PLoS ONE: Kontrol af TCF-4 Expression af VDR og D-vitamin i Mouse mælkekirtler og Kolorektal Cancer Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

D-vitamin receptor (VDR) vej er vigtig i forebyggelsen og potentielt i behandlingen af ​​mange cancere. En vigtig mekanisme af VDR virkning er relateret til dets interaktion med Wnt /β-catenin pathway. Agonist-bundet VDR inhiberer den onkogene Wnt /β-catenin /TCF pathway ved at interagere direkte med β-catenin og i nogle celler ved stigende cadherin ekspression, som igen, rekrutterer β-catenin til membranen. Her identificerer vi TCF-4, en transkriptionel regulator og β-catenin bindende partner som en indirekte mål for VDR-vejen.

Metodologi /vigtigste resultater

I dette arbejde, viser vi, at TCF- 4 (gen navn TCF7L2) er faldet i mælkekirtlen af ​​VDR-musen sammenlignet med vildtype-mus. Endvidere viser vi 1,25 (OH)

2D

3 øger TCF-4 på RNA og protein niveauer i adskillige humane kolorektale cancercellelinjer, hvis virkning er fuldstændig afhængig af VDR.

I silico

analyse af de menneskelige og mus TCF7L2 initiativtagere identificeret flere formodede VDR bindende elementer. Selvom TCF7L2 promoter journalister reageret på eksogen VDR, og 1,25 (OH)

2D

3, mutation analyse og kromatin immunopræcipitationsanalyser, viste, at stigningen i TCF7L2 ikke krævede rekruttering af VDR til de identificerede elementer og angiver, at forordningen af ​​VDR er indirekte. Dette bekræftes yderligere af kravet om

de novo

proteinsyntese for denne opregulering.

Konklusioner /Betydning

Selv om det generelt antages, at binding af β-catenin til medlemmer af TCF /LEF familie er kræft-fremme, de seneste undersøgelser har vist, at TCF-4 funktioner i stedet som en transkriptionsrepressor der begrænser bryst og kolorektal vækst kræftcelle. Følgelig konkluderer vi, at den 1,25 (OH)

2D

3 /VDR-medieret stigning i TCF-4 kan have en beskyttende rolle i tyktarmskræft samt diabetes og Crohns sygdom.

Henvisning: Beildeck ME, islam M, Shah S, Welsh J, Byers SW (2009) Kontrol af TCF-4 Expression af VDR og D-vitamin i mus mælkekirtler og endetarmskræft cellelinier. PLoS ONE 4 (11): e7872. doi: 10,1371 /journal.pone.0007872

Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, USA

Modtaget: May 15, 2009; Accepteret: 14 okt 2009; Udgivet: November 17, 2009

Copyright: © 2009 Beildeck et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. R01- CA-129-813 (SWB); DoD CDMRP Predoctoral Praktik Award: W81XWH-06-1-0786 (MEB) https://cdmrp.army.mil/bcrp/default.htm; Core Facilities Grant: NIH P30 CA51008 (LCCC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aktivering af D-vitamin-vejen har været forbundet med en nedsat risiko i udviklingen og progressionen af ​​mange kræftformer (revideret i [1]). Selvom epidemiologiske undersøgelser er mindre klare med hensyn til forening af cancer risiko med serumniveauer af vitamin D og dets metabolitter, molekylær biologi og animalske studier understøtter en rolle for D-vitamin i øget apoptose og celledifferentiering og nedsat cellevækst. D-vitamin er en forbindelse, der er tilgængelig i kosten (omend utilstrækkeligt) som supplement, eller umiddelbart syntetiseret af kroppen, er det en attraktiv kandidat til kemoprævention og kemoterapi. Dens kliniske fordel i denne egenskab imidlertid inhiberes af dosisbegrænsende hypercalcæmi, en bivirkning, der udvikler sig fra den primære rolle af vitamin D i calciumhomeostase. I bestræbelserne på at udnytte vitamin D i klinikken som et anti-cancer middel, er blevet gjort bestræbelser på at generere vitamin D analoger, som resulterer i reduceret hypercalcæmi. Mens disse analoger har vist meget lovende

