterligner forbedrer celle proliferation og migration, mens hæmmere af disse miRNA påvirker celle overlevelse. Den biologiske funktion af miRNA-130a /301a /454 om colon cancerceller er sandsynligvis medieret af undertrykkelse af Smad4, og opregulering af miRNA er korreleret med Smad4 nedregulering i humane coloncancerformer. Kollektivt, disse resultater tyder på, at miRNA-130a /301a /454 er nye onkogene miRNA, der bidrager til kolon tumorigenesis ved at regulere TGF-β /Smad signalering, som kan have potentiel anvendelse i behandlingen af ​​kræft

Henvisning:. Liu L, Nie J, Chen L, Dong G, Du X, Wu X, et al. (2013) den onkogene rolle microRNA-130a /301a /454 i Human Tyktarmskræft via Målretning Smad4 Expression. PLoS ONE 8 (2): e55532. doi: 10,1371 /journal.pone.0055532

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: September 20, 2012; Accepteret: December 27, 2012; Publiceret: 5 feb 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt er støttet af tilskud fra National Basic Research programmer (2012CB518103), National Natural Science Foundation of China (31.100.554, 31.270.820, 81.230.061, og 81.121.004), Nursery Foundation of PLA General Hospital (12KMM48), og Beijing Nova Program (Z12111000250000). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tyktarmskræft er en af ​​de hyppigste kræftformer og en almindelig årsag til cancer-relaterede dødsfald [1]. På grund af den dårlig prognose og fjernt invasion og migration, den samlede forekomst af tyktarmskræft er ca. 5% og 5-års overlevelsesraten for patienter med tyktarmskræft er meget lav [2]. Således identifikation af nye mål for udviklingen af ​​ikke-konventionelle behandlinger er presserende og vil drage fordel af fremskridt i bred og dyb forståelse af den molekylære patogenese for tyktarmskræft.

MikroRNA’er (miRNA) er en omfattende klasse af små ikke-kodende RNA (18-25 nt), med en betydelig indvirkning på en række biologiske processer, herunder udvikling, differentiering, vækst, stofskifte, og tumorigenese, gennem direkte binding til 3’untranslational region (3′-UTR) af målet mRNA [3] – [5]. MikroRNA’er kan regulere genekspression ved to tilstande, afhængigt af graden af ​​komplementaritet med mRNA mål, at undertrykke oversættelse eller fremkalde mRNA nedbrydning [6], [7]. MikroRNA’er kan fungere som tumor undertrykkere eller onkogener baseret på, om de miRNA specifikt rettet mod onkogener eller tumorsuppressorgener [8]. Både onkogene miRNA og tumor undertrykkende miRNA er blevet demonstreret og beskrevet i colon carcinogenese og progression, såsom opreguleret MIR-135, MIR-21, MIR-17-92, og MIR-196a, og nedreguleret MIR-34, MIR-195, og mIR-365 [9] – [13]. Ekspressionsprofilen af ​​miRNA er stærkt vævs- og celletypespecifik, hvilket viser den biologiske funktionelle betydning af et udtrykt miRNA [14]. Men belyse funktionerne i udtryk og roller miRNA i cancer biologi, især tyktarmskræft, forbliver en løbende proces.

microRNA-130ac /301ab /454/721 familie har den samme 3′-UTR bindende frø sekvens. For nylig er MIR-130a /301ab blevet rapporteret at være opreguleret i flere typer af cancer, såsom hepatocellulært carcinom, ikke-småcellet lungecancer, kronisk myeloid leukæmi, pancreascancer og brystcancer [15] – [21]; dog miR-130a /301a nedreguleres i kronisk lymfatisk leukæmi og seglcelleanæmi [22], [23], hvilket indikerer kompleksiteten og mangfoldigheden af ​​de roller miR-130a /301a i tumorigenese. Ikke desto mindre er mønstret af udtryk og rolle miR-130a /301a /454 i colon carcinogenese fortsat ukendt.

