PLoS ONE: et nyt peptid til samtidig Enhanced Behandling af hoved- og halscancer og Mitigation af oral mucositis

abstrakt

Vi har karakteriseret en hidtil ukendt 21 aminosyre-peptid afledt fra antrum mucosal Protein (AMP) -18 som medierer vækstfremme af dyrkede normale epitelceller og afbøder strålingsinduceret oral mucositis i dyremodeller, mens undertrykke

in vitro

funktion af kræftceller. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere disse dobbelte potentielle terapeutiske virkninger af AMP peptid i en klinisk relevant dyremodel af hoved- og halscancer (HNC) ved samtidig at vurdere dets virkning på tumorvækst og strålingsinduceret oral mucositis i en ortotopisk model af HNC . Bioluminescerende SCC-25 HNC-celler blev injiceret i den anteriore tungen og tumorer, der blev dannet, blev derefter underkastet fokal strålebehandling. Tumorstørrelse blev vurderet under anvendelse af en

in vivo

billedbehandlingssystem og omfanget af oral mucositis blev sammenlignet mellem dyr behandlet med AMP peptid eller bærer (kontroller). Synergi mellem AMP peptid og strålebehandling blev foreslået af den konstatering, at tumorer i AMP peptid /stråleterapi kohorte viste hæmmet vækst vs. stråling terapi kun behandlede tumorer, mens AMP peptid-behandling forsinkede debut og reducerede sværhedsgraden af ​​stråling terapi- induceret oral mucositis. En differentieret effekt på apoptose synes at være en mekanisme, ved hvilken AMP-18 kan stimulere vækst og reparation af tilskadekomne slimhinde epitelceller mens hæmme proliferation af HNC celler. RNA microarray analyse identificerede veje, der differentielt målrettet af AMP-18 i HNC vs. ikke-transformerede celler. Disse observationer bekræfter forestillingen om, at normale celler og tumorceller kan reagere forskelligt på fælles biologiske stimuli, og at udnytte dette fund i tilfælde af AMP-18 kan give en klinisk relevant mulighed

Henvisning:. Chen P, Mancini M, Sonis ST, Fernandez-Martinez J, Liu J, Cohen EEW, et al. (2016) et nyt peptid til samtidig Enhanced Behandling af hoved- og halscancer og Mitigation af oral mucositis. PLoS ONE 11 (4): e0152995. doi: 10,1371 /journal.pone.0152995

Redaktør: Craig Murdoch, University of Sheffield, England

Modtaget: Oktober 1, 2015; Accepteret: 22 marts 2016; Udgivet: April 6, 2016

Copyright: © 2016 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Cancer Institute (www.cancer.gov): CA 176.032 til FGT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Biomodels, LLC. ydet støtte i form af lønninger til forfatterne MM, STS og JFM, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i afsnittet Forfatter Bidrag

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Maria Mancini, Stephen T. Sonis og Juan Fernandez-Martinez er ansat af Biomodels, LLC. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrede ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet on-line i vejledningen for forfattere.

Introduktion

På trods af sin hyppighed, sværhedsgrad og symptomatisk og økonomiske konsekvenser, er der ingen effektiv intervention for oral mucositis (oM) induceret af kemoterapeutiske eller stråling regimer (CRT) anvendes til behandling af hoved og hals kræft (HNC) [1-4]. Klinisk OM kendetegnet ved mucosal nedbrydning resulterer i omfattende, dybe ulcerationer, svær funktion-ændrende smerte, øget risiko for sekundær infektion, bakteriæmi og sepsis, og udvidet behov for gastrostomi fodringer, og ambulant og i-patient understøttende behandling. Stort set alle patienter, som modtager CRT til behandling af HNC udvikle mindst moderat OM; mere end to tredjedele lider alvorlige former for tilstanden.

Aktuel standardbehandling for mucositis er overvejende palliativ mens fokus på smerter kontrol og vedligeholdelse af ernæring. Den eneste godkendte behandling af mucositis hidtil er palifermin (Kepivance®), og dens anvendelse er begrænset til mucositis hos patienter conditioning regimer før hæmatopoietisk stamcelletransplantation [5].

