PLoS ONE: STAT3 Knockdown Reducerer kræft i bugspytkirtlen Cell invasiv og matrixmetalloproteinase-7 Expression i nøgne mus

Abstrakt

Mål

Transducer og aktivator af transkription-3 (STAT3) spiller en vigtig rolle i tumor celle invasion og metastase. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge virkningerne af STAT3 knockdown i nøgne mus xenografter af bugspytkirtelkræftceller og underliggende genekspression.

Metoder

A STAT3 shRNA lentiviral vektor blev konstrueret og inficerede i SW1990 celler. QRT-PCR og western immunblot blev udført for at detektere genekspression. Nude mus xenograft assays blev anvendt til at vurdere ændringer i fænotyper af disse stabile celler in vivo. HE farvning blev anvendt til at evaluere tumorcelleinvasion og immunohistokemi blev udført for at analysere genekspression.

Resultater

STAT3 shRNA held tavshed ekspression af STAT3-mRNA og protein i SW1990-celler sammenlignet med kontrolceller. Vækstrate for STAT3-lyddæmpet tumorceller i nøgne mus var signifikant reduceret i forhold til i kontrol vektor tumorer og forældrenes celler-genererede tumorer. Tumorinvasion i glasset, og musklen blev også undertrykt i STAT3-lyddæmpet tumorer sammenlignet med kontroller. Collagen IV udtryk var fuldstændigt og kontinuerlig omgiver tumorer i STAT3-lyddæmpet SW1990 celler, mens collagen IV udtryk var ufuldstændig og diskontinuerlig omgiver kontrol tumorer. Desuden mikrokar tæthed var signifikant lavere i STAT3-lyddæmpet tumorer end forældrenes eller kontrol tumorer i SW1990 celler. Desuden blev MMP-7-ekspression reduceres i STAT3-lyddæmpet tumorer sammenlignet med parentale SW1990 xenotransplantater og kontroller. I modsætning hertil blev ekspressionen af ​​IL-1β og IgT7α ikke ændret.

Konklusion

Disse data viser tydeligt, at STAT3 spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​tumorvækst, invasion, og angiogenese, der kunne være handling ved at reducere MMP-7-ekspression i bugspytkirtelkræftceller

Henvisning:. Li Hd, Huang C, Huang Kj, Wu Wd, Jiang T, Cao J, et al. (2011) STAT3 Knockdown Reducerer kræft i bugspytkirtlen Cell invasionsevne og matrixmetalloproteinase-7 Ekspression i nøgne mus. PLoS ONE 6 (10): e25941. doi: 10,1371 /journal.pone.0025941

Redaktør: Marcelo G. Bonini, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: Maj 20, 2011; Accepteret: September 13, 2011; Udgivet: Oktober 3, 2011

Copyright: © 2011 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling (nr 09QA1404600) udstedt af fond for videnskabelig forskning for Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai Kommune. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en dødelig sygdom, og er den fjerde mest almindelige årsag til kræft dødsfald i de vestlige lande [1]. De fleste nyere data anslås, at 43,140 nye tilfælde blev diagnosticeret i 2010, med ca. 36.800 tilknyttede dødsfald i USA [2]. Selvom kirurgisk resektion giver en potentiel kur, er kræft i bugspytkirtlen ofte diagnosticeret på de fremskredne stadier grund af manglende symptomer eller uspecifikke symptomer, hvilket gør det umuligt kirurgi. Palliativ kemoterapi kunne forbedre livskvaliteten og potentielt påvirke overlevelse. Disse har ført til en meget dystre prognose for bugspytkirtlen kræftpatienter, dvs., den mediane overlevelse er ca. 3 til 6 måneder og 5-års overlevelsen er 5%. Risikofaktorer for kræft i bugspytkirtlen omfatter rygning, alkoholforbrug, kost højt i rødt kød, men lavt i grøntsager og frugter, kronisk pancreatitis, og familiens historie. Imidlertid har de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for pancreas udvikling kræft ikke blevet belyst, og der er ingen fastlagt retningslinjer for forebyggelse kræft i bugspytkirtlen. Derfor nyskabende fremgangsmåder til at diagnosticere kræft i bugspytkirtlen tidligt for at sikre effektiv terapi er drastisk nødvendigt.