I dette studie undersøgte vi udtryk og roller af miR-130a /301a /454 i udvikling tyktarmskræft. Vi viste, at miR-130a /301a /454 er opreguleret i klinisk-resektion humane coloncancer væv og tyktarmskræft cellelinjer, og disse miRNA udviser onkogene egenskaber i kolon kræftceller

in vitro

in vivo

. De mekanismer, der ligger til grund roller miR-130a /301a /454 i udvikling tyktarmskræft blev også undersøgt. Således er vores data fremhæve betydningen af ​​miR-130a /301a /454 /familie i kræft patogenese og foreslå en potentiel anvendelse i behandlingen af ​​kræft.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

Kirurgisk-fjernede tyktarmskræft væv og parrede tilstødende normale mucosa væv blev indsamlet fra 35 patienter tyktarmskræft på General Hospital i PLA (Beijing, Kina), og blev anvendt til kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (qRT- PCR) og immunoblotting-analyse. De kirurgisk resektion væv blev hurtigt nedfrosset i flydende nitrogen indtil analyse. Alle prøver blev opnået med informeret samtykke fra patienterne og forsøgene blev godkendt af den etiske komité i den almindelige Hospital i PLA. Alle deltagere billede skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse.

RNA-ekstraktion og QRT-PCR

Totalt RNA, herunder miRNA, blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge fabrikantens instruktioner . For miRNA-analyse, blev poly-A real-time QRT-PCR anvendes. Det isolerede RNA blev polyadenyleret anvendelse af poly-A polymerase (New England Biolabs) ifølge fabrikantens protokol. Derefter poly-A-hale RNA revers transkriberet under anvendelse ImProm revers transkriptase (Promega) efter fabrikantens protokol, og MIR-RT-primer (Invitrogen). MIR-RT primer var: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG (T) 18VN-3 ‘. Real time PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green PCR Mix (Qiagen) ifølge producentens protokol [12], med de følgende primere: MIR-130a, 5’-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3 ‘; MIR-301a, 5’-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3 ‘; MIR-454, 5’-ACCCTATCAATATTGTCTCTGC-3 ‘; universal primer, 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 ‘; U6-F, 5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ‘, U6-R, 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’. Den relative ekspression af miR-130a /301a /454 blev normaliseret til den interne kontrol (U6) ved hjælp af 2

-ΔΔCt cyklus tærskel metode.

Cell kultur og transfektion

den humane coloncancer-cellelinjer HCT116, HCT15, HT29, LoVo, og SW480 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) og opretholdt i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin, i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C. De miRNA efterligner og miRNA-hæmmere blev syntetiseret ved GenePharma (Shanghai, Kina). MiRNA transfektioner blev udført ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Analyse af cellernes levedygtighed

in vitro

celle levedygtighed HCT116 eller SW480 celler blev vurderet ved hjælp af Cell Counting Kit -8 (CCK-8, Dojindo, Japan) metode. Kort fortalt blev brugt medium udskiftet med frisk medium indeholdende 10 pi CCK8 reagens ved den angivne tidsperioder efter transfektion. Cellerne blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 1 time, og antallet af levedygtige celler blev vurderet ved måling af absorbans ved 450 nm.

cellemigrationsassay

HCT116 transfektanter blev serum-udsultet i 12 timer i RPMI-1640-medium indeholdende 0,1% FBS. Serum-udsultede celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i RPMI-1640 indeholdende 0,1% FBS, derefter 1 x 10

5-celler blev tilsat til det øvre kammer (8 um porestørrelse; Corning) i plader med 24 brønde i serumfrit medium (500 pi). Efter inkubation i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO

2, de migrerede celler på den nedre overflade af membranen blev farvet med 0,1% violet farvning opløsning i 30 minutter og talt ved anvendelse af et omvendt mikroskop.