Kompleksiteten af ​​mucositis som en biologisk proces er kun blevet værdsat for nylig [6-8]. Det er blevet foreslået, at betingelsen repræsenterer en sekventiel interaktion af orale mucosale celler og væv, reaktive oxygenarter, proinflammatoriske cytokiner, mediatorer af apoptose, og de lokale faktorer, såsom spyt og orale mikroflora. Det fremgår, at de tidlige ændringer i forbindelse med strålingsinduceret mucosal toksicitet forekommer inden endotelet, og bindevæv af submucosa [6]. Dette resulterer i sidste ende i skader og afbrydelser af epitelbarrieren, det mest kritiske trin i udviklingen af ​​mucositis. Epiteliale barriere funktion afhænger i høj grad af de intercellulære kryds ved apikale-fleste domæner i plasmamembranen, dvs de tætte forbindelser (TJs), som regulerer paracellulær permeabilitet over slimhinder i monolag cellekulturer og

in vivo

[9 ].

Vi har identificeret og karakteriseret en hidtil ukendt 21-aminosyrepeptid afledt fra aminosyrerne 77-97 af antrum mucosal Protein (AMP) -18, også kendt som gastrokine-1 (GKN1) [10-12 ], blev der oprindeligt opdaget i epitelceller i maveslimhinden [10]. Både AMP-18 og peptidet beskytte imod og hurtigere gendannelse fra mucosal skade i dyremodeller af OM induceret af stråling og /eller kemoterapi som anvendes til behandling af patienter med HNC [13, 14]. Peptidet kan let syntetiseres, og udviser langtidsstabilitet. I en musemodel for OM induceret af en enkelt dosis af stråling til snuden, AMP-peptid administreret en gang dagligt i fire dage før bestråling og fortsatte 10 dage bagefter effektivt forhindret fuldstændigt tab af tungen epitel observeret i bestrålede mus, der fik vehikel (saltvand) [13 ]. I etablerede hamster OM modeller induceret af en enkelt dosis af stråling, fraktioneret bestråling, eller fraktioneret bestråling sammen med cisplatin til at simulere konventionelle behandlinger af HNC, daglig subkutan indgivelse af AMP-peptid forsinket indtræden af ​​mucosale erytem, ​​reducerede sværhedsgraden af ​​ulceration og fremskyndet oral slimhinde opsving i alle tre modeller, sandsynligvis delvist af sin anti-apoptotiske virkninger set i kulturer af epitelial og endotelceller [14].

i modsætning til andre i øjeblikket prøvelicens eller symptomdæmpende midler nu i brug for at behandle oral mucositis, AMP peptid og rekombinant human (rh) AMP-18 synes at entydigt målrette TJs at forbinde tilstødende epitelceller ved at øge ophobning af TJ proteiner, hvilket begrænser deres tab under skade, og lette dannelsen af ​​nye TJs følgende slimhinden barriere skade [12, 15]. Denne TJ-forøgende virkning er tæt forbundet med omlejring af perijunctional actin og dannelse af ” polaritet protein “komplekser. AMP-18 ser ud til at nå sine terapeutiske virkninger ved at binde til gastrin /cholecystokinin B receptor (CCKBR) og aktivering af flere signalveje såsom MAPK’er, PI3K /AKT, RhoA og PKCζ [13, 15, 16].

for at fortsætte udviklingen af ​​AMP peptid som et effektivt og sikkert terapeutisk middel, dens virkninger på væksten af ​​cancerceller i fastsættelsen af ​​strålebehandling protokoller

in vivo

blev undersøgt i en xenograft model ved hjælp af podet humane carcinomaceller til generere tumorer i nøgne rotter [14]. Vi rapporteret at fokal strålebehandling signifikant reduceret tumorvolumen som forventet. Uventet administration af AMP-peptid tilsat væsentligt til strålingsinduceret vækstinhibering, hvilket viser tumor suppressor ejendom AMP-18 vi og andre observeret tidligere [11, 17, 18]. Sammen disse resultater antydede, at AMP-peptid behandling af OM ikke ville forstyrre de terapeutiske virkninger af stråling protokoller til behandling af hoved og hals tumorer, eller fremme væksten af ​​kræftceller, men kunne i stedet sensibilisere tumorceller til stråling.

i denne undersøgelse, vi satte sig for at bestemme, om AMP-18 kunne sensibilisere HNC celler til kemoterapeutiske stoffer, og også vise i det samme dyr, gavnlige virkninger af oral mucosa beskyttelse sammen med undertrykkelse af tumorcellevækst efter strålebehandling.