in vitro

i dyremodeller, de falder kort i fremkalde en tilsvarende reaktion i klinikken. Desuden kan en vellykket analog udgøre et særligt problem i forbindelse med kolorektal cancer, den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald hos mænd og kvinder i USA. Selvom beviset for vitamin D som et anti-cancer middel i dette organ er særlig stærk, mavetarmkanalen er tæt involveret i mediering af virkningerne af vitamin D på calciumhomeostase. Dette indikerer, at i tyktarmen, kan det være vanskeligt at koble anti-cancer og calcium homeostatiske virkninger af vitamin D. Selv om der i andre studier viser vi, at nogle vitamin D-partielle antagonister aktiverer vitamin D receptor i celler, der udtrykker høje niveauer af aktiveret β-catenin (cancerceller), men ikke i normale celler og kan have potentiale til at gøre dette [2].

nukleare hormonreceptorer kan påvirke den kanoniske Wnt signalering kaskade ved interaktion med β-catenin [3 ]. Dette fænomen kan være særligt relevant i tyktarmskræft, hvor 80% af tilfældene er en havn i APC-mutationer, der afvigende aktivere β-catenin [4], hvilket fører til ophobning af aktiveret β-catenin i kernen (Anmeldt i [5]). Inden kernen, β-catenin er ansvarlig for co-aktivering af transskription af gener, hvis initiativtagerne er besat af medlemmer af TCF /LEF familie af transkriptionsfaktorer. Nogle af disse gener såsom

c-myc

[6] og

Cyclin-D1

[7], er involveret i cellecyklus regulering og kan bidrage til en onkogen fænotype. Behandling af celler med nogle (men ikke alle) nuklear hormon receptor (NHR) agonister forårsager en opregulering af NHR-responsive gener samtidig bevirker et fald i TCF /β-catenin target gentranskription. Dette er blevet tilskrevet kompetitiv binding mellem TCF og NHRs for β-catenin [3], [8] – [11], og /eller fælles co-aktivatorer, såsom p300 [2]. En anden tilstand af inhibering af Wnt målgen transkription er blevet tilskrevet forebyggelse af β-catenin nuklear translokation ved rekruttering af cytoplasmatisk β-catenin til adherensovergange [9], [12], [13]. For det tredje er der tegn på, at NHRs binder til TCF /LEF familiemedlemmer, direkte, og dermed hæmme transskription af TCF /β-catenin responsive gener [14] – [18]. Dette skyldes sandsynligvis rekruttering af co-repressorer såsom TLE (Groucho) [19], NCoR og SMRT [20].

Her rapporterer vi en mekanisme for interaktion mellem β-catenin vej og vitamin D receptor (VDR) pathway. At tydeliggøre, vil vi anvende følgende nomenklatur: TCF7L2 i forbindelse med plasmider, DNA og RNA, og TCF-4 i forbindelse med protein, kun. Vi fandt, at TCF-4 udtrykkes differentielt i celler afledt af DMBA-inducerede muse brysttumorer fra VDR vildtype- og knockout-mus, og mælkekirtlerne selv. Yderligere udforskning afslørede en VDR-afhængig opregulering af TCF7L2 på mRNA og protein niveauer ved behandling med 1,25 (OH)

2D

3 i CaCo2 celler. Analyse af humane og muse TCF7L2 promotor forudsagt flere formodede vitamin D receptor bindende elementer proximalt til transkriptionsstartsitet. Selv kloning af denne promotor region afslørede regulering af VDR /1,25 (OH)

2D

3, efterfølgende mutation analyse, kromatin immunofældning og proteinsyntese-hæmning forsøg viser, at denne effekt sandsynligvis transporteres indirekte via en VDR /1,25 (OH)

2D

3-følsomme mellemmand. Stigninger i TCF-4 proteinniveauer oversætte til øget TopFlash aktivitet efter 24 timers ligand behandling i CaCo2 celler. Vi foreslår en mekanisme, hvorved denne virkning kan hæmme onkogen aktivitet

i cellulo

.

