Abstrakt
Metastase til leveren er en vigtig faktor i kolorektal dødelighed af kræft. Tidligere undersøgelser tyder på, at kronisk psykologisk stress er vigtig i udviklingen af kræft, men dens virkning på levermetastaser er ikke undersøgt. For at løse dette, vi etableret en levermetastase model i BALB /c nøgne mus til at undersøge den rolle, kronisk stress i levermetastaser. Vore data antyder, at kronisk stress hæver catecholamin-niveauer og fremmer levermetastaser. Kronisk stress var også forbundet med øget tumorassocierede makrofager infiltration i den primære tumor og forøget ekspression af metastatiske gener. Interessant β-blokker behandling vendt virkningerne af kronisk stress på levermetastaser. Vore resultater tyder på β-adrenerge signalvej er involveret i reguleringen af kolorektal cancer progression og levermetastaser. Desuden har vi anført, at supplerende behandling med en β-blokker kan supplere eksisterende kolorektal cancer behandlinger
Henvisning:. Zhao L, Xu J, Liang F, Li A, Zhang Y, Sun J (2015) Effekt af Chronic Psykologisk stress på levermetastaser af tyktarmskræft i mus. PLoS ONE 10 (10): e0139978. doi: 10,1371 /journal.pone.0139978
Redaktør: Obul Reddy Bandapalli, University of Heidelberg, Tyskland
Modtaget: 30. maj 2015; Accepteret: September 18, 2015; Udgivet: 7 okt 2015
Copyright: © 2015 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation (81403350) og uafhængige innovation projekt Putuo District, Shanghai (2012PTKW004). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Den samlede forekomst og dødelighed af kolorektal cancer (CRC) er faldet på grund af tidlig diagnose og nye terapeutiske metoder [1]. Men stadig en stor udfordring i at forlænge overlevelsen, levermetastaser. Omkring 50 ~ 60% af patienter udvikler levermetastaser, som har dårlige forventede resultater. Derudover nuværende terapeutiske strategier ikke er effektive [2]. Kirurgisk resektion er den eneste potentielle helbredende behandling for CRC levermetastaser. Det er imidlertid begrænset af indikation og kontraindikation, og kun 10 ~ 20% af patienter med levermetastaser modtage kirurgisk behandling. Prognosen for patienter med ubehandlet levermetastaser er dårlig, og det forventede 1-års overlevelse er mindre end 30% [3-4]. For at reducere morbiditet og forbedre prognosen, er det vigtigt at udvikle nye terapeutiske midler. Interessant epidemiologiske undersøgelser antyder, at behandling med propranolol (en non-selektiv β-blokker) reducerer risikoen for visse kræftformer, herunder CRC [5-8].
Nylige undersøgelser tyder på, at en nødstedte følelsesmæssige tilstand er en potentiel risikofaktor for cancer progression. Som kræftdiagnose kan medføre stor nød, patienterne ofte oplever frygt, angst og depression [9]. Disse signaler kan aktivere stress veje, herunder hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) akse og sympatiske nervesystem (SNS), og fremkalde fysiologiske reaktioner. Disse veje kan producere neurotransmittere og hormoner, der ændrer tumor mikromiljø.
Katekolaminhormoner hormoner, herunder noradrenalin (NE) og adrenalin (E), er forhøjet under stress, og spille den centrale rolle i stress respons. Disse hormoner aktiverer receptorer på tumorceller og regulere en lang række biologiske funktioner, der er involveret i cancer progression, herunder cellulær proliferation, migration, invasion, og angiogenese [10-12]. Aktiveringen af β
2-AR signalvej induceret af catecholamin hormoner spiller en central rolle i udviklingen af kræft [13, 14].
Tidligere undersøgelser tyder på, at stresshormoner-induceret CRC celleproliferation er adrenoreceptor afhængig og at kronisk stress kan fremme tumorvækst på subkutant implanterede colon carcinomceller i en nøgen musemodel gennem β-AR-signalvejen [15, 16]. Vi antager, at kronisk stress ville fremme CRC metastase til leveren. Her undersøger vi, hvordan kronisk stress påvirker levermetastaser ved anvendelse af en
in vivo
metastatisk model af tyktarmskræft, og bestemme, om β-AR-signalvejen er påkrævet for udviklingen af CRC.
Materialer og Metoder
Cell kultur og dyr
Menneskelig coloncancercellelinie, HT-29, blev købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences. HT-29 blev dyrket i McCoy’5A medium (Invitrogen), suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen). Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO
2.