Tumorigenicitet assay i nøgne mus

Alle forsøg med dyr blev foretaget i overensstemmelse med National Institute of Health guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, med godkendelse af det videnskabelige Investigation Board af General Hospital af PLA. Tumorigeniciteten assay blev udført som tidligere [12] rapporterede. Negativ kontrol eller MIR-130a /301a /454 efterligner-transficeret HCT116 eller SW480-celler (1 x 10

7) blev suspenderet i 0,1 ml PBS, derefter injiceret subkutant i hver side af den bageste flanke af samme 4-uge- gamle BALB /c athymiske nøgne mus. Otte nøgne mus blev inkluderet i hver gruppe og tumorvækst blev målt dagligt bruger calipre. Tumor volumen blev beregnet efter følgende formel: volumen = længde × bredde

2 × 0.5. Udtrykket af miR-130a /301a /454 i tumor prøver ved de angivne tidspunkter blev påvist ved hjælp af en QRT-PCR-analyse.

3’UTR luciferase reporter assay

Den menneskelige Smad4 3’UTR luciferasereporterplasmid og plasmid indeholdende mIR-130a /301a /454 målsted deleteret eller muteret Smad4 3’UTR blev konstrueret som tidligere [13] beskrevne. Alle konstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekventering. Luciferase reporter assays blev udført som tidligere [13] rapporterede. Kort fortalt blev luciferaseaktiviteter målt ved 48 timer efter transfektion under anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) efter producentens instruktioner. Data blev normaliseret ved at dividere

ildflue

luciferaseaktivitet af

Renilla

luciferaseaktivitet.

Immunoblotting

De lyserede proteinekstrakter blev udsat for natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), overført til nitrocellulosemembraner, derefter blottet, som tidligere [24] rapporterede. Anti-Smad4 antistof blev købt fra Cell Signaling Technology. GAPDH antistof og de sekundære antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology.

Statistisk analyse

Data er vist som middelværdi ± s.d. Statistiske sammenligninger mellem eksperimentelle grupper blev analyseret ved Student

t

-tests, og en to-halet p-værdi 0,05 blev anset for at være betydelig. Korrelationen mellem MIR-130a /301a /454-ekspression og Smad4 proteinniveauet blev analyseret under anvendelse Pearson korrelationskoefficienten analyse med r og p-værdier, som angivet.

Resultater Salg

MIR-130a /301a /454 er opreguleret i tyktarmskræft væv og cellelinjer

at udforske rollerne for miR-130a /301a /454 i udvikling af menneskelige tyktarmskræft, vi har registreret niveauerne af udtryk i 35 par af menneskelig tyktarmskræft og tilstødende normale slimhinde væv. Ifølge QRT-PCR-analyse, blev niveauerne af MIR-130a /301a /454-ekspression steget betydeligt i tumorvæv sammenlignet med tilstødende normale mucosa væv (fig. 1A-C). Desuden blev miR-130a /301a /454 steg i kolon kræft cellelinier (HCT116, HCT15, HT29, SW480, og LoVo;. Figur 1D-F). Desuden var der en positiv korrelation mellem hver to miRNA blandt MIR-130a /301a /454 (fig. 1G-I), der viser et almindeligt udtryk profil på miRNA familie i tyktarmskræft. Disse resultater tyder på, at miR-130a /301a /454 er opreguleret i colon cancerceller, som kunne være relevante for udviklingen af ​​menneskelige tyktarmskræft.

udtryk for miR-130a /301a /454 blev undersøgt ved QRT -PCR i 35 parrede humane coloncancer og tilstødende normale mucosa væv (A, B, C), og i tyktarmskræft cellelinjer som angivet (D, E, F). Udtrykket af miR-130a /301a /454 blev normaliseret til U6 i hver prøve. Data er vist separat i humane prøver (A, B, C), eller som middelværdien ± s.d. (N = 3) i cellelinjer (D, E, F). **,

s 0,01

. (G, H, I) Statistisk analyse af overensstemmelsen mellem hver to miRNA blandt MIR-130a /301a /454 blev udført under anvendelse Pearson korrelationskoefficient analyse.

r

s

værdier er vist som angivet.

