PLoS ONE: MikroRNA’er Fremkald Epigenetisk omprogrammering og Undertryk Ondartede fænotyper af Humane Colon Cancer Cells

Abstrakt

Selvom kræft er en genetisk sygdom, epigenetiske ændringer er involveret i initiering og progression. Tidligere undersøgelser har vist, at omprogrammering af tyktarmskræft celler ved hjælp Oct3 /4, Sox2, Klf4, og cMyc reducerer kræft malignitet. Derfor kan kræft omprogrammering være en nyttig behandling for kemo- eller stråleterapi-resistente cancerceller. Det blev også rapporteret, at indførelsen af ​​endogene små, ikke-kodende ribonukleotider, såsom microRNA (MIR) 302S og MIR-369-3p eller -5p resulterede i induktion af cellulær omprogrammering. Mirs er mindre end generne af transkriptionsfaktorer, hvilket gør dem eventuelt egnede til anvendelse i kliniske strategier. Derfor har vi omprogrammeret kolon kræftceller ved hjælp MIR-302S og miR-369-3p eller -5p. Dette resulterede i inhibering af celleproliferation og invasion og stimuleringen af ​​mesenchymale-til-epithelial overgang fænotype i colon cancerceller. Vigtigt er det, at indførelsen af ​​de ribonucleotider resulterede i epigenetisk omprogrammering af DNA demethylering og histon modifikation begivenheder. Endvidere

in vivo

administration af ribonukleotider i mus fremkaldte induktion af kræft celleapoptose, som involverer den mitokondriske Bcl2 proteinfamilie. Den foreliggende undersøgelse viser, at indførelsen af ​​MIR-302S og MIR-369s kunne inducere cellulær omprogrammering og modulerer maligne fænotyper af human colorektal cancer, hvilket antyder, at den passende levering af funktionelle små ribonukleotider kan åbne en ny vej til terapi mod humane maligne tumorer .

Henvisning: Ogawa H, Wu X, Kawamoto K, Nishida N, Konno M, Koseki J, et al. (2015) MikroRNA’er Fremkald Epigenetisk omprogrammering og Undertryk Ondartede fænotyper af Humane Colon Cancer Cells. PLoS ONE 10 (5): e0127119. doi: 10,1371 /journal.pone.0127119

Academic Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIEN

Modtaget: Januar 19, 2015; Accepteret: April 10, 2015; Udgivet: 13. maj 2015

Copyright: © 2015 Ogawa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Institutionelle begavelser blev modtaget delvis Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (https://www.taiho.co.jp/english/), Evidence Based Medicinsk (EBM) Research center (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd (https://www.chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd. (https://www.yakult.co.jp/english/index.html), og Merck Co., Ltd (https://www.merck.co.jp/en/index .html). Dette arbejde blev også støttet en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (https://www.mext.go.jp/english/; # 23.390.199, # 25.112.708, # 25134711, # 30253420, # 26670604, MM, KM, HI); en Grant-in-Aid fra Sundhedsministeriet, Labor og Velfærd (https://www.mhlw.go.jp/english/; # H23-003, M.M., H.I.); en bevilling fra National Institute of Biomedical Innovation (https://www.nibio.go.jp/english/index.html; # 12-4, M.M., H.I.); og et tilskud fra Osaka University Drug Discovery Funds (https://www.osaka-u.ac.jp/en/index.html, M.M., H.I.). Delvise bærere blev modtaget fra Takeda Videnskab og Medical Research Foundation (https://www.takeda-sci.or.jp/index.html, MM, HI), Prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund (http: //www.ptcrf.or .jp /engelsk, MM, HI), Suzuken Mindefond (https://www.suzukenzaidan.or.jp, MK), Yasuda Medical Foundation (https://www.yasuda-mf.or.jp, NN), Pancreas Research Foundation (https://www.jprf.or.jp/shoreisho.html, KK), Nakatani Foundation (https://www.nakatani-foundation.jp, HI), og Nakatomi Foundation of Japan (https: //www.nakatomi.or.jp/en/index.html, MK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Institutionelle begavelser blev modtaget delvis Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. (http: //www.taiho.co.jp/english/), Evidence Based Medical (EBM) Research center (https://ebmrce.co.jp/index.html), Chugai Co., Ltd (http: //www. chugai-pharm.co.jp/english/index.html), Yakult Honsha Co., Ltd (https://www.yakult.co.jp/english/index.html), og Merck Co., Ltd ( https://www.merck.co.jp/en/index.html); Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Hver kræftcellen er i vid udstrækning stammer fra stamceller eller stamceller fra normale somatiske væv via genetisk og epigenetiske ændringer. Disse ændringer inaktiverer vækst-tvang tumorsuppressorgener (GTS) og aktivere vækstfremmende onkogener. Normale somatiske celler udvikles fra et befrugtet oocyt gennem en epigenetisk program. Især den ektopisk indførelse af definerede kodning gener, OCT3 /4, SOX2, KLF4, og c-myc (OSKM), eller OSK, der udelukkende udtrykkes i embryonale stamceller (EKSF), inducerer fuld omprogrammering af differentierede somatiske celler tilbage til pluripotente stamceller. Vi har tidligere vist, at indførelsen af ​​OSKM i epitelcancerceller af gastrointestinale organer modulerer den maligne fænotype. Vores resultater viste, at omprogrammering kan undertrykke cancer invasion, lægemiddelresistens, og tumorigenicitet gennem fornyet aktivering af tumor suppressor p16INK4a pathway ved demethylering af promotorsekvensen [1]. Desuden er en nylig mus undersøgelse af transgene OSK forhold viste, at epigenetiske modifikationer er involveret i tumor initiering og udvikling

