PLoS ONE: Påvisning og karakterisering af metastatisk kræftceller i Mesogastrium af gastrisk kræftpatienter

Abstrakt

mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan. Her foreslår vi en hidtil ukendt type af tumormetastase betegnet som Metastase V i gastrisk cancer. Metastase V er defineret som forekomsten af ​​cancerceller i mesogastrium med perigastric fedtvæv. For at detektere forekomsten og karakterisere sin klinik patologiske træk, stor tværsnitsareal væv analyse af mesogastrium fra 74 patienter blev anvendt. Metastase V blev fundet i en af ​​40 (2,5%) patienter med tidlig mavekræft, 8 af 34 (24%) patienter med fremskreden mavekræft. Den gennemsnitlige afstand Metastase V fra mavevæggen var ca. 2,6 cm. Metastase V var tæt forbundet med tumorinvasion dybde, sammen med en række positive lymfeknudemetastase. Prognosen for patienter med Metastase V var signifikant (

P

0,05) dårligere end dem med tumorceller-fri mesogastrium. Disse resultater viser, at ved anvendelse af hel-snit analyse kan Metastase V påvises i mesogastrium af mavecancerpatienter, og også antyder, at det kan være en risikofaktor for patientens overlevelse efter radikal kirurgi

Henvisning:. Xie D, Liu L, Osaiweran H, Yu C, Sheng F, Gao C, et al. (2015) Detektion og karakterisering af metastatisk kræftceller i Mesogastrium af mavekræft patienter. PLoS ONE 10 (11): e0142970. doi: 10,1371 /journal.pone.0142970

Redaktør: Alfons Navarro, Barcelona Universitet, SPANIEN

Modtaget: Juni 28, 2015; Accepteret: September 17, 2015; Udgivet: November 13, 2015

Copyright: © 2015 Xie et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data . er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af National Science Foundation of China, give numre: 81572861; 81201638; 81302309; 81372324.

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selvom udført med helbredende hensigt og kombineret med neoadjuverende kemoterapi, radikale indgreb for avanceret gastrisk. cancer (gastrektomi med D2 lymphadenectomy) følges ofte af lokal-regional recidiv [1]. Faktisk omkring 75-80% af tilfældene stadig ende op med lokal-regional tilbagefald i 2 år efter [2] kirurgi. Lokal-regional tilbagefald efter kurativ radikal gastrektomi er den vigtigste årsag til dårlig prognose af mavekræft [3].

I de seneste tre årtier, TME (total mesorectal excision) eller CME (komplet mesocolic excision) kirurgiske procedurer for kolorektal cancer er faldet chancerne for lokalt recidiv og steg 5-års overlevelse [4,5]. Kirurgisk forskning har antydet, at de formodede årsager er bedre teknikker, faglærte kirurger med flere års praksis, avanceret peri-drift ledelse og komplette lymfeknude dissektioner. På den anden side, er det stadig svært at fuldt ud at forstå, hvordan patienter, som fik R0 resektion med iscenesættelse af T2N0M0 og T3N0M0 har også lokale-regionale gentagelser, som kan variere fra 10% til 30% [6]. Således ingen nøjagtige årsager eller årsag til det er blevet strengt vist.

Direkte invasion, lymfedrænage, hæmatogen spredning og peritoneal formidling er de fire klassiske ruter gennem hvilken lokal-regional tilbagefald eller fjerne implantater af gastriske kræftceller kan bestemmes. Hver af disse veje ligger i den særlige hulrum. For eksempel er den direkte invasion og peritoneal spredning beliggende i serøs hulrum; hæmatogen metastase kan findes i blodkarrenes hulrum; i lymfe metastase, er cancercellerne placeret i hulrum lymfekar og knuder. Men ud over disse veje, folk har også rapporteret forskellige metastatiske cancerceller i lokale perigastric fedtvæv [7-11]. Da de undlod at beskrive hulrummet disse væv blev placeret i, er metastaser blevet forklaret som en tilfældighed, lejlighedsvis begivenhed eller én forveksles med en underliggende serøs spredning. Den “indhylle” hypotese om mesogastrium blev foreslået, da en tidligere uidentificeret hulrum, omgivet eller omsluttet af ordentlig fascia, blev opdaget med kræftceller placeret og bevæger sig i det [12]. Vi har udpeget udseendet af disse cancerceller i mesogastrium med perigastric fedtvæv metastaser V [12]. For at bekræfte vores hypotese, yderligere opdaget vi forekomsten og karakteriseret de patologiske karakteristika Metastase V ved hjælp af store tværsnit vævsprøver af mesogastrium opnået fra mavecancerpatienter. I alt 5,892 mesogastrium prøver sektioner, hver med en tykkelse på 4 um, fra 74 patienter blev analyseret (fig 1A og 1B).