MIR-130a /301a /454 øger cellernes levedygtighed og migration i tyktarmskræft cellelinjer

høj ekspression af miR-130a /301a /454 i tyktarmskræft væv og cellelinier fik os til at undersøge den biologiske funktion af disse miRNA i tyktarmskræft. Den CCK8 assay viste, at restaurering af miR-130a /301a /454 væsentligt forbedret spredning af tyktarmskræft HCT116 eller SW480-celler (fig. 2A og B), mens overekspression af enten hæmmer mod miR-130a /301a /454 reduceret celle levedygtighed i begge colon cancerceller (fig. 2C og D) Disse tre miRNA udviste lignende vækstfremmende virkninger i coloncancer, og nogen gensidige bestemmelser blandt mIR-130a /301a /454 blev observeret (fig. 2E og F). Desuden MIR-130a /301a /454 fremmet cellemigrering i HCT116-celler, som analyseret ved Transwell cellemigrationsassay (fig. 2G, venstre panel). I modsætning hertil knockdown af miR-130a /301a /454 undertrykt celle motilitet i tyktarmskræft celler (Fig. 2G, højre panel). Disse observationer tyder på, at miR-130a /301a /454 fremmer tyktarmskræft cellevækst og migration, og dermed fungerer som onkogene miRNA i tyktarmskræft.

(A, B) Tyktarmskræft HCT116 og SW480 celler blev transficeret med kontrol-RNA eller mIR-130a /301a /454 mimic som angivet. Cellelevedygtighed blev påvist ved den angivne tidspunkter efter transfektion under anvendelse CCK8 assays. *,

s

0,05. (C, D) Det hæmmer af miR-130a /301a /454 blev transficeret i HCT116 og SW480 celler, og cellernes levedygtighed blev påvist ved de angivne tidspunkter ved hjælp CCK8 analyser. *,

s

0,05. (E, F) Niveauerne af ekspression af hver to miRNA blandt MIR-130a /301a /454 blev detekteret ved QRT-PCR-assays når efterligner eller inhibitor på den anden miRNA blev transficeret i HCT116-celler. (G) HCT116-celler blev transficeret med kontrol-RNA, MIR-130a /301a /454 mimic eller MIR-130a /301a /454 inhibitor. Antallet af migrerede celler blev beregnet og vist. Data er vist som middelværdi ± s.d. (N = 3) af et repræsentativt eksperiment. Lignende resultater blev opnået fra tre uafhængige forsøg. *,

s

. 0,05

MIR-130a /301a /454 fremmer tumorigenecity

in vivo

Vi bekræftede tumoren yderligere -at fremme virkninger af miR-130a /301a /454

in vivo

. Negativ kontrol-RNA, MIR-130a /301a /454 efterligner eller inhibitor transficeret colon cancerceller, blev injiceret i otte nøgne mus, som beskrevet. Som vist i fig. 3, miR-130a /301a /454-transficerede HCT116 og SW480 celler havde hurtig tumordannelse i forhold til negative kontroltransfektanter, mens knockdown af miR-130a /301a /454 forårsagede forsinket tumordannelse (fig. 3A-F). Niveauerne af miR-130a /301a /454 udtryk blev valideret af QRT-PCR-analyser fra tumor prøver ved de angivne tidspunkter (Fig. 3G og H). Disse resultater indikerer, at MIR-130a /301a /454 signifikant forøget tumorgenicitet af colon cancerceller i en nøgen mus xenograft model.