Materialer og metoder

Materialer

kemisk syntetiseret AMP peptid (LDALVKEKKLQGKGPGGPPPK), et kodet peptid (GKPLGQPGKVPKLDGKEPLAK), og rekombinant human (rh) AMP-18 blev fremstillet ved genscript (Piscataway, NJ) som tidligere beskrevet [13]. Kort fortalt rhAMP-18 udtrykkes og oprenses som et His

6-tagget fusionsprotein. Den kodende sekvens for fuld længde human AMP-18 blev klonet ind i en

E

.

coli

ekspressionsvektor, pGSE3, og det udtrykte protein blev oprenset fra 5 L dyrkningsmedium ved affinitetssøjlekromatografi. AMP peptid og rhAMP-18 viste sig at være lige så effektiv i at udløse cellulære reaktioner som tidligere rapporteret [13-15]. Celledyrkningsmedium, føtalt bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin blev erhvervet fra Gibco BRL, Life Technologies (Gaithersburg, MD). Tumornekrosefaktor (TNF) -α blev købt fra PeproTech (Rocky Hill, NJ), og andre reagenser fra Sigma-Aldrich, medmindre andet er angivet.

cellekulturer

For at undersøge effekten af ​​behandling med AMP peptid eller AMP-18 i cancerceller udsat for cisplatin, to etablerede humane HNC cellelinier, der blev vist i præliminære undersøgelser at udvise forskellig sensitivitet over for cisplatin blev anvendt: SCC-25 (American Type Culture Collection, ATCC CRL1628) (Manassas, VA), som er mere følsom end SCC-61 [19]. SCC-25-cellelinie er blevet fastholdt i forfatternes laboratorium for 3 år; SCC-61 celler blev etableret og autentificeret af Weichselbaum

et al

. [20-22], modtaget som en gave, og opretholdes i 4 år. Celler blev dyrket i en 1: 1 blanding af Dulbeccos modificerede Eagles medium og Hams F12-medium indeholdende 1,2 g /l natriumbicarbonat, 2,5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES og 0,5 mM natriumpyruvat og suppleret med 400 ng /ml hydrocortison, 10% FBS, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 ug /ml) ved 37 ° C i en fugtig inkubator tilsat 5% CO

2. SCC-25 og SCC-61-celler (2 x 10

3 /brønd) blev dyrket på plader med 96 brønde i 24 timer i medium indeholdende 1% FBS, og blev derefter efterladt ubehandlet, udsat for cisplatin alene (2 pM for SCC-25-celler, 10 um for SCC-61 celler), cisplatin i nærvær af 2 ug /ml AMP peptid eller rhAMP-18 (opløst i phosphatbufret saltvand, PBS, køretøj) i 48 timer. Cellelevedygtighed blev analyseret ved CellTiter-Blå reagens under anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Tek, Winooski, VT). Eksperimenter blev udført i fire eksemplarer. Menneske, voksen, (lav koncentration af) Calcium, forhøjet temperatur (HaCaT) hudkeratinocyter, en ikke-transformeret cellelinie bruges til at modellere normal lagdelt pladeepitel af mundslimhinden [23], blev opnået fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) og opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium med FBS, penicillin og streptomycin som beskrevet [13] i 5 år. Oral tert-2 udødeliggjort keratinocytter blev betragtet som en celle model til at sammenligne med oral cancer [24], men det HaCaT-cellelinje blev valgt, fordi det er blevet mere udbredt til dette formål.

Oprettelse af ortotopisk Model of HNC i nøgne mus

for at undersøge mulige synergieffekter af AMP peptid om begrænsning af kræft cellevækst samtidig beskytte mod oM i det samme dyr, en ortotopisk model af HNC blev brugt. Tumorer i tungen blev genereret, deres størrelse blev vurderet ved anvendelse af en

in vivo

billeddannende system (IVIS), og omfanget af strålingsinduceret OM blev sammenlignet mellem dyr behandlet med AMP peptid eller bærer (kontroller). brug Animal blev godkendt af Biomodels ‘Institutional Animal Care og brug Udvalg (12-1016-01). Kontoret for Laboratory Animal Welfare sikkerhed nummer er A4591-01.