(A) Stor tværsnitsbillede vævsprøver analyse af mesogastrium fra kirurgisk resektion prøver. mLGEV, mRGEV, mLGV og mRGV blev analyseret. (B) Kontinuerlig sektioner på 1 cm bredde intervaller på mesogastrium prøver. (C) isoleret cancerceller blev påvist i mesogastrium af reseceret gastrisk cancer prøver af både HE farvning (venstre) og immunhistokemi med CK AE1 /AE3 antistof (højre). (D) Afstand af Metastase V fra mavens vægge.

Materialer og metoder

Patienter, prøver, og den store tværsnitsareal vævsprøve analyse

halvfjerds fire patienter, som gennemgik kirurgi for primær mavekræft ved Institut for Gastrointestinal Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College i Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi mellem oktober 2012 og januar 2014 blev inkluderet i denne undersøgelse. Patienterne bestod af toogfyrre mandlige og toogtredive kvindelige patienter med en gennemsnitsalder på 52 (range, 23-72 år). Alle disse patienter undergik laparoskopi bistået D2 + CME (komplet mesogastrium excision) radikal gastrektomi med en helbredende R0 resektion, og hele operationen blev udført af professor Jianping Gong, chef for GI kirurgi af Tongji Hospital, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi. Alle deltagere billede informeret skriftligt samtykke til at deltage i undersøgelsen. Denne undersøgelse blev godkendt af Tongji Hospital etiske komité.

De mesogastrium prøver blev indhentet fra reseceret gastriske væv. I denne undersøgelse blev fire regioner i mesogastrium inkluderet, og hver opkaldt mesogastrium af Venstre Gastroepiploic Fartøjer (mLGEV), mesogastrium af Right Gastroepiploic Fartøjer (mRGEV), meosgastrium af Right Gastric Fartøjer (mRGV) og mesogastrium af Venstre Gastric Fartøjer (mLGV) henholdsvis ifølge de vigtigste leverer skibe (fig 1A). Alle operativt fjernede prøver blev fikseret i 10% neutral-pufret formalin i mindst en time før manipulere med mesogastrium. Prøverne blev derpå rettede at identificere de respektive pedicles af mesogastrium, og stederne for den primære tumor (øvre (U), midterste (M), eller lavere (L) dele, forreste eller bageste vægge, mindre eller større krumninger). Den nærmeste afstand mellem den primære tumor og hver mesenteriet blev målt og registreret (Fig 1A). De mesogastriums blev ekstraheret en bloc fra maven, udrettet og målt for deres længde og bredde. Prøver blev skåret vinkelret på maven væggen i 1 cm mellemrum og organiseret i en proksimal til distal mønster præget af romertal (Fig 1B). Hver strimmel blev skåret i terninger parallelt med mavevæggen ved 1 cm intervaller. Terningerne blev derefter sekventeret i radiale mønstre mærket og nummereret ved anvendelse af standard tal. Terningerne blev bragt i indlejring kassetter, opbevaret i 10% neutral-pufret formalin og overføres til histopatologi lab til yderligere behandling og stort seriel sektionering. I alt 5,892 sektioner, hver 4 um tykke, blev fjernet fra de 74 patienter, med en middelværdi på 80 blokke (range, 13-136) per patient. Alle blokke blev underkastet hæmatoxylin-eosin-farvning og immunhistokemi. Tabel 1 viser de kliniske og patologiske karakteristika for de 74 patienter i vores undersøgelse. Klinisk-patologisk data blev analyseret i henhold til den 7. udgave af AJCC Cancer Staging Manual.

For at overleve analyse, i alt tres-syv patienter, der fik laparoskopisk D2 gastrektomi plus komplet mesogastrium excision med en helbredende R0 resektion fra februar 2009 til juni 2012, inkluderet. Alle operationen blev udført af professor Jianping Gong. Efter kirurgisk resektion, alle patienter undergik en opfølgning, med median opfølgning på analyse at være 47 måneder for alle patienter. Opfølgningen program af postoperativ overvågning bestod af fysisk undersøgelse blod kemi herunder CEA, computertomografi, og ultralyd udføres hver 3. måned til at diagnosticere tilbagevendende sygdomme.

Immunohistokemi og definition af Metastase V i mesogastrium

Immunhistokemi blev udført under anvendelse af cytokeratin AE1 /AE3 antistof, et monoklonalt antistof, der reagerer på epiteltumor celler fra gastrointestinale organer og har vist sig at være en meget følsom markør for gastriske cancere.