Virkning af MIR-130a /301a /454 om tumorigenicitet i en nøgen mus xenograft model. Kontrol-RNA, MIR-130a /301a /454 efterligner eller MIR-130a /301a /454 inhibitor-transficerede coloncancer HCT116 celler (A, B, C) og SW480 celler (D, E, F) blev injiceret subkutant i hver side af den bageste flanke af de samme nøgne mus, henholdsvis (n = 8 pr gruppe). kurve tumorvæksten vises som angivet. *,

s

0,05. (G, H) tumorvæv blev indsamlet fra to mus i hver gruppe i de angivne tidspunkter, og niveauet af ekspressionen af ​​miR-130a /301a /454 blev undersøgt ved QRT-PCR-analyser.

mIR-130a /301a /454 direkte undertrykker ekspression af Smad4

på grundlag af miRNA target forudsigelse (https://www.targetscan.org), over hundrede gener er formodede mål gener for miR-130a /301a /454. Da disse miRNA er i stand til at forbedre tumorigenecity af tyktarmskræft celler

in vitro

in vivo

, kan target-genet reguleret af miR-130a /301a /454 fungere som en tumor suppressor. Blandt de formodede målgener, Smad4, en vigtig tumor suppressor involveret i TGF-β /BMP-signalering, blev vist at indeholde et konserveret formodet MIR-130a /301a /454 målsted baseret på Targetscan forudsigelse (fig. 4A). For at afgøre, hvorvidt Smad4 er direkte målrettet af miR-130a /301a /454 udtryk, vi konstrueret luciferase reporter plasmider indeholdende Smad4 3′-UTR eller bærer sletning /mutation af den formodede miR-130a /301a /454 target site. Ved co-transfektion med MIR-130a /301a /454 mimic, viste vi, at luciferaseaktiviteten af ​​vildtype Smad4-3’UTR reporter blev undertrykt, mens målstedet deleteret eller muteret reporter ikke blive ramt af MIR-130a /301a /454 co-transfektion (fig. 4B). Notatet viste immunoblotting analyse, at miR-130a /301a /454 markant reduceret niveauet af endogent protein udtryk for Smad4 forhold til negativ kontrol RNA i HCT116 og SW480-celler (fig. 4C). Smad4 fungerer som en central transducer af transformerende vækstfaktor (TGF) -β og knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalering, fordi R-Smad danner et heteromert kompleks med Smad4 og translokerer ind i kernen til at regulere gentranskription. Vi søgte derfor at identificere, hvorvidt disse miRNA indflydelse TGFp og BMP signalering aktiviteter. MIR-130a /301a /454 inhibitor blev indført i HCT116 celler transficeret med TGF-β reporter CAGA12-lux eller BMP reporter BRE-lux. Som vist i fig. 4D, MIR-130a /301a /454 inhibitor markant forbedret TGFp og BMP-responser, når det konstitutivt aktive form af TGF-β /BMP-receptor I (TβRI-ca /BMPRI-ca) blev co-udtrykt, ledsaget af Smad4 opregulering , hvilket tyder på, at miR-130a /301a /454 kan undertrykke TGF-β /BMP-signalering ved at hæmme Smad4 udtryk.

(a) menneskelige Smad4 kunne være et molekylært mål for miR-130a /301a /454. De sekvensopstillinger af miR-130a /301a /454 og dens mål steder i 3’UTR af Smad4, hentes fra Targetscan (https://www.targetscan.org) er vist. (B) HCT116-celler blev co-transficeret med humant Smad4 3’UTR

ildflue

luciferasereporterplasmid, MIR-130a /301a /454 målsteder deleteret eller muteret reporterkonstruktion, sammen med RL plasmider, kontrol-RNA eller mIR-130a /301a /454 mimic, som angivet. Efter 48 timer,

ildflue

luciferaseaktivitet blev målt og normaliseret ved

Renilla

luciferaseaktivitet. (C) HCT116 og SW480-celler blev transficeret med kontrol-RNA eller MIR-130a /301a /454 mimic. Efter 48 h blev menneske Smad4 og intern kontrol GAPDH opdaget ved immunblotting (øverste panel), og niveauerne af miR-130a /301a /454 udtryk blev målt ved QRT-PCR-analyse (nederste panel). Den densitometri ratio for immunoblotting blev vist. (D) HCT116-celler blev co-transficeret med TGFp reporter CAGA12-lux eller BMP reporter BRE-lux, sammen med RL plasmid, kontrol-RNA eller MIR-130a /301a /454 inhibitor og TβRI-CA eller BMPRI-ca som angivet. Efter 48 timer,