Resultater

mælkekirtler fra VDR Knockout mus har mindre TCF-4 end brystkirtlerne fra VDR Wild -type mus Salg

VDR145

+ /+ og VDRK240

– /- cellelinjer er afledt af DMBA-inducerede muse brysttumorer fra vildtype (WT) og VDR-knockout (KO) mus, henholdsvis og blev beskrevet tidligere [21]. VDR KO-mus er mere modtagelige for kræftfremkaldende-induceret brystkirtler og kolon carcinogener samt andre læsioner [22], [23]. Indledende forsøg viste, at TCF-4 var mere rigelige i WT celler end KO celler (ikke vist). Udførte vi western blot-analyse for TCF-4 og bekræftede, at VDRK240

– /- celler har meget lave niveauer af TCF-4 sammenlignet med VDR145

+ /+ -celler (figur 1A). Dernæst udføres en pull-down assay, hvor vi anvendte to GST-mærket β-catenin fusionsproteiner. WT GST-mærket β-catenin binder TCF /lefs via bæltedyret repeat-regionen, hvorimod GST-dTCF-β-Cat, som huser mutationer ved resterne 253, 312, og 435 inden bæltedyret region, har dramatisk reduceret affinitet for TCF /lefs [24]. I overensstemmelse med Western blot data, WT fusionsproteinet trukket ned mere TCF-4 fra VDR145

+ /+ lysater end fra VDRK240

– /- lysater. Det muterede fusionsprotein trukket ned meget mindre TCF-4 fra VDR145

+ /+ celler og ingen fra VDRK240

– /-. Celler (figur 1B)

(A) Western blot af hele cellelysater, i to eksemplarer, fra VDR145

+ /+ (VDR + /+) celler (bane 1 og 2) og VDRK240

– /- (VDR – /-) celler (bane 3 og 4) probet for TCF-4, VDR og GAPDH. (B) Pull-down af proteiner i VDR + /+ og VDR – /- lysater med GST-mærket β-catenin konstruktioner og undersøgt for TCF-4. GST-WT-β-catenin (GST-β-Cat) anvendes i bane 1 og 2. muterede β-catenin, der ikke effektivt binder TCF /LEF proteiner (GST-dTCF-β-Cat) anvendes i bane 3 og 4. Perler alene anvendes i bane 5 og 6. (C) OT aktivitet i VDR + /+ og VDR – /- celler transficeret med

Renilla

og VP16-β-catenin. Data er normaliseret til

Renilla

. Fejl- søjler repræsenterer SEM. p-værdier repræsenterer t-test for significan forskelle mellem cellelinier. RLU: relative lysenheder (D) OT aktivitet i VDR + /+ og VDR – /- celler transficeret med

Renilla

, VP16-β-catenin og med eller uden en TCF7L2 plasmid. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Statistikker er t-test for forskelle mellem transficerede og kontrol-transficerede celler. * P 0,05; *** P 0,0005. (E) mælkekirtler væv fra VDR WT (top paneler) og VDR KO (nederste paneler) mus farvet for TCF-4 er vist ved tre forstørrelser.

Vi brugte næste OT /AF reporter-system til assay TCF /β-catenin-aktivitet i disse celler. OT reporter indeholder tre tandem TCF /LEF bindende elementer opstrøms for en luciferase-gen og den tilsvarende kontrol reporter (AF) er muteret TCF-bindingssteder og repræsenterer baggrundsbinding. Fordi disse celler har lav endogen β-catenin-aktivitet, VP16-β-catenin blev co-udtrykt med reporter vektorer i alle prøver. Overensstemmelse med deres reducerede niveauer af TCF-4, VDRK240

– /- celler havde mindre β-catenin aktivitet end VDR145

+ /+ -celler (figur 1C). Denne forskel var betydelig, men ikke store og indikerer, at VDRK240

– /- celler har andre TCF familiemedlemmer, der kan kompensere for TCF-4, og /eller lave niveauer af TCF-4, der forbliver i disse celler er tilstrækkelig til aktivering i det mindste i forbindelse med høje niveauer af aktiveret β-catenin [25], [26]. Co-transfektion med eksogent TCF7L2 reddet den reducerede β-catenin aktivitet i VDRK240

– /- celler (figur 1D). For at afgøre, om dette fænomen også foregik

in vivo

, vi farvede normale brystkirtler væv fra VDR WT og VDR KO mus for TCF-4. I konkordans med resten af ​​dataene i figur 1, brystvæv fra VDR WT dyr har mere fremtrædende farvning i forhold til brystvæv fra VDR KO dyr (figur 1E). TCF-4 farvningen er ikke helt fraværende i VDR KO mælkekirtler, selv om det er langt mindre hyppige og mindre intens (figur 1E, nederste højre panel).