in vivo

. Denne undersøgelse viste også, at det i kombination med inaktivering af TSG signaler, såsom mutant Apc, kan ændringerne orkestrere epigenetiske ændringer af Polycomb gruppe kompleks til kernen modul af histon H3 ved lysin-27 [2]. Taget sammen med tidligere resultater [1-6], epigenetiske ændringer, uanset årsager eller resultaterne af de genetiske ændringer, der bidrager til forekomsten og udvikling af maligniteter og kan være attraktiv for opdagelsen af ​​nye terapeutiske mål mod human cancer.

Terapeutiske applikationer, der udbygger endogene signalveje skal have minimal toksicitet

in vivo

. I denne forbindelse lægemiddelforskning fra endogene mikroRNA (miRNA, miR), små ikke-kodende ribonukleotider (22 bp i gennemsnit), er potentielle kilder til innovative terapeutiske strategier [7,8]. Fordi syntetiserede modne Mirs ikke integreres i genomet, bør de udøver deres hverv uden uønskede genomiske integration begivenheder og, hvis det kombineres med et lægemiddel delivery system, kunne Mirs udøve disse særlige virkninger for terapeutiske mål [7,8].

Nylige mir opdagelse undersøgelser har identificeret kritiske klynger, herunder MIR-302S, som forbedrer omprogrammering effekt i samarbejde med viral-medieret transskription faktor transfer [9-12]. Det er blevet vist, at et sæt af tre Mirs (MIR-302S, MIR-369s og MIR-200C) valgt blandt talrige Mirs udelukkende udtrykkes i inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) /EKSF, fremkaldte omprogrammering [13]; en væsentlig rolle for MIR-367 blev også vist [12]. Angiveligt, indførelse af MIR-302S inducerede både cellecyklusstandsning ved at interferere med cyclinafhængige kinaser (CDK’er) og global demethylering af DNA i leverkræft og melanom

in vitro

[4,5,14]. Her har vi undersøgt effekten af ​​MIR-302S og MIR-369s

in vitro

in vivo

. Disse resultater antydede, at kræft omprogrammering hjælp MIR-302S og MIR-369s kan være en effektiv behandling mulighed for kræftbehandling.

Materialer og metoder

Cell kultur

Tyktarmskræft celle linjer HT29, DLD-1, SW480, HCT116, Caco2, Colo201, RKO, og LoVo-celler og teratocarcinoma cellelinie NTERA (NTERA 2 /cl.D1 [NT2 /D1]) blev opnået fra Riken (Tsukuba, Japan). Disse celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Nakalai Tesque, Kyoto, Japan) med 10% FBS (Gibco Life Technologies, Tokyo, Japan) og 500 ug /ml penicillin-streptomycin.

Transfektion

Specifikke Mirs og negativ kontrol (NC) miR bruges i

in vitro

in vivo

analyse blev købt (Gene design Inc., Osaka, Japan, S1 tabel). Celler blev transficeret med specifikke Mirs og NC miR ved hjælp lipofektion (LP) eller carbonat apatit (CA). I LP blev celler transficeret med Mirs anvendelse af Lipofectamine iMax (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) ifølge producentens protokol.