signaltransducer og aktivator for transkription (STAT3) gen er et medlem af STAT-protein-familien af ​​transkriptionsfaktorer. Som reaktion på cytokiner og vækstfaktorer, er STAT familiemedlemmer phosphoryleret af receptor-associerede kinaser, danner homo- eller heterodimerer og translokere i kernen af ​​celler til at binde til DNA og regulere ekspression af målgener. STAT3 aktiveres via phosphorylering af tyrosin 705 og serin 727 som reaktion på forskellige cytokiner og vækstfaktorer (såsom interferon, EGF, og interleukiner). STAT3 spiller en vigtig rolle i mediering forskellige cellulære processer (fx cellevækst, apoptose og differentiering) [3]. Tidligere undersøgelser har vist, at den onkogene STAT-3-protein konstitutivt blev aktiveret i mange humane cancere [4] – [6]. I modsætning hertil inhibering af STAT-3-signalvejen undertrykt cancercelleinvasion i forskellige kræftformer [7] – [9]. I pancreascancer, aktivering af STAT-3 fremmet tumorcellevækst, invasion og metastase, hvilket fører til dårlig patientoverlevelse. Molekylært, kan STAT3 regulere ekspression af VEGF og MMP-2-gener [10] – [11]. Disse to gener sammen med MMP-7, MMP-9, bFGF, IL-1β og IgT7αα er tæt knyttet til tumorprogression (angiogenese, invasion og metastase) [12] – [14]. I den foreliggende undersøgelse, vi udnyttede STAT3 shRNA lentivirus til tavshed STAT3 udtryk. Forrige data fra vores gruppe tyder på, at knockdown af STAT3 hæmmede invasion af kræft i bugspytkirtlen SW1990 celler

in vitro

og markant nedsat VEGF og MMP-2 udtryk [7]. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi, om tavshed af STAT3 i bugspytkirtelkræftceller modulerer tumorcellevækst og invasivitet hos nøgne mus implanteret og bestemmes underliggende signalering mekanismer involveret ved hjælp af et cDNA microarray.

Materialer og Metoder

Celledyrkning og lentivirus-infektion

Den humane pancreas cancercellelinie SW1990 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket med Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en CO 5%

2 og 95% luft-inkubator. At lukke munden STAT3 ekspression konstruerede vi en lentiviral vektor bærende STAT3 shRNA som tidligere beskrevet [7]. SW1990 celler (1 x 10

5) blev podet i hver brønd og dyrket i plader med 6 brønde og derefter inficeret med en negativ kontrol lentiviral vektor (Genechem, Shanghai, Kina) eller den lentivirale vektor, der bærer STAT3 shRNA ved en multiplicitet på infektion (MOI) på 40. Efter tre dage blev cellerne underkastet

vivo

invasion assay.

Kvantitativ real-time revers transkription-polymerasekædereaktion (QRT-PCR)

Samlet RNA blev isoleret fra forældrenes SW1990 og negative kontrol vektor eller STAT3 vektor-inficerede SW1990 celler ved hjælp Trizol reagens fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNA’et blev derefter oprenset under anvendelse af et RNeasy mini kit ifølge producentens instruktioner (Qiagen, Valencia, CA, USA). Efter kvantificering, blev 1 ug totalt RNA fra hver prøve underkastes første-streng cDNA syntese under anvendelse af en PrimeScript RT Reagent (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) ved 37 ° C i 15 min og 85 ° C i 5 s.