Fire uger gamle BALB /c nu /nu mus blev anskaffet fra Shanghai SLAC Experimental Animal Co., Ltd (licens No: SCXK [Hu] 2012-0002) og holdt under SPF stand. Alle procedurer udføres blev godkendt af dyreforsøg etiske komité af Putuo Hospital tilknyttet Shanghai University of traditionel kinesisk medicin.
levermetastaser model
Mus blev injiceret med HT-29 tyktarmskræft celler i milt at producere levermetastaser. Musene blev bedøvet med 2,5% pentobarbital natrium ved peritoneal injektion. Efter sterilisering af huden i området for kirurgi, blev en abdominal incision parallelt venstre subcostal margen lavet. Tumorceller (1 × 10
7) i 100 pi phosphatpufret saltopløsning blev injiceret i milten ved anvendelse af en 29-G kanyle. Efter tryk på pinhole 1-2 min med aseptiske vatpinde til at forhindre cellerne i at lække ud, blev milt returneres ind i bughulen. Såret blev lukket med 5-0 Vicryl suturer
Kronisk stress og drug administration protokol
Mus blev randomiseret i 6 grupper:. Blank-Control (BC, n = 10), Blank- stress (BS, n = 10), Propranolol-Control (PC, n = 10), Propranolol-stress (PS, n = 10), ICI118,551-Control (IC, n = 10) og ICI118,551-stress ( IS, n = 10). Mus i de stress grupper oplevede fysisk fiksering i 6 timer om dagen i 35 dage begyndende 7 dage før tumorcelleinjektion. Alle mus blev aflivet 28 dage efter tumorcelleinjektion, samt milt og lever blev høstet og vejet.
I p-adrenerge antagonist-undersøgelser, (±) -propranolol hydrochlorid (et ikke-selektivt β-blokker, 10 mg /kg /dag, Sigma, P0884) og ICI118,551 (en selektiv β
2-blokker, 25 pM /30 pi, Sigma, I127) [17] blev leveret til mus subkutant ved osmotisk minipumpe (Alzet, model 1004). Lægemidler blev givet under hele forsøget påbegyndes 7 dage før tumorcelleinjektion (figur 1).
(A) Mus i stress grupper blev fastholdt i et særligt rum, der forhindrede dem i at bevæge sig frit. (B) mus i stress grupper oplevede fysisk fiksering i 6 timer om dagen i 35 dage begyndende 7 dage før tumorcelleinjektion. En β-adrenerg antagonist blev givet subkutant ved osmotisk minipumpe. Drug eksponering blev opretholdt under hele forsøget. HT-29-celler blev injiceret i milten på dag 0.
enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA)
Otteogtyve dage efter tumorcelleinjektion, blev musene aflivet, og blod blev høstet fra øjnene og øjeblikkeligt anbragt i rene heparin-belagt Eppendorf-rør. E og NE-koncentrationer i serum blev målt ved ELISA (R 0,05 blev betragtet som signifikant.
Resultater
Kronisk stress-induceret β-adrenerg receptor-aktivering medieret levermetastaser
HT-29-celler (1 x 10
7) var injiceret i milten fra 60 mus for at etablere levermetastaser og aflivet 28 dage efter tumorcelleinjektion til analyse. Alle mus, der undergik tumor injektion i milten udviklede levermetastaser. Repræsentative billeder af milt og metastatisk leveren er vist i figur 2A og 2B. For at undersøge rollen af kronisk stress på primær tumorvækst og levermetastaser, evaluerede vi vægtene af milt og lever. Kronisk stress øget milten vægt med 20,61% (BC
vs
BS:.. 0.13 ± 0,01 g
vs
0,15 ± 0,01 g,
P
= 0,1784), og en betydelig stigning i levermetastaser blev observeret hos mus udsat for kronisk stress (1,6-gange ændring:. 2,73 ± 0,16 g i BC gruppe
vs
4,30 ± 0,27 g i BS gruppe,
P
0,0001, figur 2C). Disse resultater tyder på kronisk tilbageholdenhed stress fremmer levermetastaser.
(A) Repræsentative billeder af milt taget på dag 28 efter tumor celle injektion. (B) Repræsentative billeder af metastatisk leveren taget på dag 28 efter tumor celle injektion. (C) data repræsenterer gennemsnitlig milt vægt fra de seks grupper. (D) data repræsenterer gennemsnit lever vægt fra de seks grupper. **
P
0,01 versus BC gruppe,
#
P
0,05 versus BS gruppe.