Cell omprogrammering

HT29 celler og DLD-1-celler blev transficeret med 10 nM af hver miR hjælp CA. Celler blev inkuberet i RPMI-1640 med 10% FBS i 24 timer og transfektion blev gentaget hver anden dag i i alt tre gange. Efter den tredje transfektion blev celler podet på Matrigel-coatede og mitomycin C-behandlede muse embryonale fibroblaster (MEF). Celler blev dyrket i embryonal stamcelle dyrkningsmedium indeholdende DMEM /F12 (Gibco Life Technologies, Tokyo, Japan), suppleret med 2 mM GlutaMAX, 20% knockout serum udskiftning (Gibco Life Technologies), 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA, Gibco Life Technologies), 10 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, Wako, Tokyo, Japan), 55 uM 2-mercaptoethanol (Gibco Life Technologies), 1% penicillin-streptomycin og kemiske inhibitorer, herunder 0,5 uM A83-01 (Stemgent , Cambridge, MA), 3 pM CHIR99021 (Stemgent), og 0,5 uM PD0325901 (Stemgent), ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. Medier blev ændret hver anden dag, og cellerne blev holdt ved 37 ° C i en CO 21%

2 inkubator i yderligere 21 dage. I denne periode blev disse cancerceller overvåges for dannelsen af ​​ES-lignende kolonier. Disse blev plukket til yderligere analyse med alkalisk phosphatase (AP) Levende Stain (500 ×) (Invitrogen) ved hjælp af en alt-i-én fluorescens mikroskop (BZ-9000, Keyence, Osaka, Japan) med digital fotografisk kapacitet til udvælgelse i henhold til den producentens anvisninger. At studere Mirs transfektionseffektivitet blev DLD-1 celler transficeret med BLOCK-iT Alexa Fluorescent Kontrol (Invitrogen) med CA eller LP. Kort fortalt, blev podet DLD-1-celler i en plade med 6 brønde transficeret med BLOCK-iT Alexa Fluorescerende Kontrol og fotograferet efter transfektion under anvendelse af en Keyence BZ-8000 mikroskop. Fluorescensintensiteten af ​​transficerede celler som observeret ved anvendelse af en FACS BD FACSAria III cellesorterer.

Luciferase assay

Den 3 ‘utranslaterede region (3′-UTR) af CDK2 blev amplificeret ved RT-PCR anvendelse af primerne 5’-CTAGCTAGCTAGCCTTCTTGAAGCCCCCA-3 ‘og 5′-CTAGCTAGCGAGCTACAAACTAAATTACA-3’. Primere blev subklonet, ligeret ind i pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspressionsvektor (Promega) under anvendelse af Nhel, og bekræftet ved direkte sekventering. Luciferaseassays blev udført under anvendelse 5 × 10

3 DLD-1 celler udpladet i en 96-brønds plade. Celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 3000 (Invitrogen) i OptiMEM reducerede serum medie (Gibco) med 200 ng af tom vektor eller Luciferase-CDK2 3’UTR vektor og enten NC miR eller MIR-302S (slutkoncentration, 25 nmol /L). Luciferaseaktivitet blev målt 24 timer efter transfektion under anvendelse af Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) ifølge fabrikantens protokol. Relative luciferase blev beregnet som (prøve Luc /Sample Renilla) /(kontrol Luc /Kontrol Renilla), hvor Luc er rå ildflueluciferaseaktivitet, og Renilla er den interne transfektionskontrol luciferaseaktivitet.

Celleproliferationsassay

for at vurdere spredning og følsomheden af ​​AP-positive ES-lignende kolonidannende kræftceller til 5-fluorouracil (5-FU, Kyowa Hakko Kirin Co., Tokyo, Japan), 1 × 10

3 celler udsat for adskillige koncentrationer af 5-FU i 72 timer i en 96-brønds plade. Levedygtige celler blev vurderet ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan). For at vurdere indflydelsen af ​​disse angivne Mirs på celleproliferation, HT29-celler og DLD-1-celler (5 x 10

4 celler /brønd i en plade med 12 brønde) blev transficeret med enten MIR-302S, MIR-302S plus miR -369s eller NC miR som beskrevet ovenfor. Celler blev talt hver dag i tre dage, begyndende 24 timer efter transfektion.