qPCR blev derefter udført til påvisning genekspressioner med disse nysyntetiserede cDNA. De specifikke primere til PCR-reaktionen var som følger: MMP-9, 5′-CGGAGTGAGTTGAACCAG-3 ‘(fremad) og 5′-GTCCCAGTGGGGATTTAC-3′ (revers) med en produktstørrelse på 118 bp; MMP-7, 5’-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3 ‘(fremad) og 5′-AAATGCAGGGGGATCTCTTT-3′ (revers) med en produktstørrelse på 169 bp; IL1-β, 5’-CTGAGCTCGCCAGTGAA-3 ‘(fremad) og 5′-GGTCTGTGGGCAGGGAA-3′ (revers) med et produkt størrelse på 239 bp; bFGF, 5’-AGAGCGACCCTCACATCAAG-3 ‘(fremad) og 5′-TCGTTTCAGTGCCACATACC-3′ (revers) med en produktstørrelse på 224 bp; IgTα7, 5’-GCGGCCACTCGGTCTGTGTGGAC-3 ‘(fremad) og 5′-GGAGACTGTAGGACAAGGTCAC-3′ (revers) med en produktstørrelse på 303 bp; p-actin, 5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3 ‘(fremad) og 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’ (revers) med en produktstørrelse på 294 bp. qPCR amplifikationer blev udført under anvendelse af DNA Engine Opticon System (Bio-Rad, Foster City, CA, USA) med SYBR Premix Ex Taq (Takara). Specifikt blev 1 pi af revers transkription reaktionsblanding anvendes til en kvantitativ PCR-reaktion i et totalt volumen på 20 pi. PCR-cykler var 95 ° C i 30 s efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 s. Disse data blev derefter analyseret ifølge den komparative Ct fremgangsmåde og normaliseret til p-actin ekspressionsniveauer inden for hver prøve. Relative ekspressionsniveauer af målgener, efter normalisering til en endogen sekvens, blev givet af 2

-ΔΔ

Ct

.

Vi udførte også PCR array-eksperimenter i en RT

2 Profiler Menneskelig Tumor Metastase PCR Array (PAH’er-028A) fra SuperArray Bioscience (Frederick, MD, USA). Denne matrix indeholder 89 gener og fem “housekeeping-gener” i en 96-brønds plade. Vi udnyttede dette array for at detektere knockdown af STAT3-medieret genekspression ifølge fabrikantens protokol. Hver reaktion indeholdt 40 ng af total RNA og de korrekte negative kontroller (ingen revers transkription og ingen skabelon). Prøverne blev analyseret i tre eksemplarer, og dataene blev normaliseret til GAPDH niveauer ved hjælp af ΔΔCt metoden.

Protein udvinding og vestlige immunoblot

Celler blev lyseret i radioimmunudfældning assay buffer (Beyotime, Haimen, Jiangsu, Kina) indeholdende 1 mmol /l phenylmethansulfonylfluorid på is i 15 minutter. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et BCA proteinassaykit (Beyotime). Lysater blev derefter blandet med SDS-PAGE prøvepåsætningsbuffer og kogt i 5 min. 30 ug totalt celleprotein blev derefter opløst på 8% eller 10% SDS-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev derefter farvet med 0,5% Ponceau S indeholdende 1% eddikesyre for at vurdere for lige lastning og overførsel effektivitet. Membranerne blev derefter blokeret i 5% bovint skummetmælk natten over og med det primære antistof i 4 timer ved stuetemperatur. Efter vask i phosphatbufret saltvand (PBS) blev membranerne inkuberet yderligere med et peroxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. For at detektere positive proteinbånd, blev forøget kemiluminescens-reagens fra Millipore (Billerica, MA, USA) anvendes. De primære antistoffer var som følger: MMP-7 fra R og β-actin fra Biomart (Shanghai, Kina) i en fortynding på 1:1000. Sekundære antistoffer omfattede peroxidasekonjugeret AffiniPure gede anti-mus eller anti-kanin IgG fra Jackson ImmunoResearch (West Baltimore Pike West Grove, PA, USA).

nøgen mus eksperimenter

Seks uger gamle SPF klasse BALB /c nøgne mus blev købt fra Institut for Zoologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Disse mus blev fodret med en standard gnaver kost og vand

ad libitum

på aseptisk laminar strømning værelse med 60% fugtighed -70% ved 25 ° C. To uger efter ankomst, 50 pi-løsninger (indeholdende 2 × 10

6 logaritmiske vækstfase tumorceller) injiceret ind i neglen pude af musene subkutant. Musene blev derefter observeret dagligt for kost forbrug, afføring og psykiske tilstand, og tumorstørrelsen og kropsvægt blev målt hver femte dag. Længden og bredden af ​​tumoren blev målt med en skydelære og beregnes ved hjælp af en formel af tumorvolumen = længde x bredde

2 × 0,5. Brugen af ​​dyr i denne undersøgelse samler med Guide for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Denne undersøgelse blev godkendt af Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (License # SYXK2009-0086).