CYP24A1 er den bedst karakteriseres, nedstrøms mål af vitaminet D pathway og dets mRNA er stærkt følsomt overfor VDR-agonister. CYP24A1 er involveret i metabolismen af ​​aktive vitamin D-forbindelser til inaktive metabolitter. Aktivitet af CYP24A1 reporter var fraværende og ikke påvirket af 1,25 (OH)

2D

3 i VDRK240

– /- celler, men blev gendannet efter transfektion af VDR (figur 2A). Tilsammen viser disse data, at celler, der er null for VDR har lavere basale niveauer af TCF-4, og at dette mindsker β-catenin-aktivitet i vores VDR-null mamma model.

(A) CYP24-luc aktivitet i VDRK240

– /- (VDR – /-) og VDR145

+ /+ (VDR + /+) celler, der var transficeret med GFP eller VDR og behandlet med 10

-7 M 1,25 ( OH)

2D

3 eller EtOH-kontrol i 24 timer som angivet. RLU = Relative Light Units. (B) revers transkriptase PCR-analyse af muse CYP24A1 (øverste panel), muse og human VDR (midterste paneler) og β-actin (nedre panel) transkripter som respons på exogen human VDR-ekspression og 1,25 (OH)

2D

3 behandling som beskrevet i del A. (C) Forskellige kolorektale cancercellelinjer blev inkuberet i 24 timer i 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 eller EtOH, som angivet. Cellulære proteiner blev analyseret for TCF-4-ekspression (øverste felt) og GAPDH blev overvåget for lige bane loading (nederste panel). Både TCF-4 bands repræsenterer forskellige isoformer af TCF-4, der har forskellig længde C-termini. (D) CaCo2 celler blev transficeret med forskellige mængder af VDR eller siRNA i 24 timer og behandlet med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 eller EtOH til en efterfølgende 24 timer, som angivet, og probet for TCF-4. NT: Ikke-målretning. (E) Densitometrisk analyse af tre western blots som angivet i del A. Data blev afbildet i forhold til hinanden EtOH-behandlet kontrol. p-værdier blev genereret ved en-halet t-test: * p 0,05; ** P 0,005; *** P .0005 (F) CaCo2 celler blev transficeret i 24 timer med VDRE-luc,

Renilla

og siRNA og behandlet for en efterfølgende 24 timer med 10

-7 M 1,25 ( OH)

2D

3 som angivet. RLU: Relative Light Units. (G) CaCo2 celler blev transficeret med siRNA i 24 timer og behandlet til en efterfølgende 24 timer med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 eller EtOH som angivet. CYP24A1 transkripter blev analyseret ved qPCR. Data er normaliseret GAPDH udtryk og plottet i forhold til hver EtOH kontrol.

VDR /1,25 (OH)

2D

3 Regulerer TCF7L2 mRNA og protein i Colorectal Cancer Cell Lines

Vi næste transficeret VDRK240

– /- celler med human VDR og fandt, at TCF-4 protein og TCF7L2 mRNA var upåvirket af VDR eller 1,25 (OH)

2D

3 (Supplerende Figur S1A og S1B). Bemærkelsesværdigt, selv om aktiviteten af ​​CYP24A1 reporter var følsomme over for exogen VDR og 1,25 (OH)

2D

3 i disse celler (figur 2A), ligesom TCF7L2,

endogen

CYP24A1 mRNA var ikke, trods transfektion optimering, tilladt os at opnå 60% effektivitet (figur 2B). Disse data indikerer, at VDRK240

– /- celler har langlivede ændringer i evnen af ​​endogene målgener som reaktion på den forbigående genoprettelse af VDR. Som eksogent udtrykte promotorer er følsomme, dette sandsynligvis et resultat af ændringer i kromatin organisation, der ikke kan vendes ved kortvarig udtryk for VDR og behandling med 1,25 (OH)

2D

3.

derfor, for yderligere at bestemme virkningerne af VDR og sin klassiske ligand på TCF-4 udtryk, vi analyseret flere kolorektale cancer cellelinjer til ændringer i TCF-4-ekspression i respons på 1,25 (OH)

2D

3 (figur 2C, Supplerende Figur S2). Selv om alle disse celler forøget ekspression af TCF4 som reaktion på D-vitamin vi valgte at bruge humane kolorektal adenocarcinom cellelinie, Caco2 af flere grunde. Disse celler er godt undersøgt i forbindelse med D-vitamin-signalering, og deres vækst inhiberes af 1,25 (OH)