Cellecyklusanalyse

I cellecyklusanalyse ved flowcytometri, 5 × 10

4 DLD-1 celler blev transficeret med hver miR i en plade med 24 brønde, trypsinbehandlet efter 72 timer, vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og fikseret i 70% ethanol på is. Efter centrifugering blev celler farvet med 50 mg /ml propidiumiodid (PI) opløsning (Dojindo Molecular Technologies) og 0,1 mg /ml RNase A (Invitrogen) og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af en FACS BD FACSAria III cellesorteringsapparat. Hvert histogram blev konstrueret med data fra mindst 10.000 begivenheder og blev anvendt til at beregne den procentdel af cellepopulationen i hver fase. Salg

Cell invasion assay

Transwell invasion assays blev udført i 24- velmodificeret kamre pre-coatet med Matrigel (BD BioCoat, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). DLD-1-celler og SW480-celler blev transficeret med enten 10 nM MIR-302S, MIR-369s, MIR-302S plus MIR-369s og NC miR hjælp CA. Efter 48 timer blev cellerne trypsiniseret og resuspenderet ved en koncentration på 10 × 10

4 celler /ml i serum-frit medium, og 0,5 ml cellesuspension sattes til toppen af ​​hver brønd. Efter 48 timers inkubation celler migrerer ind i det nedre kammer, der indeholder 10% FBS som kemo-tiltrækningsstof, blev fikseret og farvet med Wright-Giemsa farve (Diff-Quick, Sysmex, Kobe, Japan). Fire tilfældige felter blev talt tre gange. Data udtrykkes som medianværdien med standardfejlen af ​​middelværdien (SEM) af invaderede celler i et relativt forhold i forhold til NC miR-behandlede cancerceller.

Cell differentiering undersøgelse

For at bestemme differentieringen evne de genererede ES-lignende kolonidannende cancerceller

in vitro

, celler blev dyrket i flydende dyrkning til dannelse embryoide legemer (EBS). Efter 4-5 dage blev EB’er overført til 0,1% gelatine-overtrukne plader og dyrket i RPMI-1640 med 10% FBS i yderligere 14 dage.

RNA-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Tokyo, Japan). RNA kvalitet blev vurderet med en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) ved 260 og 280 nm (A260 /280). Revers transkription (RT) for miR blev udført

in vitro

med Taqman revers transkription microRNA Kit (Applied Biosystems, Tokyo, Japan). qPCR blev udført med den universelle Taqman PCR Master Mix (Applied Biosystems).

RT-PCR

RNU48 udtryk in vitro og RNU6B udtryk in vivo blev anvendt som en intern kontrol for at bestemme den relative ekspression af miR. RT for miR blev udført

in vitro

med miScript II RT Kit (Qiagen, Tokyo, Japan). qPCR blev udført ved anvendelse af miScript SYBR Green PCR-kittet (Qiagen). RNU6B udtryk blev anvendt som en intern kontrol. Fold-ændringer blev beregnet og normaliseret ved hjælp af CT-metoden. mRNA niveauer blev analyseret med Reverse Transcription System (Promega, Tokyo, Japan) og LightCycler FastStart Reaction Mix SYBR Green I i en LightCycler (Roche, Tokyo, Japan). Alle resultater blev normaliseret til en GAPDH kontrol. RNA-ekspression undersøgelser blev uafhængigt gentages mindst tre gange for at bekræfte reproducerbarhed.

Proteinanalyse

Protein blev bestemt ved immunblotting. Antistoffer mod Bak (1: 200, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), Bud (1: 200, Santa Cruz), Bcl-2 (1: 1000, CST, Tokyo, Japan), Bcl-xl (1: 1000, CST), Mcl-1 (1: 1000, CST), Caspase8 (1: 1000, CST), Caspase3 (1: 1000, CST), CyclinD1 (1: 200, Santa Cruz), CDK2 (1: 200, Santa Cruz ), CDK4 (1: 200, Santa Cruz), E-cadherin (1: 1000, CST), vimentin (1: 1000, CST), Zeb1 (1: 1000, CST), Phospho-Rb (Ser807 /811) ( 1: 1000, CST), og den interne kontrol ACTB (1:. 2000, Sigma Aldrich, Tokyo, Japan) blev anvendt

Immunoblotting

Cellepellets blev lyseret i is kølig radioimmunfældningsassays assay buffer med proteasehæmmer. Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af Bradford-assayet. Proteiner blev separeret på 4-10% Mini-PROTEAN Præfabrikerede Gels (BioRad, Tokyo, Japan). Efter natten over elektroforetisk overførsel på PVDF-membran blev membraner blokeret med Blokering En løsning (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan) i 1 time og inkuberet natten over ved 4 ° C med den angivne primære antistof. Endelig blev membraner inkuberet med sekundært anti-mus eller kanin-helt IgG koblet til peberrodsperoxidase (GE Healthcare Life Sciences, Tokyo, Japan) i 1 time ved stuetemperatur. Antistof binding til at målrette proteiner blev visualiseret ved chemiluminescens hjælp Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagenser (GE Healthcare Life Sciences).