Immunfarvning blev udført ifølge standarden streptavidin-biotin-metoden. Kort fortalt blev snittene afparaffiniseret og rehydreret, og endogen peroxidase blev inhiberet med 0,3% H

2O

2. For antigen hentning blev snit kogt i 0,01 M, pH 6,0 natriumcitratbuffer i 15 min i en mikrobølgeovn. Efter blokering med 5% normalt gedeserum i 30 minutter, det primære anti-cytokeratin AE1 /AE3 monoklonalt antistof (1: 100) blev nu i blokerende buffer, og sektionerne blev inkuberet ved 4 ° C natten over. Peroxidase /DAB, kanin /Mouse, DAKO fra Envision ™ Detection Systems blev anvendt i de følgende trin. Snittene blev modfarvet med Mayers hematoxylin, dehydreret i en gradueret alkoholserie, klaret i xylen, og monteret. Metastase V er defineret som tilstedeværelsen af ​​isolerede cancerceller i mesogastrium der er diskontinuert fra den primære læsion og ingen lymfeknuder detekteret på samme glas, som detekteres af HE farvning og immunfarvning for cytokeratin AE1 /AE3.

immunhistokemi billedanalyse

intensiteten af ​​reaktionsproduktet af E-cadherin og DAB2IP immunohistokemi blev målt semikvantitativt ved hjælp Image Pro Plus Software 6.0 (Media Cybernetics, CA, USA). Denne procedure kan opdeles i syv forskellige trin: 1. skabe og måle arealet af interesse (AOI); 2. kalibrering af optiske densitet; 3. erhverve, konvertering og lagring af billeder; 4. udføre korrektionen baggrund og baggrund farvning; 5.setting af AOI i den erhvervede billede for at måle den optiske densitet; 6.Måler densitet; 7.creating makroer [13].

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført af SPSS-version 17.0. Beskrivende data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. X

2 test blev Fishers eksakte test anvendes til at bestemme betydningen af ​​forskellene mellem de kovariater. Overlevelsesraterne varigheder blev beregnet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og blev analyseret ved log-rank test for at sammenligne de kumulative overlevelse varigheder i patientgrupperne. Overlevelsen kurve blev beregnet fra tidspunktet for kirurgi. Den Cox proportionel risiko model blev brugt til at beregne univariate og multivariate farer nøgletal for undersøgelsens parametre. For alle forsøgene blev en P-værdi på mindre end 0,05 anses for at være statistisk signifikant.

Resultater og

Påvisning af Metastase V

blev opdaget Discussion

Metastase V i 9 af de samlede 74 (12%) patienter med H 30%) eller serøse lag (2/4 tumorer; 50%) sammenlignet med tumorer, der invaderer submucosa lag (1/40 tumorer; 2,5%), som var statistisk signifikant (P = 0,001). Desuden blev lymfeknudemetastase også tæt forbundet med Metastase V. Metastase V var mere hyppige som antallet af lymfeknudemetastase forøget (n0: 1/45, 2,2%; N1: 4/18, 22,2%; N2: 1/6 , 16,7%; N3: 3/5, 60%; henholdsvis P = 0,001). Dårligt differentierede tumorer var mere tilbøjelige til at have Metastase V, men er ikke statistisk signifikant (P = 0,489). Der var ingen signifikante forskelle mellem Metastase V-positive og metastase V-negativer i form af køn, alder, tumorstørrelse, tumor placering og histologiske undertyper (tabel 3 og S1 tabel).

Survival

Baseret på vores opfølgningsdata, prognosen for alle Metastase V-positive patienter var signifikant (P = 0,006) værre end Metastase V-negative patienter (fig 3A). Derudover analyserede vi den prognostiske betydning af Metastase V i de forskellige tumor undergrupper (T2, T3 og T4) eller kliniske stadier (II og III). Prognosen for patienter med Metastase V-positive var signifikant dårligere end dem med Metastase V-negativ i T3 undergruppe (P = 0,004, Fig 3B) eller i klinisk fase II (P = 0,0005, fig 3C), mens ingen signifikant forskel i prognosen blev fundet mellem Metastase V-positive og metastase V-negativer i T2, T4 undergrupper eller i trin III (data ikke vist). Vi evaluerede også prognostiske faktorer, der påvirker den samlede overlevelse. Ifølge en univariat analyse blev diameteren størrelse (P = 0,02), lauren klassifikation (P = 0,01) og metastase V (P = 0,002) signifikant forbundet med patientens overlevelse (S2 tabel). I en multivariat analyse, blev Metastase V (P = 0,037), viser sig at være uafhængige prognostiske faktorer (S3 tabel).