Immuncytokemi og immunhistokemisk

Tumor celler dyrket på dækglas blev vasket med PBS i tre eksemplarer og fikseret med 4% formaldehyd. Endogen peroxidaseaktivitet fra cellerne blev blokeret med 3% hydrogenperoxid. Dækglassene blev derpå inkuberet med 1% bovint serumalbumin i PBS i 1 time ved stuetemperatur og med primært antistof natten over ved 4 ° C, efterfulgt af inkubation med et sekundært antistof i 30 min. Dækglassene blev derpå modfarvet med hæmatoxylin opløsning.

I immunhistokemisk farvning blev 4 um snit skæres fra formalin-fikserede paraffin-embedded tissue blokke og derefter afparaffiniseret i xylen og rehydreret i successive vaske med ethanol. Snittene blev derefter opvarmet i en mikrobølgeovn ved middel effekt i 8 min i citratpuffer, pH 6,0 til varmeinduceret epitopgenfinding. Sektionerne blev underkastet blokade af endogen peroxidaseaktivitet og ikke-specifik binding af det primære antistof og derefter målrette proteinlokalisering med det første antistof og visualisering med det sekundære antistof og farvereaktion som beskrevet ovenfor. Salg

De primære antistoffer inkluderet: MMP-7 fra R collagen IV eller PECAM-1 fra Bioworld Technology (Louis Park, MN, USA) ved en fortynding på 1:100. De sekundære antistoffer blev gede-anti-muse eller anti-kanin IgG konjugeret med peroxidase fra DAKO EnVision (DAKO Corp., Carpinteria, CA).

Farvede tumorceller og paraffinsnit blev gennemgået og scoret med et lysmikroskop ved en patolog blindet for behandlingsgruppen. Positivitet af de farvede tumorceller på dækglas og paraffinsnit blev defineret ved farvning intensitet og% af tumorcellerne: farvningsintensiteten af ​​MMP-7-ekspression blev klassificeret semikvantitativt i negativ og svag, moderat og stærkt positiv (0, +, ++ og +++, henholdsvis). I vores undersøgelse blev genekspression være positiv, hvis den farvningsintensitet var moderat eller stærk og procentdelen af ​​positive farvede celler var 20%. Imidlertid blev densiteten af ​​mikrokar der farves positive for PECAM-1 er defineret som positiv ved 400 magt et mikroskop felt som tidligere beskrevet [15].

Statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 12,0 software (SPSS, Chicago, IL, USA). Dataene blev opsummeret som middel ± SD når det er muligt og analyseres med en Student-Newman-Keuls test for at afgøre statistisk signifikans. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Knockdown af STAT3 udtryk ved hjælp STAT3 shRNA

For at demonstrere rolle STAT3 i bugspytkirtelkræft, vi udførte gen knockdown eksperimenter bruger. STAT3 shRNA i SW1990-celler. Vi bestemt, at STAT3 shRNA held slået ned STAT3 udtryk i SW1990 celler, dvs, viste QRT-PCR-data at STAT3 shRNA vektor hæmmede STAT3 mRNA-ekspression i forhold til kontrol vektorer (

P

= 0,004), mens de vestlige immunoblotting data viste den STAT3 proteinet blev markant inhiberet i STAT3 shRNA-transficerede SW1990 celler (

P

= 0,003) (figur 1).

A, qRT-PCR. Stabile STAT3 shRNA og kontrol vektor-transficerede SW1990 celler og forældrenes SW1990 celler blev dyrket og RNA blev isoleret for QRT-PCR-analyse af STAT3 mRNA-ekspression *

P

0,01 sammenlignet med SW1990 eller kontrol vektor-transficerede celler. B, Western immunoblot. Disse celler blev dyrket for total cellulære protein udvinding og vestlige immunoblot analyser af STAT3 proteinekspression.