Immuncytokemi

Celler blev vasket to gange med PBS og fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Celler blev derefter vasket to gange med PBS og gennemtrængt med 0,1% Triton X-100 i 15 minutter ved stuetemperatur. Uspecifik binding blev blokeret ved inkubering i ged eller hesteserum (Vectastain, Funakoshi, Tokyo, Japan) i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Primære antistoffer blev anvendt, var polyklonale kanin-anti-humant Oct3 /4 (1: 400, MBL, Nagoya, Japan), polyklonale kanin-anti-human Sox2 (1: 400, MBL), monoklonalt muse-anti-humant Nanog (1: 2000, CST ), monoklonalt muse-anti-humant Ki-67 antigen (1: 400, DAKO), og monoklonalt kanin-anti-humant E-cadherin (1: 200, CST). Den næste dag blev cellerne vasket to gange med PBS og behandlet med sekundært antistof i 30 minutter ved stuetemperatur. Sekundære antistoffer blev anvendt, var anti-kanin IgG (H + L), F (ab ‘) 2-fragment (Alexa Fluorr 488 konjugat, 1: 1000, CST) eller anti-mus IgG (H + L), F (ab’) 2 fragment (Alexa Fluorr 555 konjugat) (1: 1000, CST). Kerner blev farvet med forlænge Gold antifade reagens med DAPI (Invitrogen). Billeder blev taget med en Keyence BZ-8000 mikroskop.

DNA methylering analyse

miR302-transfekterede DLD-1 kolorektal cancer celler blev analyseret for DNA methylering. Kort beskrevet blev celler transficeret med MIR-302S eller mock kontrol. Methylerede proteiner blev immunopræcipiteret fra cellelysatet ved hjælp methylering-bindende protein. Prøver blev sekventeret (Takara, Kyoto, Japan) til opnåelse af hele genom-dækkende DNA methylering data. Data mellem de to prøver blev sammenlignet for at bestemme DNA methylering reaktion på MIR-302S transfektion.

histon methyleringsanalyse

Histon udvinding og måling af globale methylering niveauer af histon 3 lysin-4 (H3K4 ) blev udført ved hjælp af Global histon H3-K4 Methylering kit ifølge producentens protokoller (Abnova, Taipei, Taiwan).

mus undersøgelse

Dyreforsøg blev gennemført i nøje overensstemmelse med de principper og som er godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Osaka University (godkendelsesnummer, 24-122-011). Tumorigeniciteten assay blev udført under anvendelse af en

in vivo

xenograft model. Først 5 × 10

6 celler suspenderet i et totalt volumen på 200 pi DMEM /Matrigel (1: 1 (v /v) suspension) blev injiceret i flankerne af 7-8 uger gamle hunmus (BALB /cAJcl-nu /nu). Når tumorvolumener nåede 100 mm

3, som målt med passere og ved anvendelse af formlen V = (ab

2) /2, hvor a er længden og b er bredden, tumorer blev høstet og skåret i 3 -4 mm

3 sektioner til seriel transplantation. Sektionerne blev at bekræfte vasculaturization ved immunhistokemi under anvendelse af CD31, en vaskulær endothelial markør. Serielt transplanterede HT29 xenografter havde den mest rigelige vaskulatur blev jævnt fordelt over hele tumor, og havde den mindste mængde af central nekrose. Mirs /CA komplekser blev administreret under anvendelse af en 30G nål via halevenen. Tumorstørrelse og kropsvægt blev målt en gang hver 3. dag. Xenotransplantattumorer og mus blod blev indsamlet i løbet af offer og konserveret i 10% neutral-bufferet formalin til histologi og immunhistokemiske undersøgelser eller i RNAlater RNA Stabilization Reagent (Qiagen, Tokyo, Japan).