(A) De Kaplan-Meier samlede overlevelseskurver viste prognosen metastase V-positive patienter blev signifikant (P = 0,006) værre end Metastase V-negative patienter. (BC) Metastase V-positive patienter havde en signifikant dårligere prognose end Metastase V-negative patienter i T3 undergruppe (P = 0,004, B) eller i klinisk fase III (P = 0,0005; C)

DAB2IP og E-cadherin er nedreguleret i Metastase V

for at vurdere den kliniske betydning af resultaterne og udvikle potentiel terapeutisk mål for Metastase V, var det nødvendigt at undersøge de underliggende molekylære mekanismer. E-cadherin betragtes som en væsentlig markør for EMT (epithelial-til-mesenchymal overgang), kendt som en kritisk proces i biologi cancermetastase [14]. Vores tidligere undersøgelser viste, at tabet af DAB2IP ekspression initieres EMT og fremmes tumorinvasion og metastase [15]. I denne undersøgelse blev den mesogastrium metastase og dens matchende primær tumor og tilstødende normalt væv immunfarvet for DAB2IP og E-cadherin. Vores resultater viste, at ekspression af både DAB2IP og E-cadherin faldt i mesogastrium metastase sammenlignet med i de overensstemmende primær tumor og det tilstødende normale væv (figur 4), hvilket antyder, at DAB2IP-regulerede EMT kan spille en rolle i Metastase V . Da nedstrøms for DAB2IP-medieret Wnt pathway er aktiveringen af ​​transkriptionsfaktorer såsom ß-catenin og p65, detekteret vi også ekspressionen af ​​ß-catenin og p65. Vores resultater viste, at ekspression af både ß-catenin og p65 forøget (samt kernelokalisering) i mesogastrium metastase sammenlignet med i primær tumor (S1 Fig). De nøjagtige reguleringsmekanismer, dog nødt til at blive undersøgt yderligere.

(A) Repræsentant IHC farvning for DAB2IP og E-cadherin fra den samme patient. (B) Den relative kvantitative analyse af E-cadherin og DAB2IP udtryk. En stjerne er angivet statistisk signifikans i normal slimhinde vs. primære tumorer (*, P 0,01). To stjerner anført statistisk signifikans i primære tumorer vs. mesogastrium (**, P 0,01).

Diskussion

I vores undersøgelse, er det klart, at metastatiske cancerceller bor i fedtvæv omkring maven af ​​gastrisk cancer patient. Disse metastatisk gastrisk cancerceller viste tre primære karakteristika: (1). de er placeret i fedtvæv og adskilt fra den primære tumor; (2). der var ingen strukturer af blodkar, lymfe knuder eller andre fartøjer omkring disse metastatiske celler (figur 1C); (3). fedtvæv blev omsluttet af ordentlig fascia. Disse karakteristika viste, at denne type metastase var forskellig fra de fire klassiske typer metastase, herunder direkte invasion, serøs spredning, lymfe metastase eller hæmatogen spredning. Da det var en ny vej, vi udpeget det for øjeblikket, metastaser V [12]. De metastatiske cancerceller spredes normalt inden for forskellige hulrum ved forskellige kræfter, for eksempel, hæmatogen metastaser spreder i blodkarrenes hulrum drevet af cirkulation af blodet, lymfeknude metastaser spreder i lymfe hulrum drevet af cirkulation af lymfe strøm, mens direkte infiltration og serøse spreads er i de serøse hulrum, der viser et gratis autonom spredning eller bevægelse. Vores tidligere data antydet, at Metastase V blev observeret at sprede sig i rette fascia hulrum, og dataene fra denne undersøgelse tyder endvidere, at DAB2IP-medieret EMT kan være involveret i Metastase V sprede gennem fedtvæv (figur 4).