2D

3 [27]. Endvidere er de et unikt system, der efterligner den normale tarmepitelet som, når de bliver sammenflydende de differentierer i kultur [28]. Disse celler udtrykker også VDR, men ved lavere (dvs. normale) niveauer med hensyn til flere andre tyktarmskræft cellelinjer [29], [30]. Behandling af konfluente CaCo2 celler med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 med eller uden transfektion af VDR fører til et robust og statistisk signifikant stigning i TCF-4-protein (figur 2D og E). Virkningerne af 1,25 (OH)

2D

3 er beskedent forstærkes af eksogen VDR, og det er sandsynligvis en undervurdering, da kun 50-60% af cellerne transficeret. Hvad vigtigere er, at stigningen i TCF-4 induceret af 1,25 (OH)

2D

3 er absolut afhængig af VDR, som dens knockdown hæmmer ikke blot virkningerne af 1,25 (OH)

2D

3 på aktiviteten af ​​en VDRE promotor reporter og CYP24A1 mRNA induktion, men også på TCF-4-induktion (figur 2D-G). I modsætning til VDRK240

– /- celler (Supplerende figur S1B), blev TCF7L2 og CYP24A1 mRNA’er steg med 1,25 (OH)

2D

3 i Caco2-celler (figur 3A). Både TCF7L2 og CYP24A1 niveauer var forhøjet efter 4 timer med TCF7L2 når et maksimum induktion ved 24 timer (figur 3B). Denne regulering er også underlagt celledensitet, som statistisk signifikante forskelle i TCF7L2 mRNA kun ses ved højere densitet (Supplerende figur S3). Dette kan være analoge med de beskeden øgning virkninger af exogent VDR på 1,25 (OH)

2D

3-medieret stigning af TCF-4 (figur 2E), som CaCo2 celler vides at opregulere VDR upon sammenløbet /differentiering [31].

(A) qPCR-analyse af CaCo2 celler transficeret og behandlet som beskrevet i figur 2D og 2E. TCF7L2 (venstre panel) og CYP24A1 (højre panel) udskrifter. Data er normaliseret GAPDH og plottet i forhold til hinanden EtOH-behandlet kontrol. p-værdier er afledt af t-test sammenligning mellem EtOH og D

3 kontroller: * p 0,05; **; p 0,005; *** P .0005 (B) CaCo2 celler blev behandlet på forskellige tidspunkter med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 op til 48 timer før afhentning. mRNA for TCF7L2 (venstre panel) og CYP24A1 (højre panel) blev analyseret ved qPCR. Data blev normaliseret til GAPDH og plottet som gange ændring i forhold til 0 Hr tidspunkterne. p-værdier blev afledt fra t-test sammenlignet med 0 Hr tidspunkterne: * p 0,05; **; p 0,005; *** P. 0,0005

VDR /1,25 (OH)

2D

3 Regulerer aktivitet af TCF7L2 Promotor i musemælkekirteltumorvirus og menneskelige Kolorektal Cancer Cells

Siden TCF7L2 reguleres af 1,25 (OH)

2D

3 ved mRNA-niveauet i CaCo2 celler, vi scannet muse og human TCF7L2 gener ca. 4000 basepar opstrøms for transkriptionsstartsitet for tilstedeværelsen af ​​halve websteder, der er i overensstemmelse med den VDRE konsensus RGKTSA (R = A eller G, K = G eller T, S = G eller C), eller halve sites, der afviger lidt fra den konsensus, men der er blevet beskrevet som funktionel VDRE halve steder i litteraturen. Vi identificerede adskillige formodede VDREs kodet på TCF7L2 promotor af både mennesker og mus gen (Supplemental tabel S1 [32] – [41]). Da musen og den humane TCF7L2 promotor andel over 80% sekvensidentitet i de første -2000 basepar, vi klonet to dele af muse-promotoren i en luciferase-konstruktion (figur 4A). En reporter, -1037-luc, indeholder regionen mellem +522 og -515 basepar i forhold til transkriptionsstartstedet og indeholder 5’UTR og den forudsagte TATA-boksen ved -25 basepar. Den -2068-luc reporter spænder regionen mellem 430 og -1542 forhold til det transkriptionelle startsted. Plasmidet navne og efterfølgende omtalte VDREs refererer til afstanden fra startcodonet og ikke transkriptionsstartsitet siden database transcription start sites varierer. De halve steder i -187 /-177 DR4 elementer, (to hexamere halve sites arrangeret som direkte gentagelser afstand af fire nukleotider) opdeling en halv-site mellem dem.