Carbonat apatit forberedelse

for at forberede en CA transfektion blanding

in vitro

, 2 ug af hver miR-302 (-a, -b, -c, -d), miR-369 (-3p, -5p) eller NC miR blev blandet med 4 pi 1 M CaCl

2 i 1 ml serumfrit bicarbonat (44 mM) -buffered DMEM medium (pH 7,5) inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter, og anvendes til transfektion [15- 17]. Denne metode blev primært brugt til

in vitro

eksperimenter. For

in vivo

eksperimenter, en uorganisk opløsning (0,9 mM NaH

2PO

4, 1.8 mM CaC

2, pH 7,5) erstattede DMEM-opløsning. For en mus, blev en blanding af 15 ug af hver miR anvendes til enkelt injektion. Opløsningen blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 3 minutter, og pelleten opløst i 200 pi saltvand indeholdende 0,5% albumin. Produkter i opløsningen blev sonikeret (38 kHz, 80 W) i et vandbad i 10 minutter under 20 ° C til frembringelse miR /CA-komplekser, som blev injiceret intravenøst ​​inden for 5 min.

Patientprøver

Kliniske prøver blev indsamlet under operationen fra ni patienter, der gennemgår kirurgisk resektion for tarmkræft på Osaka University Hospital og dets tilknyttede hospitaler i 2005. patienterne er sammenfattet i S2 tabel. Alle patienter var i overensstemmelse med brugen af ​​resektion eksemplarer i denne undersøgelse i henhold til retningslinjerne er godkendt af Institutional Research Board (godkendt protokol # 213).

immunhistokemisk analyse

blev udført på immunhistokemisk analyse 3,5 um paraffinindstøbte afsnit fra xenografter. Paraffinindstøbte sektioner blev de-paraffinized i Hemo-De (Farma) og rehydreret i en gradueret ethanol serie. Objektglas blev opvarmet i antigen-genvinding puffer i 40 minutter, blokeret med ged eller hesteserum i 20 minutter ved stuetemperatur og inkuberet med monoklonalt muse-anti-humant Ki67 antigen (1: 400, DAKO), polyklonale kanin-anti-humant Oct3 /4 (1: 100, MBL), polyklonale kanin-anti-human Sox2 (1: 200, MBL), eller monoklonalt muse-anti-humane CK20 (DAKO) antistoffer natten over ved 4 ° C. Den Vectastain ABC System (Vectastain, Funakoshi, Japan) blev anvendt til at visualisere antigen. Counter-farvning blev udført under anvendelse af hæmatoxylin.

Immunofluorescensanalyse

Immunofluorescens analyse blev udført på 3,5 um paraffinindlejrede sektioner fra xenotransplantater til påvisning tumorkar. Paraffinindstøbte sektioner blev de-paraffinized og behandles som beskrevet for immunhistokemi. Snit blev blokeret med gedeserum i 20 minutter ved stuetemperatur og inkuberet med rotte-anti-muse CD31-antistof (1:20, Dianova, Hamburg, Tyskland) natten over ved 4 ° C. Den næste dag, det sekundære antistof anti-rotte IgG (H + L), F (ab ‘) 2-fragment (Alexa Fluorr555 konjugat): blev (1 1000, CST) anvendt. Sektioner blev counter-farvet med forlænger Guld antifade Reagent med DAPI. Billeder blev taget med en Keyence BZ-8000 mikroskop.

Alcian blå farvning

Alcian blå farvning blev udført på 3,5 um paraffinindstøbte snit fra xenografter at opdage slim. Kort fortalt blev objektglassene de-pareffinized i Hemo-De (Farma), rehydreret i en gradueret ethanolserie, nedsænket i 3% eddikesyre i 3 minutter, og farvet i Alcian blå opløsning (1 g Alcian Blue 8GX, 3 ml eddikesyre syre, og 97 ml destilleret vand) i 20 min. Snit blev derefter vasket og kernerne modfarvet med Kernechtrot (TCI, Tokyo, Japan) i 5 minutter.

Apoptose assay

Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BioVision, Milpitas, CA) blev anvendt ifølge producentens protokol for

in vitro

tidlig og sen fase påvisning af apoptotiske celler. Kort fortalt, for at opdage apoptose

in vitro

, 20 × 10

4 DLD-1 celler blev transficeret med MIR-302S, MIR-369s, MIR-302S plus MIR-369s eller NC miR hjælp CA i en 6-brønds plade i tre eksemplarer 60 timer før analysen. Celler blev trypsinbehandlet og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af en FACS BD FACSAria III cellesorteringsapparat. Tre uafhængige forsøg blev udført i tre eksemplarer.