Undertrykkelse af vækst og invasion af STAT3 shRNA-transfekterede SW1990 celler i nøgne mus

Vi injicerede stabile STAT3 knockdown eller kontrolceller i negle pude af nøgne mus. 10 dage efter inokulation af tumor, fandt vi, at væksten i de STAT3-lyddæmpet tumorceller blev signifikant nedsat (figur 2). Vi fandt også, at ekspressionen af ​​kollagen IV protein omgiver tumorcellerne i kontrol tumorer var ufuldstændig og diskontinuert, det var fuldstændigt og sammenhængende i tumorer af STAT3-lyddæmpet SW1990 celler efter immunhistokemisk farvning (figur 3A B). Tumor celle invasion evne blev fundet på HE-farvede væv xenografter ved lysmikroskop. Endvidere tumorinvasion i glasset, og musklen var hyppigere i kontrolgrupperne tumorer end STAT3-lyddæmpet tumorer (figur 4). Den procentdel af fartøjet og muskel invasion af STAT3-lyddæmpet tumorer var 22,22% (2/9) og 33,33% (3/9) sammenlignet med 60% (6/10), 80% (7/10) og 70% (7 /10), 80% (8/10) i SW1990 tumor og negativ kontrol tumor hhv. Mikrokar tæthed var signifikant lavere i STAT3-lyddæmpet tumorer end forældrenes eller kontrol tumorer i SW1990 celler (

P

= 0,007 og

P

= 0,021, henholdsvis, figur 5). Disse data indikerer, at STAT3 spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​tumorvækst, invasion, og angiogenese.

Parental eller kontrol vektor og STAT3 shRNA-transficerede SW1990 celler blev dyrket i cellekultur og injiceret i nøgne mus søm pads . Tumor volumen blev målt hver fem dage op til 30 dage efter tumorcelleinokulering .. *

P

. 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen vektor eller forældrenes tumorer

tumorxenoplantater fra styrevektor og STAT3 shRNA-transficerede celler blev udsat for immunohistokemisk farvning af collagen IV-protein. Disse data antyder, at collagen IV-ekspression (rød pil) er fuldstændig og kontinuerlig i STAT-3-lyddæmpet tumor (A), men integriteten af ​​collagen IV blev ødelagt dokumenteret ved ufuldstændig og diskontinuerlig (rød pil) farvning (B). × 400 forstørrelse.

Disse nøgen mus xenografter blev taget fra væv behandles til HE farvning. A og B, X 400 forstørrelse, C og D, x 100 forstørrelse. Tumorcelleinvasion i mikrokar er hyppige i styrevektor tumorer (markeret med rød pil i A), men ikke indlysende i STAT3-lyddæmpet tumorer (B). Musklen blev invaderet og ødelagt (sort pil) af tumorceller (rød pil) af SW1990 celler i C, men grænsen er klart mellem muskel (sort pil) og tumor (rød pil) i D.

Vævssnit af nøgne mus xenotransplantater blev farvet for immunhistokemi med anti-PECAM-1-antistof. PECAM-1-positive mikrokar i tumorer blev talt under et mikroskop og samlet. Antallet af mikrokardannelse var 13,00 ± 2,36 pr høj effekt felt (N = 9) i STAT3-lyddæmpet tumorer i forhold til 16,30 ± 2,45 (N = 10) i forældrenes SW1990 tumorer og 15,80 ± 2,57 (N = 10) i vektor kontrol tumorer . Disse forskelle var statistisk signifikante. * P 0,01 vs. forældrenes SW1990 tumorer, ** P . 0,05 vs. kontrol vektor tumorer