(A) To mus TCF7L2 promotor konstruktioner blev klonet opstrøms for en luciferase reporter. De fire putative VDRE steder i forhold til translationsstartstedet betegnes, og alle VDREs er kodet på den ikke-kodende streng. De -177 og -187 VDREs overlapper hinanden og deler en halv-site mellem dem. Den -1037 konstruktion (-1037-luc) indeholder regionen fra -1 til -1037 i forhold til translationsstartstedet og besidder den -177 /-187 VDRE, kun, medens -2068 reporter (-2068-luc) indeholder regionen mellem -96 og -2068 forhold til translationsstartstedet af muse TCF7L2 promotoren, og har alle fire formodede VDREs. (B) CaCo2 celler blev transficeret i 24 timer med

Renilla

og reportere som angivet samt forskellige mængder af p53. Data er normaliseret til

Renilla

til tomme reporter udtryk. RLU = Relative Light Units. (C) -1038-Luc eller tomme vektorkonstruktioner blev transficeret ind CaCo2 celler med

Renilla

og forskellige mængder af VDR, som angivet. 24 timer efter transfektion blev celler behandlet i yderligere 24 timer med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 eller EtOH vehikelkontrol. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Statistik blev afledt fra to-vejs ANOVA for forskelle mellem EtOH- og 1,25 (OH)

2D

3-behandlede prøver: * p 0,05; **; p 0,005; *** P 0,0005. (D) CaCo2 celler blev transficeret, behandlet og analyseret som i del C ved anvendelse -2068-luc stedet for -1038-luc. Statistik blev genereret ved to-vejs ANOVA for væsentlige forskelle mellem mængden af ​​VDR transfekteret: *** p 0,0005. Fejl- søjler repræsenterer SEM. RLU:. Relative Light Units

Reporter -1037-luc indeholder den første formodede, sammensatte kun VDRE, mens -2068-luc reporter indeholder alle fire VDREs. p53 formindsker aktiviteten af ​​et humant TCF7L2 reporter og vi fandt, at p53 inhiberede også aktiviteten af ​​både -2068-luc og -1037-luc mus reportere [42], [43] (figur 4B). Endvidere basale aktivitet af -2068-luc reporter var markant mindre end -1037-luc reporter indikerer tilstedeværelsen af ​​en stærk repressor element i denne region (figur 4B). I CaCo2 celler, den -1038-luc-konstruktionen reagerer beskedent, men væsentligt, at tilsætningen af ​​ligand men effekten var ikke potenseret af eksogent VDR (figur 4C, venstre panel). I modsætning hertil -2068-luc reagerer kraftigt på eksogen VDR men ikke til behandling med 1,25 (OH)

2D

3 i CaCo2 og VDRK240

– /- celler (figur 4C, højre panel og tillægs- Figur S4A, henholdsvis). Disse data indikerer, at VDR og behandling med 1,25 (OH)

2D

3 påvirkninger aktiviteten af ​​TCF7L2 promotor, men de viser ikke, at effekten er direkte.

Formodede VDREs inden for mus TCF7L2 promoter ikke er vigtige for forordning ved VDR i musemælkekirteltumorvirus og Human tarmkræft Celler

for at teste hypotesen om, at de formodede VDREs var vigtige i at formidle svaret af TCF7L2 promotoren til VDR, tredje og fjerde nukleotider inden for hver halve-site blev muteret til dobbelt alaninrester (figur 5A). De 5 ‘halv-site af -187 blev ikke muteret da 3’half-site, hvis denne VDRE deles med -178 VDRE, og blev muteret i denne konstruktion. Disse mutationer ændrer de halve steder såsom at de ikke er i overensstemmelse med den VDRE konsensus sekvens, og bør ikke binde VDR. Mutationer blev genereret således, at hver VDRE (indeholdende to halve sites, hver) blev muteret i alle syv mulige kombinationer af enkelte mutationer, dobbelt mutationer, og en tredobbelt mutation. Transfektion af disse konstruktioner viste, at de beholdt modtagelighed over for eksogen VDR i CaCo2 celler og VDRK240