På grundlag af foreløbige

in vivo

undersøgelser blev SCC-25 celler mærket med en lentiviral dobbelt selvlysende og fluorescerende billeddannelse vektor UBC-GFP -T2A-Luciferase (LUC) (System Biosciences, Inc., Mountain View, CA), og sprøjtes ind i forreste tungen til at danne tumorer. Disse bioluminescerende SCC-25-celler, kaldet SCC-25-LUC, aktivere

in vitro

selektion af positive celler ved flowcytometrisk sortering under anvendelse grønt fluorescerende protein (GFP) og ikke-invasiv overvågning af cellulære dynamik anvendelse af en

in vivo

billeddannende system (IVIS) (Perkin Elmer) for at måle tumorstørrelsen. SCC-25-LUC-celler blev sorteret 3 gange af BD FACSAria (BD Biosciences), således at GFP-positive celler blev 95% (data ikke vist). Følsomheden og nøjagtigheden af ​​

in vitro

in vivo

celle overvågning giver flere fordele i forhold til traditionelle metoder, der kræver ofrer dyr og histologisk analyse. Desuden har histopatologiske korrelater til de kliniske forandringer vurderes i modellen blevet grundigt dokumenteret [13, 25], således at histologi var ikke en del af den aktuelle undersøgelse.

athymiske nøgne mus (Foxn1

nu ) (alder 6 til 8 uger, kropsvægt 29,5 ± 2,0 g) blev erhvervet fra Charles River Laboratories. Mus blev bedøvet med isofluran og 1 x 10

6 SCC-25-LUC-celler suspenderet i 30 pi 1x HBSS blev injiceret direkte i den anteriore tungen ved anvendelse af en 0,1 ml tuberkulin sprøjte med en 30 gauge nål, som beskrevet af Myers

et al

. [26]. Efter 21 dage for at tillade tumorvækst, blev i alt 32 mus randomiseret i 4 grupper (8 mus /gruppe) på grundlag af en kvantitativ vurdering af tumorstørrelse som bestemt ved total flux fra hver tumor målt med IVIS imaging [27].

dagen for randomisering blev betegnet dag 0. Dyr i gruppe 1 blev ikke behandlet, Gruppe 2 mus modtog vehikel (PBS), og gruppe 3 og 4 modtog AMP-peptid i en dosis på 25 mg /kg en gang dagligt ved subkutan (sc) injektion. På undersøgelsesdag 4 blev dyr i gruppe 2 og 4 fik en enkelt akut dosis på 30 Gy stråling rettet mod tungen til behandling af tumorer og inducere OM. Modellen isolerer målvævet (tunge) med en blyafskærmning og derved undgå systemisk toksicitet. Efter administration af anæstesi blev mus bestrålet med anvendelse af en 160 kilovolt potentiale (18,75-ma) kilde ved en brændvidde på 15 cm, hærdet med et 3,0 mm Al filtreringssystem. Behandling med AMP peptid eller køretøj blev fortsat i 14 dage.

Dyrene blev bedøvet, deres tunger forsigtigt ekstruderes under anvendelse af en pincet og fotografier blev opnået at dokumentere tumorudvikling. Tumorvækst blev vurderet og sammenlignet på dag 5, 8, 10 og 14 ved hjælp IVIS efter injektion af D-luciferin. Efter fotografierne blev taget, blev OM scoret klinisk, og dyrene blev afbildet ved hjælp af IVIS systemet. Før billeddannelse blev mus injiceret med 0,1 ml /20 g legemsvægt på 15 mg /ml D-luciferin-K

+ bioluminescerende substrat i PBS. Ti minutter efter injektion blev musene bedøvet og anbragt i IVIS® Lumina ved maksimal følsomhed i op til 5 minutter eksponering til påvisning bioluminescens med en åben emission filter. Gemte billeder blev indlæst i Living Image® analyse software og farveskalaer blev matchet baseret på maksimal og minimal udstråling (fotoner /sekund /cm

2 /steradian). Identiske regioner af interesse blev trukket for hvert dyr og total flux blev bestemt i form af fotoner /sekund for hver region af interesse.