ildflue

luciferaseaktivitet blev målt og normaliseret ved

Renilla

luciferaseaktivitet. Den endogene ekspression af Smad4 og GAPDH blev påvist ved immunblotting. TβRI-ca, den konstitutivt aktive form af TGF-β-receptor I; BMPRI-ca, den konstitutivt aktive form af BMP-receptor I. (E) Smad4 ekspression i tom pCDNA-vektor eller Smad4-udtrykkende plasmid stabilt-transficerede HCT116-celler blev detekteret ved immunoblotting. (F, G) Kontrol eller Smad4 stabilt-transficerede HCT116-celler blev transficeret med kontrol-RNA, MIR-130a /301a /454 mimic (F), eller MIR-130a /301a /454 inhibitor (G), som angivet. Cellelevedygtighed blev påvist 96 timer efter transfektion under anvendelse CCK8 assays. *,

s

. 0,05

Desuden har vi bestemt, om de vækstfremmende virkninger af miR-130a /301a /454 er primært gennem målrettet Smad4 udtryk. Smad4-udtrykkende plasmid stabilt-transficerede HCT116 celler blev fremstillet, som transkriberet Smad4 mRNA uden 3’UTR-sekvensen. I disse celler blev Smad4 ekspression bekræftes, at forøget sammenlignet med kontrolceller (fig 4E.); dog MIR-130a /301a /454 ikke længere mod Smad4 ekspression, da disse celler transkriberet Smad4 mRNA uden 3’UTR. Især væksten stigende virkninger af miR-130a /301a /454 blev betydeligt undertrykt i Smad4-transfekterede HCT116 celler (Fig. 4F). Desuden MIR-130a /301a /454 inhibitor mislykkedes at undertrykke cellelevedygtighed i disse celler (fig. 4G). Disse resultater viste endvidere, at vækstfremmende roller miR-130a /301a /454 var primært gennem hæmning af Smad4 udtryk.

Klinisk korrelation mellem MIR-130a /301a /454 niveauer og Smad4 udtryk

for at forstå den kliniske betydning af miR-130a /301a /454, og dens mål i tyktarmskræft, vi bestemt niveauerne af miR-130a /301a /454 og protein udtryk for Smad4 i 14 par matchede tyktarmskræft prøver ved qRT- PCR og immunoblotting (fig. 5A og B). Som forventet, Pearson korrelationskoefficient analyse foreslog, at Smad4 udtryk omvendt var korreleret med miR-130a /301a /454 udtryk i tyktarmskræft væv (fig. 5C-E). Disse data understøtter den opfattelse, at overekspression af MIR-130a /301a /454 fører til Smad4 nedregulering, således inhibere TGF-β-signalering medieret cellevækst undertrykkelse, som bidrager til udviklingen af ​​tyktarmskræft.

(A, B) blev Ekspression af Smad4 og GAPDH i prøver af matchede tyktarmskræft og ikke neoplastiske mucosa væv detekteres ved immunblotting (A). MIR-130a /301a /454-ekspression blev undersøgt ved QRT-PCR (B). Fire repræsentative tilfælde vises. (C) Den relative niveau af Smad4 eller MIR-130a /301a /454-ekspression blev normaliseret til den interne GAPDH eller U6 ekspression. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Pearsons korrelationskoefficient analyse. Normaliseret miR-130a /301a /454 og Smad4 protein niveauer af ekspression er vist som standardiserede værdier.