For at detektere DNA pauser i apoptotiske celler

in vitro

, vi brugte deadend Fluorometrisk TUNEL System (Promega) i overensstemmelse med producentens protokol. Kort fortalt blev celler transficeret med hvert miR hjælp CA hjælp af Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System (Fisher Scientific, Tokyo, Japan). Objektglas blev vasket 48 timer efter transfektion og fikseret i 4% formaldehyd i PBS i 25 minutter ved 4 ° C. Objektglas blev vasket to gange i PBS og permeabiliseret i 0,2% Triton X-100 i PBS i 5 min. Objektglas blev derefter vasket i PBS, ækvilibreret i ækvilibreringsbuffer i 7 min ved stuetemperatur, og mærket med TdT-reaktionsblandingen i 60 minutter ved 37 ° C i et fugtigt kammer for at undgå lyseksponering. Objektglas blev neddykket i 2X SSC i 15 minutter for at stoppe reaktionen. Kerner blev modfarvet hjælp med forlænge Guld antifade Reagent med DAPI. Apoptotiske celler blev detekteret ved en Keyence BZ-8000 mikroskop.

Til påvisning apoptotiske celler

in vivo

blev en TUNEL-assay udført i overensstemmelse med producentens protokol. Kort fortalt slides blev de-paraffinized i Hemo-De, rehydreret i en gradueret ethanol serie, nedsænket i 0,85% NaCl, og fikseret i 4% formaldehyd. Celler blev permeabiliseret med 20 ug /ml proteinase K-opløsning i 10 minutter ved stuetemperatur. Objektglas blev ækvilibreret med ækvilibreringsbuffer i 10 minutter ved stuetemperatur og mærket med anvendelse TdT-reaktionsblandingen i 60 minutter ved 37 ° C i et fugtigt kammer. Objektglas blev neddykket i 2X SSC i 15 minutter for at stoppe reaktionen. Kerner blev modfarvet ved anvendelse forlænge Gold antifade Reagens med DAPI. Apoptotiske celler blev opdaget af en Keyence BZ-8000 mikroskop.

Resultater

Endogen udtryk for MIR-302S og MIR-369s i primære tumorer og kræft cellelinier af kolon

tidligere undersøgelser indikerede, at MIR-302a, -b, -c, og-d (MIR-302S), miR369-3p, -5p (MIR-369s) og MIR-200c kunne fremkalde cellulær omprogrammering i normale somatiske celler [13]. Her vi palneed at omprogrammere kræftceller ved hjælp af disse Mirs. Vi startede med at undersøge den endogene ekspression af disse Mirs i kolorektale cancercellelinjer og kliniske prøver af coloncancer (Fig 1A og 1B). Ekspression af MIR-302S i coloncancer var meget lav eller udetekterbar sammenlignet i humane teratoma NTERA-celler, som efter sigende udtrykker ESC-specifikke gener og anvendes som kontrolceller at evaluere ESC-lignende genekspression i mange undersøgelser [2, 3, 5, 11]. I modsætning hertil MIR-200C-ekspression var høj i ni primære tumorer undersøgt og mange cellelinjer, såsom HT29. Ekspressionsniveauer af MIR-302S og MIR-369s blev lavere sammenlignet med den af ​​MIR-200C, hvilket antyder, at MIR-200C-ekspression er allerede høj i mange colon cancerceller og kan være resistente over for eksogen overekspression. Dernæst vi transficeret kun MIR-302S eller MIR-369s i kolon kræftceller. For at optimere

in vivo

forsøg, der efterligner primære tumorer, studerede vi immunfluorescensfarvning mønstre af CD31, en vaskulær endotel markering, ved hjælp af DAPI at modfarve kerner, i xenotransplantater af HT29, DLD-1 og SW480-celler (Fig 1C). HT29 xenotransplantater havde den mest rigelige vaskularisering, blev jævnt fordelt over hele tumoren, og den mindste mængde af nekrose. Yderligere cancer omprogrammering analyse af MIR-302S og MIR-369s blev hovedsageligt udføres med HT29-celler og andre supplerende cellelinjer.