oral mucositis

Starten og progression af OM blev scoret klinisk hjælp en veletableret seks point skala: Grade 0, ingen abnormiteter. Grade 1, små slimhindeforandringer karakteriseret ved områder med mild erytem, ​​slimhinde intakt. Grade 2, milde mucositis defineret af områder af moderat til svær erytem og overfladiske epitelnekrose sådan at der kan være mild afstødning, men det epitel base er intakt. Grad 3, moderat mucositis karakteriseret ved frank sårdannelse. Sår har typisk områder med nekrose med tilhørende gullig /grå farve med pseudomembrane formation. Samlede areal af ulceration ≤ 25% af tungen overfladeareal. Grad 4, svær mucositis med sårdannelse påvirker 25% til 50% af tungen slimhinde. Mærket erytem og pseudomembrane formation. Tab af smidighed. Grade 5, svær mucositis sår dannelse af stort set alle mucosa risikoområder. Tab af mobilitet og smidighed [25, 28, 29]. Snesevis af 1 og 2 angiver milde stadier af mucositis. Colitis mucositis er karakteristisk for kvaliteter 3-5 med kvaliteter 3 og 4 repræsenterer alvorlige stadier af sygdommen. Repræsentative billeder af denne skala er defineret i figur 1. Efter visuel klinisk scoring blev et fotografi taget af hvert dyrs mundslimhinden ved hjælp af en standardiseret teknik. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev fotografier tilfældigt nummererede og scoret af to uafhængige, trænede observatører, der gradueres billederne i blindet mode ved hjælp af den ovenfor beskrevne skala (blindet scoring). For hvert billede, var den faktiske blindet score baseret på gennemsnittet af de 2 observatørernes scoringer. Kun scorer på blindet, fotografiske evaluering blev rapporteret og anvendes til statistiske analyser.

Repræsentative billeder af stråling-induceret mucositis brugt til scoring vises. Se detaljer i Metoder.

Dyrene blev vejet og overvåget for generelle sundhed dagligt. Ud over standard kost blev alle dyr givet meget velsmagende bløde fødevarer i deres bure. Gruppe vægtændring blev registreret som en gennemsnitlig procent vægtændring.

natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og immunblotting Assay af Caspase 3 Cleavage

For at bestemme rollen af ​​apoptose som en ledning til uensartede AMP-18 effekter på normale epitel- og HNC cancerceller, blev caspase 3 spaltning anvendt som et indeks for celle apoptose og sammenlignet i ikke-transformeret HaCaT og HNC SCC-25 celler udsat for TNF-α ved hjælp immunblotting. Til fremstilling cellelysater blev kulturer skyllet og derefter høstet i iced PBS ved at skrabe monolag med en celle løfteren. De løsnede celler blev pelleteret ved 4 ° C og ekstraheret på is i 30 minutter i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoxycholat, 150 mM NaCl, 100 mM NaF, 10 % glycerol, 10 mM EDTA) indeholdende protease og phosphatase inhibitorer (2 mM natriumorthovanadat, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 50 ug /ml antipain, 1 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin og 1 ug /ml pepstatin). Cellelysater blev klaret ved centrifugering ved 14000 ×

g

i 15 min ved 4 ° C. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-assay (Pierce).

I immunoblotting assays, 30 til 50 ug protein /bane blev løst ved SDS-PAGE, overført til Immobilon membraner (Millipore, Bedford, MA) efterfulgt af blokering med 5% bovint serumalbumin i TBST (20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 ved pH 7,5) og inkuberet med udpegede antistoffer. Efter inkubering med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer blev immunreaktive bånd visualiseret ved anvendelse kemiluminescens (ECL, Amersham Biosciences). Når testet igen, blev blots først strippet med en puffer indeholdende 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS og 0,1 M 2-mercaptoethanol. Billeder blev analyseret ved densitometri. De er vist i figuren immunoblots repræsenterer en af ​​mindst tre eksperimenter.

RNA microarray analyse Sammenligning transformerede og HNC celler behandlet med AMP-18

For at definere forskellen biologiske virkning og relevans AMP- 18 om normalt og tumorvæv, og for at identificere formodede pathwaygen-mål, der kunne mediere de dobbelte terapeutiske virkninger, vi sammenlignede dens virkning på genekspression af dyrkede ikke-transformeret (HaCaT) eller pladecellekræft celler behandlet med AMP-18.