Angivelse af tumor invasion og metastase gener efter STAT3 knockdown

Vi bestemt gen udtryk i disse STAT3-bankede ned tumorer ved hjælp af en menneskelig tumor metastase PCR array (# PAH’er-028A) fra SuperArray Bioscience. PCR array-data antyder, at tre gener, dvs., MMP-7, IL-1β og IgT7α blev nedreguleret (reduktioner på 2,54 gange, 23,90 gange og 5,39 gange, henholdsvis) i STAT3-lyddæmpet tumorer i sammenligning med kontrolgruppen og forældrenes SW1990 tumorer. Imidlertid blev otte gener opreguleres,: SYK (3,38 folder), MYCL1 (4,85 folder), MMP-11 (4,59 folder), MMP-3 (10,88 folder), MMP-10 (19.93 folder), CST-7 (3,34 folder ), CDH11 (2,01 folder), og IL-8Rβ (7,06 folder).

Reduceret MMP7 mRNA og protein-ekspression i STAT3-lyddæmpet tumorer

Vi validerede data fra array eksperimenter og udført yderligere analyser ved hjælp QRT-PCR (fig 6A . S1) og vestlige immunblotting (figur 6B) og fandt, at MMP-7, blev MMP-9 mRNA-ekspression faldt betydeligt i STAT3-lyddæmpet tumorer i forhold til forældrenes og kontrol tumorer (

P

= 0,033 og

P

= 0,002

vs.

SW1990 henholdsvis eller

P

= 0,0001 og

P

= 0,011

vs

kontroltumorer, henholdsvis). IL-1β mRNA ekspression blev også signifikant reduceret i STAT3-lyddæmpet tumorer i forhold til forældrenes og kontrol tumorer (

P

= 0,01 og P = 0,0001

vs.

SW1990 og kontrol tumorer, henholdsvis). Der var imidlertid ingen signifikant forskel i bFGF eller IgT7α mRNA-ekspression mellem STAT3-lyddæmpet tumorer eller kontroller (fig. 6A). MMP-7-ekspression på proteinniveauet blev markant undertrykt i STAT3-lyddæmpet tumorer imidlertid MMP-9 blev ikke signifikant påvirket (figur 6B).

A, QRT-PCR. RNA blev isoleret fra de tumor-xenotransplantater og underkastet QRT-PCR-analyser. B, Western-blot. Totalt cellulært protein blev ekstraheret fra den nøgne mus xenotransplantater og underkastet western blot-analyser. **

P

0,01; *

P

. 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen vektor eller forældrenes tumorer henholdsvis

Reduceret MMP-7-ekspression i STAT3-lyddæmpet tumorceller og xenografter

for at bekræfte de ovenstående data, udførte vi immunocytokemi på STAT3 knockdown celler og nøgne mus xenotransplantater. Vore data antyder, at STAT3-lyddæmpet SW1990 celler eller xenotransplantater udtrykte lavere niveauer af MMP-7-protein i cytoplasmaet i forhold til de parentale og kontrolceller og xenotransplantater (figur 7), hvilket stemmer overens med invasionen tilbageholdenhed i nøgne mus xenotransplantater. Disse data indikerer, at STAT3 regulering af invasion kapacitet i bugspytkirtelkræftceller er forbundet med nedregulering af MMP-7-ekspression.

Tumorceller fra parental, vektor kontrol og STAT3-lyddæmpet SW1990 celler blev dyrket i et monolag eller i nøgne mus. Monolagcellerne og tumorxenografter blev derefter udsat for immuncytokemi og immunhistokemi farvning af MMP-7-proteinet. A, parentale celler; B, STAT3-lyddæmpet celler; C, forældrenes tumorer; D, STAT3-silecnced tumorer. X 400 forstørrelse. Rød pil, tumorceller.