Som tidligere undersøgelser antydet, at kronisk stress accelereret kræft progression gennem β-adrenerge signalering, vi behandlede mus med propranolol eller ICI118,551 at hæmme β-adrenerge signalering. Som vist i fig 2D, β-blokker-behandling reducerede levermetastaser induceret af kronisk stress. Sammenlignet med mus i BS-gruppen, mus i PS og IS grupper havde færre levermetastaser. De metastatiske levervægt af mus i PS og IS grupper var signifikant lavere end mus i BS-gruppen (PS
vs
BS:. 3,46 ± 0,28 g
vs
4,30 ± 0,27. g,
P
= 0,0482; IS
vs
BS: 3,35 ± 0,28 g
vs
4,30 ± 0,27 g,
P
= 0,0265).. . Vi observerede ingen signifikant forskel i levermetastaser mellem propranolol og ICI118,551 behandling (
P
0,05).
Kronisk stress opregulerer catecholaminers koncentrationer
Et centralt træk af kronisk stress respons er opregulering af den adrenerge stressrespons pathway, som resulterer i vægttab og øget catecholamin-niveauer [19]. Psykisk stress blev bekræftet efter vægt miste (Fig 3A) og udsættelse for kronisk stress signifikant øget serumniveauer af NE med 30,25% (BC
vs
BS:. 101,5 ± 1,78 ng /L
vs
. 132,2 ± 2,51 ng /L,
P
0,0001, figur 3B), og moderat øget serumniveauer af E med 14,24% (BC
vs
BS:. 37,43 ± 1,76 mg /L
vs
. 42,76 ± 1,82 mg /l,
P
= 0,047, fig 3B). HPLC-ECD-analyse af milt tumorvæv viste signifikant stigning af E med 18,3 gange (BC
vs
BS:.. 5,657 ± 1,613 pg /pl
vs
103,4 ± 25,08 pg /pi,
P
= 0,0177, fig 3C og 3D).
(A) Kropsvægt blev overvåget under hele forsøget. HT-29-celler blev injiceret i milten på dag 0. (B) data repræsenterer gennemsnitlige serumniveauer af NE og E i BC og BS-gruppe, *
P
0,05 versus BC gruppe, **
P
0,01 versus BC gruppe. (C) Repræsentative billeder af HPLD-ECD fingeraftryk af catecholamin niveauer i milt tumorvæv i BC og BS gruppe. (D) data repræsenterer gennemsnitlige niveau for NE og E i milt tumorvæv i BC og BS-gruppe, *
P
0,05 versus BC gruppe.
Effekt af β-adrenerge signalvej på tumor mikromiljø
Tidligere forskning viste, at β-adrenerge signalering regulerer tumor mikromiljø ved at rekruttere eller modificere aktiviteten af tumor associeret makrofager [20]. For at bestemme om kronisk stress påvirker tumormikromiljøet, vi bruges flowcytometri til at kvantificere celle præparat i HT-29 primære tumorer høstet fra milten.
Som vist i fig 4A, kronisk stress forøgede CD11b
+ F4 /80
+ makrofager infiltration (4,2-gange ændring:. 2,79 ± 0,43% af levende celler i BC gruppe
vs
10.33 ± 1,01% i BS-gruppe,
P
= 0,0023 fig 4B). Kronisk stress også øget M-MDSCs infiltration med 2,4 gange (BC
vs
BS:.. 17,15 ± 0,38% af levende celler
vs
35,51 ± 4,27%,
P
= 0,0128, fig 4C og 4D). Kronisk stress primært induceret rekruttering af tumorassocierede makrofager og M- MDSCs til den primære tumor, som G-MDSCs ikke var til stede (
P
0,05). For at bekræfte at tumorassocierede makrofager og M-MDSCs infiltration blev medieret af β-adrenerge signalvej, vi analyserede celle ifølge milt tumorvæv høstet fra stressede mus behandlet med propranolol eller ICI118,551. Som vist i figur 4, β-blokker behandling signifikant ophævede CD11b
+ F4 /80
+ makrofager population i det primære tumorvæv (PS
vs
BS:. 6,71 ± 0,57% af levende celler
vs
10.33 ± 1,01%,
P
= 0,0353; IS
vs
.BS:. 6,60 ± 0,68% af levende celler
vs
. 10.33 ± 1,01%,
P
= 0,0374). Der blev imidlertid ikke betydning observeret i CD11b
+ Gr
loLy6C
hi MDSC populationer (PS
vs
BS:. 28,08 ± 0,80% af levende celler
vs
. 35,51 ± 4,27%,
P
= 0,2722; IS
vs
.BS:. 26,77 ± 0,57% af levende celler
vs
35,51 ± 4,27%,
P
= 0,2116).