– /- (figur 5B og supplerende figur s4b henholdsvis). Vi næste udført kromatin immunofældning (chip) assays til at teste rekruttering af VDR til de seks formodede VDREs identificeret i det menneskelige TCF7L2 promotor (figur 5C). CaCo2 celler blev podet ved høj densitet og behandlet i 4 timer med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3. Både retinoid X receptor (RXR) og VDR blev rekrutteret til de offentliggjorte VDREs på CYP24A1 promotoren (figur 5D, bane 1 og 2), imidlertid hverken NHR blev rekrutteret som helst af de formodede VDREs i den humane TCF7L2 promotorregionen. Disse data antyder, at stigningen i TCF7L2 ekspression ikke skyldes rekruttering af VDR til disse formodede VDREs i muse og humane TCF7L2 promotorer. Det kan betyde, at enten VDR bliver rekrutteret til andre områder af genomet og styre transskription af TCF7L2 direkte eller VDR regulerer dette fænomen gennem en 1,25 (OH)

2D

3-følsomme mellemmand .

(A) Grafisk fremstilling af de fire formodede VDREs inden for de første ~1500 basepar af muse TCF7L2 promotoren og deres sekvenser. DR3: direkte gentagelse afbrudt af tre nukleotider. 2xDR4: to, overlappende direkte gentagelser afbrudt af fire nukleotider. Selvom de formodede VDREs kodes på den ikke-kodende streng, er deres sekvenser skrevet omvendt-komplement således at VDREs kan identificeres som svarende til RGKTSA konsensus. (B) -2068-luc konstruktion, der indeholder alle tre sæt halv-site mutationer (d1502 /d1153 /d177) blev transficeret ind CaCo2 celler og behandlet med ligand som beskrevet i figur 4C med kun 3 koncentrationer af VDR (lav, middel og høj ). Fejl- søjler repræsenterer SEM. Statistik repræsenterer analyse ved hjælp af to-vejs ANOVA: * p 0,05. RLU-Relativ Light Units. (C) Afbildning af de seks formodede VDREs identificeres inden 4000 basepar opstrøms for transkriptionsstartsitet af den humane TCF7L2 promotorregionen og er navngivet i forhold til deres afstand fra translationsstartstedet (+ være nedstrøms, og-er opstrøms). Alle regioner undtagen 88 (markeret med) er kodet på den ikke-kodende streng. (D) kromatin immunpræcipitation af VDR og RXR-bundne DNA-fragmenter fra CaCo2 celler behandlet i 4 timer med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 (D-lige numre baner) eller EtOH (E-ulige baner). De regioner, der forstærker VDRE-holdige regioner er betegnet langs toppen af ​​banerne. CYP produkt forstærker en region af den humane CYP24A1 promotor, der vides at binde VDR og RXR i nærvær af ligand og tjener som en positiv kontrol. IgG repræsenterer ikke-specifik amplificering. Input demonstrerer tilsvarende materiale, der anvendes i hver prøve.

Regulering af TCF7L2 af VDR /1,25 (OH)

2D

3 sandsynligvis medieret af en indirekte mekanisme i Colorectal Cancer Cells

for at teste det sidstnævnte hypotese, vi beskæftigede oversættelsen inhibitor, cycloheximid (CHX). CaCo2 celler blev forbehandlet med forskellige mængder af CHX i 30 minutter og derefter behandlet med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 i 24 timer. I CaCo2 celler, ved koncentrationer så lave som 12,5 pg /ml, CHX var i stand til signifikant at blokere induktion af TCF7L2 mRNA by1,25 (OH)

2D

3, som er DKK-4, en anden indirekte vitamin D target der er negativt reguleret (figur 6) [44]. Disse data viser kravet om

de novo

proteinsyntese for regulering af 1,25 (OH

) 2D

3. Den CYP24A1 mRNA induktion med 1,25 (OH)

2D

3 er også markant hæmmet af CHX, men stadig induceret -20 fold med 1,25 (OH)

2D

3 ved højeste koncentration af CHX (Supplerende figur S5), et fænomen, der er blevet vist for en anden direkte vitamin D målgen, E-cadherin [9]. Reguleringen af ​​CYP24A1 er så dramatisk, at det sandsynligvis kræver den fortsatte syntese af co-aktivatorproteiner at støtte en induktion af denne størrelsesorden. Tilsammen disse data indebærer, at reguleringen af ​​TCF7L2 af VDR /1,25 (OH)

2D

3 er indirekte.