Vi [13, 14] og andre [30-34] har udnyttet den menneskelige udødeliggjort ikke-transformeret hudkeratinocyt HaCaT linje [23] til at modellere den mundtlige slimhindeepithelet og til sammenligning med skællede hoved og hals kræftceller, mens udødeliggjort oral TERT-2 keratinocytter er blevet anvendt sjældnere at modellere oral mucositis.

Totalt RNA blev ekstraheret fra SCC-61 og HaCaT celler, med eller uden AMP-18 behandling, under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen) ifølge producentens specifikationer. RNA integritet og koncentration blev vurderet ved hjælp af en Agilent Bioanalyzer 2100. Totalt RNA blev forarbejdet til biotinyleret cRNA bruge Illumina® TotalPrep ™ -96 RNA Amplification Kit (Ambion, kat nr: 4.393.543). Den cRNA blev hybridiseret til Illumina HumanHT12v4 arrays bruger Illumina forudsat protokoller og scannes ved hjælp af en Illumina HiScan i University of Chicago Genomics Core laboratorier.

Brug microarray data fra HaCaT og SCC-61-celler opnået ved 2 timer og 24 timer efter eksponering for AMP-18 (og ingen kontrol behandling), brugte vi en tilgang, der optimeret en indledende overvåget komponent med efterfølgende statistisk drevet hierarkisk rangordning. Gener, som var mest diskriminerende mellem de to grupper blev klassificeret efter deres diskriminerende værdi som defineret ved deres Fishers forhold, hvori den prædiktive nøjagtighed forskellige bestilt reducerede sæt blev bestemt under anvendelse af en baglæns rekursiv funktion elimination algoritme. Denne procedure elimineres redundante eller irrelevante gener til opnåelse af mest præcise sæt af gener med den største prædiktiv værdi. Vi derefter evaluerede de mest differentielt udtrykte gener for sygdom tilskrivning, pathway forening, og gen-ontologi hjælp GeneAnalytics software og testet funktionelle /fænotypiske foreninger bruger VarElect [8, 35, 36]. De 20 bedste gener udtrykkes forskelligt i SCC-61 og HaCaT celler behandlet med AMP-18 i 2 timer, er vist i S1 tabel.

Statistiske Analyser

Mucositis blev scoret med de blindede fotografier, begyndende på dag 4, og for hver dag derefter. Statistiske forskelle mellem behandlingsgrupper blev bestemt ved anvendelse af Mann-Whitney Rank Sum-test og chi-square-analyse med en kritisk værdi på 0,05. Virkningen af ​​lægemiddelbehandling på mucositis sammenlignet med vehikelkontrol blev vurderet ifølge de følgende parametre: 1. Forskellen i antallet af dage mus i hver gruppe havde svær mucositis (score ≥ 3) blev analyseret. På hver dag blev dyrene scoret (evaluering dag), blev antallet af dyr med en blindet mucositis score på ≥ 3 i hver behandlingsgruppe sammenlignet med bærergruppen. Forskelle blev analyseret på en daglig samt akkumuleret basis. Behandling succes blev bestemt ved en statistisk signifikant lavere antal mus med denne score i en narkotikabehandling gruppe, versus køretøj, som bestemt ved chi-square analyse. 2. rang sum forskelle i de daglige mucositis score i behandlingsgrupper versus køretøjet gruppen blev bestemt. For hver evaluering dag snesevis af køretøjets gruppe blev sammenlignet med den for de behandlede grupper ved hjælp af ikke-parametrisk rang sum analyse. Behandling succes blev bestemt ved en statistisk signifikant sænkning af scores i den behandlede gruppe på to eller flere dage fra dag 4 til dag 14. En envejs ANOVA eller ANOVA på rækker blev anvendt til at evaluere det område-under kurven for animalske vægte og iVIS målinger. Data blev analyseret med Minitab software (Minitab, State College, PA). Grupper blev sammenlignet ved to-halet

t

test eller, i mere end to grupper, ved variansanalyse. Vi overvejede

P

≤ 0,05 signifikant.