r

s

værdier er vist som angivet.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, viste vi, at miR-130a /301a /454 er opreguleret i tyktarmskræft, og yderligere demonstreret spredning fremmende effekt af miR-130a /301a /454 i colon cancerceller. MicroRNA-130a /301a /454 er indikeret som onkogene miRNA i tyktarmskræft udvikling og progression, hvilket er konsistent med roller i andre cancere, såsom hepatocellulært carcinom, ikke-småcellet lungecancer, kronisk myeloid leukæmi, pancreascancer og brystcancer [15 ] – [21]. Imidlertid er MIR-130a nedreguleret i kronisk lymfatisk leukæmi, og kan modulere celleoverlevelse ved at inhibere autofagi program [22]. Desuden plasmaniveauet af MIR-301a er nedreguleret i patienter med seglcelleanæmi, sammenlignet med normale kontroller, der er relateret til PAI-1 suppression [23]. De kendte mønstre af ekspression, potentielle mål og biologiske funktioner i denne MIR-130a /301a /454 familie er opsummeret i tabel 1 [15] – [23], [25] – [29]. De forskellige udtryk funktioner i miR-130a /301a kan afspejle de forskellige roller miR-130/301 familie i forskellige former for kræft. Derfor eksisterer deregulering af miR-130a /301a /454 i forskellige former for kræft, og roller denne miRNA familie i carcinogenese og progression kan ikke blot indgået som en tumor suppressor eller onkogen. Udforskning af udtryk profiler og roller miR-130a /301a /454 i tyktarmskræft vil i høj grad udvide vores forståelse for denne vigtige miRNA familie på tumorigenese.

TGF-β signalvejen spiller væsentlige roller i talrige biologiske processer. Smad4, den drejelige transducer af TGF-β og BMP signalvej, fungerer som en vigtig tumorsuppressor. Smad4 mutationer eller sletninger er ofte blevet observeret i forskellige typer af kræft, såsom kolorektal, pancreas, og brystkræft [30] – [32]; dog den detaljerede mekanisme af Smad4 inaktivering er begrænset. Vi viste, at miR-130a /301a /454 undertrykker Smad4 udtryk gennem direkte binding til 3’UTR, mens vi bemærkede også, at der er andre miRNA konsensus steder i Smad4 3′-UTR (f.eks websteder for miR-34a, miR- 146a, og miR-199a, som er blevet identificeret som negative regulatorer af Smad4 i mavekræft og glioblastom) [33] – [35]. Derfor kan vi ikke udelukke, at disse miRNA deltager også i den nedregulering af Smad4 udtryk i udviklingen af ​​tyktarmskræft. Desuden kan vi ikke udelukke, at andre potentielle mål for miR-130a /301a /454 kan styre yderligere kræft veje og fremme udviklingen af ​​tyktarmskræft, som en enkelt miRNA er kendt for at målrette flere mRNA. Disse hypoteser indikerer behovet for yderligere undersøgelser for at afsløre hele “targetome” af miR-130/301/454 familie i colon carcinogenese og progression.

induceret pluripotente stamceller (iPSCs) kan genereres ved tvungen udtryk af transkriptionsfaktorer, herunder Oct4, Sox2, Klf4, og c-Myc [36]. Specifikke miRNA har vist sig at være involveret i iPSC generation, såsom MIR-290 og MIR-302 [37] – [39]. For nylig, Pfaff et al. [25] viste, at miRNA familien (miR-130/301/721) fungerer som en vigtig regulator af iPSC induktion ved at målrette homeobox transskription faktor, Meox2. Frembringelsen af ​​iPSCs involverer en proces med mesenchymale-til-epitel overgang (MET), faktorer derfor inducere MET eller blokere epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) ved at hæmme TGF-β signalering spiller en væsentlig rolle i celle omprogrammering [40] . Vi har opdaget en hidtil ukendt mål for miR-130/301/454 familie (Smad4), som har nøglefunktion i TGF-β-signalering, giver den mulighed, at miR-130/301/454 familie kan styre omprogrammering ved at undertrykke TGF-β /Smad4 aktivitet. Således har vores undersøgelser kastet nyt lys over den molekylære mekanisme og krydstale af stamceller regulering og tumorigenese.

Som konklusion, vores resultater bekræfter, at miR-130a /301a /454 familie er en kritisk faktor i forskellige former af cancerudvikling og progression. Således miR-130a /301a /454 familie kan repræsentere en lovende molekylær mål for tidlig påvisning af kræft.