(A) CD11b
+ F4 /80
+ celler blev kvantificeret ved flowcytometri i HT-29 primære milt tumorer høstet 28 d efter injektion. (B) data repræsenterer gennemsnit CD11b
+ F4 /80
+ sammensætning i tumorer høstet fra milten. **
P
0,01 versus BC gruppe,
#
P
0,05 versus BS gruppe. (C) MDSCs blev kvantificeret ved flowcytometri i HT-29 primære milt tumorer høstet 28 d efter injektion. (D) data repræsenterer gennemsnit CD11b
+ Gr
loLy6C
hi sammensætning i tumorer høstet fra milten. *
P
0,05 versus BC gruppe.
Effekt af β-adrenerge signalvej på levermetastaser
Tidligere undersøgelser tyder på, at kronisk stress ændrer tumor mikromiljø og kan bidrage til kræft metastaser
i vivo
[21]. For at bestemme om kronisk stress fremmet levermetastaser undersøgte vi ekspressionen af TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, og VEGF i milt tumorer ved RT-PCR og Western blot-analyse. Vi fandt, at TGF-β (9,4-fold stigning,
P
= 0,0040), IL-6 (7,6 gange stigning,
P
= 0,0005), PTGS2 (8,1-fold stigning,
P
= 0,0002), MMP-9 (9,4-dobling,
P
= 0,0081), og VEGF (7,6-dobling,
P
= 0,0005) mRNA ekspression signifikant forøget i mus i BC-gruppen sammenlignet med mus i BS gruppen. Mus behandlet med p-blokkere havde signifikant nedsat TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, og VEGF-mRNA udtryk i milt tumorer sammenlignet med mus i BS-gruppen (fig 5A). blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem propranolol og ICI118,551 behandlinger (
P
0,05).
(A) mRNA ekspressionen af TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9 , og VEGF i forhold til mus i BC gruppe i milt tumorer **
P
0,01 versus BC gruppe,
#
P
0,05 versus BS gruppe,
##
P
0,01 versus BS gruppe. (B) Protein ekspression af TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, og VEGF i milt tumorer. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.
Vi observerede også øget protein ekspression af TGF-β, IL-6, PTGS2, MMP-9, og VEGF-protein i mus udsat for kronisk stress, som var ophævet ved behandling med p-blokkere (fig 5B).
Tidligere undersøgelser tyder på, at kronisk psykologisk stress fremmer metastase ved opregulering af tumor-neovaskularisering og vævsinvasion. Her viser vi, at VEGF, CD31, og MMP9 protein ekspression øges i levervæv indikerer angiogenese og invasion. Expression blev øget betydeligt i mus i BS gruppen sammenlignet med mus i BC-gruppen (VEGF: 2,5 gange stigning,
P
= 0,0014; CD31: 2,1-dobling,
P
= 0,0004; MMP9: 2,2 gange stigning,
P
= 0,0028). Hæmning af β-adrenerge signalering faldt VEGF (PS
vs
BS:.. 0,3091 ± 0,04158
vs
0,5340 ± 0,04043,
P
= 0,0179; IS
vs .
BS:. 0,2854 ± 0,02639
vs
0,5340 ± 0,04043,
P
= 0,0067), CD31 (PS
vs
BS:. 0,3053 ± 0,03593
vs
0,4333 ± 0,01677,
P
= 0,0320; IS
vs
BS: 0,3040 ± 0,02751
vs
0,4333 ± 0,01677,
P..
= 0,0160) og MMP9 (PS
vs
BS:.. 0,3338 ± 0,01203
vs
0,5277 ± 0,04289,
P
= 0,0121; IS
vs
BS:. 0,3187 ± 0,01987
vs
0,5277 ± 0,04289,
P
= 0,0115) proteinekspression (figur 6).. Sammen vore resultater antyder, at aktivering af β-adrenerge signalering er nødvendig og tilstrækkelig til at øge tumorangiogenese, invasion og metastase i nærvær af kronisk stress.
(A) Lever metastatisk tumor prøver blev farvet for VEGF ved immunhistokemi. (B) Lever metastatisk tumor prøver blev farvet for CD31 ved immunhistokemi. (C) Lever metastatisk tumor prøver blev farvet for MMP9 ved immunhistokemi. Alle fotografierne blev taget ved 200 ×. (D) Mean optisk densitet (OD) af VEGF, CD31, og MMP9 i metastatiske levertumorer fra mus i BC, PC, IC, BS, PS, og IS grupper. **
P
0,01 versus BC gruppe,
#
P
0,05 versus BS gruppe,
##
P
0,01 versus BS gruppe.