Metastase V var tæt korreleret med tumor invasion dybde i maven væggen. Vores data viser, at de fleste tilfælde af Metastase V forekom hos T3 eller T4A tumorer, selv om nogle også forekom i T1 tumorer (tabel 2). Metastase V blev også korreleret med lymfatisk metastase. Lymfe knuder mellemstationer N1-N3 havde større procentdele af Metastase V end N0, og selvom n0 havde forekomster af Metastase V (tabel 3). Endvidere prognosen for patienter med Metastase V-positive tumorer var signifikant dårligere end dem med Metastase V-negative tumorer, især i T3 eller trin II (figur 3). På grund af det begrænsede antal patienter i aktuelle undersøgelse, bør en større prøve af kohorte patienter blive indskrevet til yderligere analyse. Disse resultater tyder på, at detektion af Metastase V har en dårlig prognostisk relevans hos patienter, som gennemgår en helbredende resektion. Da D2 radikal gastrektomi kan kun begrænset forbedre overlevelsen af ​​avancerede gastric cancer patienter, påvisning af metastaser V i mesogastrium resektion bør være en effektiv metode til udvælgelse af patienter til yderligere terapeutisk kemoterapi eller andre målrettede terapier. Den nøjagtige rute eller mekanisme Metastase V er ikke klart. Det antages, at når den primære tumor invaderer mavevæggen til en vis grad, tumorceller slippe fra det primære site muligt på grund af DAB2IP-reguleret EMT mekanisme, og derefter spredt blandt de fedtvæv i den korrekte fascia hulrum mesogastrium der ligger mellem maven og mesenterium [12].

Metastase V er ikke begrænset kun til gastrisk cancer, men kan også findes i mange andre kræftformer stammer fra forskellige væv, herunder rektal cancer, nefrogen adenom, et al [16,17 ]. I vores undersøgelse var der en incidens på 24% af Metastase V fremskreden mavekræft, og der kan forventes en sådan procentdel at stige, når større tværsnit af et dias pr 0,5 eller 0,25 cm er lavet.

Selvom andre har vist, gennem store serielle sektioner af mesogastrium af større og mindre krumninger, at forekomsten af ​​tumorknuder i mesogastrium kan være så høj som 8% [11], er de patologiske træk og forekomst af Metastase V ikke fuldt undersøgt. For det første baseret på embryonale anatomi, jo større omentum og mindre omentum er ikke fuldt mesogastrium. Mesogastrium skal have to egenskaber: Den ene er, at det skal være placeret langs kanten af ​​maven, den anden er, at det skal vedlægge de vigtigste blodkar i mesenterium, der forbinder dem til vedhæftede organer. I vores undersøgelse blev fire regioner i mesogastrium resektion ved laparoskopi bistået D2 + CME (komplet mesogastrium excision) radikal gastrektomi, og hver region blev opkaldt mLGEV, mRGEV, mLGV, mRGV (fig 1A). Vi analyseret yderligere lokalisering af Metastase V inden for forskellige områder af mesogastrium. Vores data viser, at mLGV og mRGEV oftere opdages med Metastase V end andre mesogastrium (figur 2), hvilket indebærer klinikken betydningen af ​​disse to dele under radikal gastrektomi. Yderligere undersøgelse af afstanden Metastase V fra mavens vægge foreslog rækkevidde eller længden af ​​mesogastrium skal resekteres under radikal kirurgi (Fig 1D).

Det har været velkendt i praksis, at radikal operation for kræft bør omfatte en bloc resektioner af den primære tumor og omkringliggende væv. Imidlertid er det vanskeligt at forstå den nøjagtige afgrænsning af en bloc resektion fører til en mere komplet lymphadenectomy, der udføres. Modellen af ​​Metastase V inden mesogastrium som er omsluttet af den korrekte fascia foreslår en præcis grænse og patologisk retning, som ikke kan dækkes af model af lymfatisk metastaser. Desuden vores resultater er klinisk signifikant, fordi metastase gennem denne vej uvægerligt kræver kirurgisk excision som behandling af valg. I betragtning af, at lokale regionale recidiv kan være tæt forbundet med Metastase V, bør komplet mesogastrium excision (CME) udføres sammen med gastrektomi og D2 lymfeknude dissektion at reducere forekomsten af ​​lokale-regionale recidiv i gastrisk kræft [18]. En randomiseret kontrol forsøg (NCT01978444) er i øjeblikket i gang i vores afdeling at vurdere den kliniske betydning af kirurgisk excision af Metastase V.

Støtte oplysninger

S1 Table. Sammenhæng mellem Metastase V og histologiske undertyper (N = 74)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0142970.s001

(DOCX)

S2 Table. Univariate analyse for faktorer, der påvirker den samlede overlevelse i 67 patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0142970.s002

(DOCX)

S3 Table. Multivariat analyse for faktorer, der påvirker den samlede overlevelse i 67 patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0142970.s003

(DOCX)

S1 Fig. . Ekspression af p65 og β-catenin i normal gastrisk mucosa, primære gastriske tumorer og metastase V i mesogastrium

repræsentant IHC farvning for p65 og β-catenin fra den samme patient

doi:. 10,1371 /journal.pone. 0142970.s004

(TIF)

tak

Vi takker Xiaolan Li for teknisk support og Sanpeng Xu for patologisk analyse. Vi takker også Ernest Johann til redaktionel assistance.