Diskussion

STAT3 shRNA held slået ned udtryk for STAT3 mRNA og protein i SW1990 celler sammenlignet med styre vektor-transficerede SW1990 celler. Vi derefter subkutant injiceret kontrolvektoren og STAT3 shRNA-transficeret SW1990 celler i nøgne mus. Vore data antyder, at væksthastighed STAT3-lyddæmpet tumorceller i nøgne mus betydeligt reduceret sammenlignet med kontrol vektor celler. Tumor invasion ind i karret og muskler var mere sjældne i STAT3-lyddæmpet tumorer end i kontrol- tumorer. Ekspression af kollagen IV protein omgiver tumorcellerne var fuldstændigt og sammenhængende i tumorer af STAT3-lyddæmpet SW1990 celler, mens collagen IV udtryk var ufuldstændig og diskontinuerlige inden kontrol tumorer. Endvidere mikrokar densitet var signifikant lavere i STAT3-lyddæmpet tumorer end parentale og kontrol tumorer i SW1990-celler. På molekylært niveau, var MMP-7-ekspression reduceres i STAT3-lyddæmpet tumorer i sammenligning med kontrolgruppen og forældrenes SW1990 implanteret. Data fra den aktuelle undersøgelse viser tydeligt, at STAT3 ikke spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​tumorvækst, invasion, og angiogenese.

Men vi fandt ikke signifikante ændringer i MMP-9 proteinekspression, selv udtryk for MMP9 mRNA blev reduceret. Årsagen til denne uoverensstemmelse kan skyldes vævsinhibitor af metalloproteinaser 1 (TIMP-1) faldt, da STAT3 silencing førte til aktiverede MMP-9 forhøjelser, som faldt ekspression af MMP9 mRNA gennem negativ feedback [16], [17]. Desuden er vores nuværende data tyder også nogle uoverensstemmelser mellem PCR array og QRT-PCR-data. Faktisk PCR array er en ny teknik til at undersøge differentiel ekspression af målgener ved mRNA-niveauet med højt gennemløb, følsomhed og specificitet. Men disse data altid skal bekræftes ved hjælp af QRT-PCR, hvoraf nogle kan kontrolleres (bekræftet) ved hjælp af qPCR,. Derfor kan skyldes designe af primeren og vanskeligheden ved at styre annealing temperatur fører til ikke-specifikke amplifikationer i PCR array. Således kunne QRT-PCR data være mere specifik og pålidelig. Selv om vi har vist nogle gener, der blev opreguleres efter tavshed af STAT3 udtryk, vil vi gerne understrege de gener, der blev nedreguleret efter STAT3 stilhed i den aktuelle undersøgelse.

STAT3 er en central transskription faktor, der er onkogen i menneskelig celler [18], [19]. Janus kinase (JAK) /STAT3 signalering spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellevækst og differentiering og tumorinvasion og metastase i forskellige humane cancere [20] – [22]. I kræft i bugspytkirtlen, de seneste undersøgelser har vist, uhensigtsmæssig og konstitutiv aktivering af STAT3 [23], [24]. I en tidligere undersøgelse foretaget af vores gruppe, vi rapporterede nedregulering af STAT3 udtryk undertrykt invasion kapacitet bugspytkirtelkræftceller

in vitro

[7]. I denne undersøgelse fandt vi, at silencing af STAT3-ekspression undertrykte tumorvækst og invasion og mikrokar tæthed i nøgne mus. Disse data er i overensstemmelse med en tidligere

ex vivo

undersøgelse [25], hvor forfatterne viste, at ekspressionen af ​​phosphoryleret STAT3 i human gastrisk karcinom signifikant korreleret med tumor invasion og prognose

ex vivo

.