Kollektivt, vores resultater tyder på, at kronisk stress fremmer CRC levermetastaser gennem β-adrenerge signalering, og understreger vigtigheden af tumor mikromiljø i reguleringen tumorceller invasion.
diskussion
på trods af forbedringer i omfattende terapi for CRC, klinikere står over for udfordringer i behandling af patienter med levermetastaser grund af den begrænsede effekt. I denne undersøgelse fandt vi, at kronisk stress øget vækst og metastase af CRC gennem β-adrenerg signalering (figur 7).
Signalering signifikant forøget tumorcelle formidling
β-adrenerge til leveren, og farmakologiske inhibering af β- adrenerg signalering reduceret levermetastaser. Vores undersøgelser tyder også på, at propranolol kan supplere den eksisterende terapeutiske strategier til at bremse eller forhindre levermetastaser fra CRC, forbedre overlevelsen af patienter, der lider psykisk stress.
Den negative effekt af kronisk stress på resultatet af kræft er veletableret. Kronisk stress aktiverer SNS og HPA-aksen for at fremme frigørelsen af catecholaminer, og yderligere at regulere tumormikromiljøet og påvirke tumorprogression [19]. Catecholaminer er potente stimulatorer af vaskularisering. Tidligere undersøgelser viser, at kronisk tilbageholdenhed stress fører til øgede niveauer af væv katekolaminer og forbedret tumor angiogenese gennem regulering af VEGF og MMP’er udtryk [22]. Derudover havde betablokkere blevet vist at vende stress-forstærkede angiogenese [23]. Andre undersøgelser viser, at kronisk stress hæver stresshormoner, der øger CRC vækst
in vivo
[16]. Her udvider vi på disse undersøgelser ved at undersøge betydningen af katekolaminer i CRC metastaser til leveren. Vores resultater viser, at kronisk stress væsentligt hæver E og NE-niveauer i serum og tumorvæv.
For at afgøre, om kronisk stress var tilstrækkelig til at regulere angiogenese
in vivo
, vi kortlagt blodkar tætheden af lever metastatisk tumor gennem VEGF og CD31 immunfarvning og fandt en betydelig stigning angiogenese i stressede mus hhv. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der påviser, at SNS regulerer angiogenese, vores data tyder β-blokker behandling ophævede stressinduceret vaskularisering. Vi viser også, at kronisk stress eksponering regulerer MMP9-ekspression i leveren metastatisk tumor. Kollektivt vores data antyder, at β-adrenerg signalering regulerer både tumorvaskularisering og invasion.
Kronisk stress kan også ændre tumormikromiljøet og fremme tumorprogression ved at undertrykke værtens immunitet [2, 24]. TAM’er og MDSCs er to store immunosuppressive celler i tumormikromiljøet. TAM’er undertrykker anti-tumorgene immunceller og dermed fremme metastase [25]. Men mekanismen for TAM’er involvering i levermetastaser under udsættelse for kronisk psykologisk stress ikke er blevet defineret,. MDSCs også ophobes i patienter, der rapporterede høje niveauer af psykisk stress [26-27]. Vores data bekræfter tidligere resultater, at kronisk stress former tumor mikromiljø ved at rekruttere flere makrofager og MDSCs i primær tumor, der kan lette metastaser.
Vores data viser, at udsættelse for kronisk stress væsentligt ændrer den primære tumor mikromiljø, der kan lette metastase til fjerne organer. Vigtigere, kan farmakologisk inhibering af β-adrenerge signalering være en hidtil ukendt strategi til minimering CRC metastase til leveren. Vore resultater stemmer overens med epidemiologiske fund forbinder β-blokker brug til reduceret metastase og tyktarmskræft dødelighed [28, 29]. Vores data rejser spændende mulighed, at β-blokker behandling kan være en ny strategi for forvaltning af kronisk stress hos patienter med CRC. Derudover vores resultater understreger vigtigheden af at overveje patientens psykologi i udviklingen af nye terapeutiske metoder til at begrænse kræft progression og minimere metastatisk satser i CRC.
Tak
Forfatterne takker tekniker Yuejin Gao ved Division af Laboratory Animal Science i Putuo Hospital tilknyttet Shanghai University of traditionel kinesisk medicin for fremragende vejledning om dyreforsøg og mus pleje.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.