Resultater

inhibitoriske virkninger af AMP peptid og rhAMP-18 på HNC Celler

For at undersøge effekten af ​​AMP peptid eller AMP-18 på HNC celler i kultur, menneskelige hoved og hals pladecellecarcinom SCC-25 (fig 2, panel A) og SCC-61 (panel B) celler blev efterladt ubehandlet, udsat for AMP-18 (2 ug /ml), cisplatin (2 pM for SCC-25-celler, 10 uM for SCC-61 celler) udelukkende, cisplatin i nærvær eller fravær af AMP peptid eller rhAMP-18. Cellelevedygtighed blev vurderet med CellTiter-Blue® cellelevedygtighed assayreagenser (Promega) under anvendelse af en mikropladelæser. AMP-18 alene inhiberede vækst af SCC-25 (P = 0,02) og SCC-61 (P = 0,04) celler med 10-15% (figur 2). Cisplatin signifikant hæmmet vækst af begge cellelinier: SCC-25-celler ved 25%, og SCC-61-celler med 50% sammenlignet med kontrolkulturer (P 0,001). Tilføjelse enten AMP peptid eller rhAMP-18 amplificerede cytotoksiciteten af ​​cisplatin ved at hæmme væksten af ​​SCC-25 celler ved hjælp 30% (AMP-peptid, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03), og SCC-61-celler med 65 % (P 0,05) og 75% (P 0,02). henholdsvis

SCC-25 (A) eller SCC-61 (B) celler blev efterladt ubehandlet, udsat for AMP-18 (2 ug /ml), cisplatin (2 pM for SCC-25-celler, 10 uM for SCC-61 celler) udelukkende, cisplatin i nærvær af 2 ug /ml AMP peptid eller rhAMP-18 i 48 timer. Cellelevedygtighed blev analyseret ved CellTiter-Blå reagens. Eksperimenter blev udført i fire eksemplarer. Værdier er middelværdi ± SE. Tilføjelse enten AMP peptid eller rhAMP-18 amplificerede cytotoksiciteten af ​​cisplatin ved at hæmme væksten af ​​SCC-25 celler ved hjælp 30% (AMP-peptid, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03), og SCC-61-celler med 65 % (P 0,05) og 75% (P 0,02), henholdsvis

AMP peptid Behandling additivt Forhindrer Cancer vækst med Stråling

Forrige beviser for, at AMP-peptid kunne sensibilisere kræftceller. for stråling i en xenograft model [14] og to humane HNC cellelinier til cisplatin i kultur (fig 2), sammen med vores undersøgelser i mus og hamstere, at behandling med peptidet havde gavnlige kliniske virkninger i strålings- og cisplatin-induceret OM [ ,,,0],13, 14], fik os til at spørge, om disse to effekter af AMP peptid kunne påvises i en ortotopisk model af HNC i det samme dyr. Fire grupper dyr blev undersøgt: 1. ubehandlet; 2. PBS (køretøj) og stråling; 3. AMP peptid; og 4. AMP peptid og stråling.

For at fastslå virkningen af ​​behandling med AMP peptid på tumor progression med og uden strålebehandling blev tumorer i alle dyr vurderet ved hjælp af IVIS systemet. I ikke-bestrålede mus, de ortotopisk tumorer i tungen voksede progressivt, og administration af AMP-peptid ændrede ikke tumorstørrelse signifikant (gruppe 1 og 3) (figur 3). På dag 5 og 8 IVIS værdier for ubehandlet (6,59 × 10

7 ± 9,6 × 10

6) og AMP peptid behandlet (6,50 × 10

7 ± 8,67 × 10

6) ikke var statistisk anderledes, som det også var tilfældet på dag 10 og 14, når iVIS værdier for ubehandlet (1,78 × 10

8 ± 2,47 × 10

7) og AMP peptid behandlet (1,61 × 10

8 ± 2,32 × 10

7) adskilte sig ikke. Hos mus givet stråling (30 Gy), tumor størrelse, målt som gennemsnit IVIS udstråling, fortsatte med at vokse med PBS (køretøj) behandling (gruppe 2), men forblev uændret med AMP peptid behandling mellem Dage 5 og 8 og dag 10 og 14 ( gruppe 4) (figur 4). Tumorstørrelse (gennemsnit ± SE) i udstrålet mus, givet AMP peptid sammenlignet med mus, der fik PBS, blev signifikant reduceret (P = 0,03), når de vurderes på dag 10 og 14 (fig 4). Denne observation tydede på, at AMP-peptid ikke forstyrrer evnen af ​​fokuserede stråling til at inhibere cellevækst, men snarere standset væksten af ​​cancerceller.