Tidligere undersøgelser af andre og os har vist, at STAT3-øget mikrokar tæthed kan skyldes STAT3 induktion af VEGF-ekspression [7], [26]. En anden undersøgelse også beviser for, at undertrykkelse af invasion og metastase af STAT3 knockdown afhang af VEGF nedregulering af tyktarmskræft celler [27]. Endvidere nedsat ekspression af MMP-2 er en af ​​hovedårsagerne til undertrykkelse af tumorcelleinvasion og metastase efter inaktivering af STAT-3-ekspression i humant melanom [5]. MMP’er spiller vigtige roller i tumorcelleinvasion og metastase ved nedbrydning af bestanddele af basalmembraner og ekstracellulær matrix [28] – [30]. Et stigende antal undersøgelser viser, at visse MMP proteiner er målrettet af STAT3 [31], [32]. Xie et al fastslået, at STAT3 aktivering fremmet invasion af melanom celler gennem regulering af MMP-2-genet transkription [33]. Desuden blev MMP-1 og MMP-9 sig at være reguleret af STAT3, som spiller en afgørende rolle i tumorinvasion og metastase [34], [35]. I den aktuelle undersøgelse, viste vi, at knockdown af STAT3 udtryk faldt MMP-7-ekspression i bugspytkirtelkræftceller og nøgen mus implanteret. MMP-7 er den mindste protein i MMP familien, men har den højeste ekstracellulære matrix (ECM) -degradative aktivitet mod forskellige ECM komponenter; det er således i stand til at udløse aktivering af en MMP kaskade og er nært beslægtet med tumorinvasion og metastase [36] – [39]. I kræft i bugspytkirtlen, har MMP-7 er vist at være involveret i tumor celle dissociation fra det oprindelige websted og efterfølgende opnå invasion kapacitet [40], [41]. Andre undersøgelser har antydet, at MMP-7 kunne være et direkte mål for STAT3 i mave- og brystkræft celler [42], [43], hvilket er i overensstemmelse med vores konklusion i bugspytkirtelkræftceller.

I den aktuelle undersøgelse vi udnyttede den nøgne mus søm pad model i stedet for rutinen nøgne mus flanke model af tumorceller. Fordelen af ​​neglen pad model er, at denne model tester ikke kun invasionen evne af tumorceller i fartøjet og muskler, men også en vis fremgangsmåde til inguinale lymfeknuder metastaser af tumorceller. Ikke desto mindre ortotopisk tumormodel er bedst til detektering invasion og metastase evne af tumorceller. I kræft i bugspytkirtlen, vi står over for flere problemer, herunder teknik til at injicere tumorceller i bugspytkirtlen, kirurgi overtalelse høj dødelighed, og usikkerheden om tumor invasion og metastaser (forskellige fra de primære tumorer i bugspytkirtlen). I denne sammenhæng den nøgne mus søm pad model er nem og pålidelig. Disse aktuelle data antyder, at STAT3 knockdown væsentligt ændret invasion evne bugspytkirtelkræftceller, uden nogen metastatiske tumorer i lymfeknuderne i både eksperimentelle og kontrolgrupper. Dette kan skyldes den tidsperiode af forsøgene (30 dage). Denne undersøgelse viste også virkningen af ​​STAT3 knockdown på bugspytkirtelkræftceller

in vivo

, som bekræftede vores tidligere

in vitro

data, som STAT3 spiller en vigtig rolle i at fremme tumorvækst, invasion, og angiogenese , hvorimod undertrykkelse af STAT3-ekspression gjorde inhibere pancreascancer cellevækst, angiogenese og invasion. Disse funktioner af STAT3 kan handle gennem regulering af dens downstream gener, herunder cyclinD1, Bcl-2, VEGF, og MMP-2, som alle blev nævnt i tidligere undersøgelser [26], [44], [45]. I vores undersøgelse fandt vi, at STAT3 hæmning kan reducere MMP-7-ekspression i bugspytkirtelkræftceller. Fremtidige undersøgelser bør fokusere på, om lyddæmpning af STAT3 udtryk ved hjælp STAT3 shRNA eller dens inhibitor såsom ikke-receptortyrosinkinase er nyttig som en ny adjuverende behandling til kemoterapi for bugspytkirtlen kræftpatienter.

Støtte Information

Figur S1 .

QRT-PCR-analyse af SYK, MYCL1, MMP-11, MMP-3, MMP-10, CST-7, CDH11 og IL-8Rβ ekspression i nøgne mus xenotransplantater. RNA blev isoleret fra muse tumorxenoplantater og underkastet QRT-PCR-analyse. Dataene viste, at ekspression af MYCL1, MMP-3, MMP-10 og IL-8Rβ up blev reguleret, men SYK blev nedreguleret i STAT3 stilhed tumor sammenlignet med kontrollen vektor eller parentale tumorer. I modsætning hertil udtryk for CST-7, CDH11, MMP-11 mRNA var ingen forskel i hver tumor prøve

doi:. 10,1371 /journal.pone.0025941.s001

(TIF)