A) Relativ udtryk for endogene MIR-302S (miR-302a, -b, -c, og-d), MIR-369s (MIR-369-3p og -5p), og MIR-200C i primære tumorer og tyktarmskræft cellelinjer. Den humane teratocarcinom cellelinie NTERA blev anvendt som kontrol. B) Mirs Ekspression i HT29, DLD-1 og SW480-celler (n = 3). C) Immunofluorescensanalyse af CD31-ekspression i xenotransplantater fra HT29, DLD-1 og SW480 celler. HT29 xenotransplantater udviste mange CD31-positive områder med lille nekrose. Scale barer, 200 um. D) Relativ ekspression af MIR-302S og MIR-369s i HT29-celler 24 timer efter transfektion af 30 nM MIR-302S plus MIR-369s (n = 3). NC, negativ kontrol. E) Relativ udtryk for MIR-302S i HT29-celler på dag 2 og 6 efter transfektion af MIR-302S (n = 3). NC, negativ kontrol. F) at evaluere transfektionseffektiviteten blev et fluorescensmærket dsRNA oligomer transficeret med carbonat apatit (CA) eller lipofektion (LP) i DLD-1-celler. Transfektionseffektiviteten blev bedømt ved fluorescensmikroskopi og flowcytometri efter en enkelt transfektion som angivet. G) Relativ udtryk for MIR-302S i HT29-celler 48 timer efter transfektion ved CA eller LP (n = 3).

Eksogen indførelsen af ​​MIR-302S og MIR-369s fremkalder cellulære omprogrammering

Vi transficerede MIR-302S plus MIR-369s i colon cancer cellelinjer under anvendelse CA at opnå mir ekspressionsniveauer svarende til NTERA celler, som blev brugt som en positiv kontrol (fig 1D) [13]. Vi bekræftede, at MIR-302S effektivt blev transficeret (Fig 1E). Transfektion effektivitet ved hjælp af CA var højere end for LP under vores betingelser (Fig 1F og 1G). Derfor blev CA metode, der anvendes i alle efterfølgende forsøg.

For at afgøre, om kræftcellerne kan omprogrammeres ved hjælp Mirs undersøgte vi effekten af ​​indførelsen af ​​eksogene MIR-302S med og uden MIR-369s tre gange i løbet af transfektion periode. På dag 6 blev cellerne forsigtigt trypsiniseret, overført til MEF fødeceller, og dyrket i yderligere 21 dage i ES-medium med tre kemiske inhibitorer (3i; 0,5 uM A83-01, en ALK4 /5/7 receptor-inhibitor; 3 uM CHIR99021 , et GSK-3β-inhibitor; og 0,5 uM PD0325901, en MEK-inhibitor) (fig 2A) [5,13,18]. Runde kolonier blev induceret ved transfektion af HT29 med MIR-302S. Disse kolonier lignede dem sådanne organer /iPSCs og tilsyneladende forskellige fra dem af forældrene celler (Fig 2B). Økonomiske og sociale råd /iPSCs vides at være alkalisk phosphatase-positive, så vi farvede cellerne under anvendelse af AP levende farvning (Fig 2C) at identificere og udvælge kolonier, der bestod af virkelig omprogrammerede celler [19]. Blandt de celler, der danner ES-lignende kolonier, AP

+ men ikke AP

– celler viste en stigning ekspressionsniveauerne af OCT3 /4, SOX2 og NANOG (Fig 2D) og MIR-302S (Fig 2e). Celler transficeret med MIR-302S plus MIR-369s eller MIR-302S alene var AP

+ i kultur efter 28 dages omprogrammering. Disse omprogrammerede celler udtrykte pluripotente markørproteiner såsom Oct3 /4, Sox2, Nanog, og TRA-1-60 (Fig 2F).

A) Ordning for kræft omprogrammering metoder transfektion af MIR-302S eller miR- 302S plus MIR-369s. B) MIR-302S-inducerede morfologiske ændringer i HT29-celler på dag 1, 6 og 28. omprogrammeret HT29 har en embryonisk stamceller-lignende udseende. Målestokke 100 uM. C) Celler farvet ved anvendelse af alkalisk phosphatase (AP) levende plet. Målestokke 100 uM. D) Relativ udtryk for

OCT3 /4

,

SOX2

NANOG

forhold til AP

– celler ved QRT-PCR (n = 3). E) Relativ udtryk for MIR-302S og MIR-369s i AP

+, AP

– og NTERA celler. Actin blev anvendt som en loading kontrol. Actin blev anvendt som en loading kontrol. Actin blev anvendt som en loading kontrol. 0,05. (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). Der blev udført tre uafhængige forsøg. Actin blev anvendt som en loading kontrol.