En ortotopisk model af HNC cancer blev etableret ved at pode bioluminescerende SCC-25-LUC celler i den forreste tunge hos nøgne mus. Tumorstørrelse hos forskellige grupper blev vurderet og sammenlignet på dag 5 og 8 samt Days 10 og 14 ved hjælp IVIS efter injektion af D-luciferin. Mus i gruppe 1 og gruppe 3 blev ikke bestrålet, hvorimod dyr i gruppe 2 og 4 modtog 30 Gy på Dag 0 af undersøgelsen. Behandling med PBS (gruppe 2) eller AMP-peptid (gruppe 4) blev indgivet ved injektion s. c. én gang dagligt. I de bestrålede mus, blev behandling med AMP peptid forbundet med langt lavere IVIS udstråling sammenlignet med behandling med PBS, hvilket indikerer, at AMP-peptid reducerede tumorvækst. Repræsentative IVIS billeder af tungen tumorer fra 32 mus vist.

Bestrålede dyr blev behandlet med AMP peptid eller PBS, og IVIS udstråling blev målt på dag 5 og 8, og derefter på dag 10 og 14. middelværdier ± SE blev sammenlignet. I mus, der fik PBS, IVIS udstråling syntes at stige mellem Dage 5 og 8 og 10 og 14, mens udstråling i dyr behandlet med AMP peptid uændret mellem dage 5 til 14. På dag 10 og 14, behandling med AMP peptid væsentligt reduceret tumorstørrelse sammenlignet med behandling med PBS (* P = 0,03). I ikke-bestrålede mus, de ortotopisk tumorer i tungen voksede progressivt; administration af AMP peptid ændrede ikke tumorstørrelse signifikant (ikke vist).

AMP peptid udviste ingen skadelige virkninger på kropsvægt. Mus i alle 4 grupper udviste vægttab efter tumorer blev etableret i tungen, som blev mere markant i bestrålede dyr (data ikke vist).

terapeutiske virkninger af AMP peptid på Stråling-induceret oral mucositis

i overensstemmelse med resultaterne af tidligere undersøgelser, AMP peptid afbødes udviklingen oral mucositis induceret af stråling [14]. Mens udstrålet kontrol (PBS) dyr alle udviklet colitis mucositis (gruppe 2) ved dag 12, blev kun 37,5% af AMP-behandlede dyr (gruppe 4), så påvirket (P = 0,03), mens på dag 11, slimhinde sårdannelse dukkede op i 62,5 % i gruppe 2, men ingen givet AMP-peptid (P = 0,003) (figur 5). Således AMP peptid forsinket indtræden af ​​ulcerativ mucositis og positivt påvirket dens varighed.

Bestråling af tungen og mundslimhinden blev efterfulgt af daglig behandling med AMP peptid eller vehikel (PBS). Colitis oral mucositis, der udviklede blev scoret som beskrevet i

Metoder

. En mucositis score på 3,0 (brudt linie) angiver slimhinde sårdannelse, der korrelerer med betydelige menneskelige orale mucositis. Dyr behandlet med køretøjet nåede en score på 3 på dag 12, hvorimod mus behandlet med AMP-peptid ikke gjorde. Mucositis score var signifikant lavere på dag 11 (* p = 0,003) og 12 (** P = 0,03), men ikke Dag 13 (P = 0,1) hos dyr behandlet med AMP-peptid i forhold til dem, der anføres køretøjet. Værdier er middel ± SE.

AMP-18 Hæmmet Apoptose i HaCaT men ikke i HNC Celler

Seneste resultater fra vores undersøgelser [10-15] og andre [17] tyder på, at AMP-18 har pleiotrope virkninger. AMP-18 stimulerer væksten og er anti-apoptotisk i epitelceller herunder HaCaT keratinocytter [13]. Det ser også ud til at fungere som en tumorsuppressor [37], eventuelt ved at inducere apoptose [38], inhibering af epitel-mesenkymale overgang (EMT) og cancer cell migration [39] og /eller inducere cellulær aldring [40]. Faktisk er udtryk for AMP-18 nedreguleret eller fraværende i mavekræft væv [11, 17, 18], og falder som kronisk gastritis udvikler sig til atrofi og metaplasi [40, 41].

For at afgøre, om apoptose kunne