CaCo2 celler blev forbehandlet i 30 minutter med forskellige koncentrationer af proteinsynteseinhibitoren cycloheximid (CHX) før tilsætning af 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 eller EtOH i 24 timer som angivet. Analyse af mRNA overflod af TCF7L2 (øverste felt) og DKK4 (nederste panel) blev analyseret ved qPCR. Fejl- søjler repræsenterer SEM. * P. 0,05 via t-test for signifikante forskelle mellem D

3 versus EtOH behandlede celler

1,25 (OH)

2D

3 Øger TCF Reporter Aktivitet i Kolorektal cancer Cells

Mens reguleringen af ​​TCF7L2 er vigtigt for mange patologiske resultater, vi ønskede at se på det i forbindelse med kræft. Vi valgte at se på effekten af ​​VDR-medieret TCF-4 opregulering via den klassiske TopFlash reporter system, der tidligere er blevet beskrevet (TopFlash modsætning OT, anvender et minimum

c-fos

promotor). CaCo2 celler har en somatisk APC mutation, der tillader β-catenin at akkumulere og translokere til kernen. I tilfælde af over-rigelige, aktiv β-catenin kan vi forvente en stigning i TCF7L2 udtryk at resultere i øget TopFlash aktivitet. Faktisk vi gentaget samme VDR titreringsforsøg som beskrevet i TCF7L2 promoter reporter eksperimenter (Figur 4C), under anvendelse TopFlash (normaliseret til kontrol plasmid, FopFlash) i stedet, og observeret en konsistent, signifikant stigning i TopFlash aktivitet med 24 timers 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 i CaCo2 celler (figur 7), der, ligesom protein data (figur 2D og 2E) forstærkes af VDR. Disse data understøtter en rolle for VDR-afhængig, 1,25 (OH)

2D

3-medieret stigning af TCF-4 i musebryst og humane colorektale tumorceller, kan virkningerne af hvilke differentielt regulerer β-catenin aktivitet

in vivo

.

CaCo2 celler blev transficeret i 24 timer med TopFlash,

Renilla

og forskellige mængder af VDR og behandlet for en efterfølgende 24 timer med 10

-7 M 1,25 (OH)

2D

3 eller EtOH. Luciferase data blev normaliseret til

Renilla

FopFlash og plottet i forhold til hver EtOH behandlet kontrolprøve. Fejl- søjler repræsenterer SEM. p-værdier er rapporteret er fra t-test. RLU:. Relative Light Units

Diskussion

D-vitamin har vist meget lovende som en anti-cancer middel i både molekylære og dyrestudier samt nogle epidemiologiske studier (Anmeldt i [45]). I et forsøg på at afkoble de anti-cancer effekter af D-vitamin fra calcæmiske effekter, der begrænser dens anvendelighed i klinikken, er mange laboratorier dissekere sine downstream-aktiviteter. Adskillige molekylære mekanismer, der bidrager til den potentielle terapeutiske virkning af vitamin D involverer interaktioner med β-catenin pathway. En direkte interaktion mellem β-catenin og en NHR, i dette tilfælde, retinoinsyre receptor blev første gang beskrevet i 1999 [3]. Siden da har mange undersøgelser fundet lignende interaktioner for androgen receptor [8], [10], [11], peroxisomproliferatoraktiveret receptor [18], og VDR [2], [9]. Disse undersøgelser viser, at NHR og TCF /LEF familiemedlemmer konkurrerer om binding til p-catenin og /eller fælles co-aktivatorer, såsom p300. I nærvær af liganden, β-catenin og /eller p300 favoriserer binding til NHR, hvilket medfører en synergistisk opregulering (sammen med NHR ligand) af NHR-regulerede gener, såvel som en samtidig nedregulering af TCF /β catenin responsive gener. Cadheriner er også blevet beskrevet som nedstrøms mål for NHR pathways [9], [12], [13]. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Fejl- søjler repræsenterer SEM. Fejl- søjler repræsenterer SEM.