PLoS ONE: proteomiske Analyse af blærekræft Angiver Prx-I som Key Molecule i BI-TK /GCV Behandling System

Abstrakt

For at forstå de molekylære mekanismer i Bifidobacterium infantis thymidinkinase /nukleosidanalog ganciclovir (BI-TK /GCV) behandling, som viste sig at udvise bæredygtig anti-tumorvækst aktivitet og inducere apoptose i blærecancer, en proteomik tilgang isobare tags for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ), efterfulgt af væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS /MS) blev anvendt. 192 nedreguleres og 210 opreguleret proteiner blev identificeret efter behandling med BI-TK /GCV-system i Sprague-Dawley (SD) rotter. Western blot-analyse og immunhistokemisk analyse bekræftede, at Peroxiredoxin-I (Prx-I) var signifikant nedreguleret i blærekræft efter behandling. PRX-I silencing ved transfektion af PRX-I shRNA undertrykte signifikant vækst, fremmes apoptose og reguleret cellecyklussen i T24-celler og reducerede phospho-NF-KB p50 og p65-proteinekspression som viste forbindelserne mellem PRX-I og NF-KB pathway underforstået af Opfindsomhed pathway analyse (IPA). Disse resultater giver ny indsigt i behandling af blærekræft, afslører Prx-I som et nyt terapeutisk mål og angiver BI-TK /GCV systemet som en potentiel behandling af nedregulering af Prx-I gennem NF-KB signalvejen.

Henvisning: Jiang L, Xiao X, Ren J, Tang Y, Weng H, Yang Q, et al. (2014) proteomiske Analyse af blærekræft Angiver Prx-I som Key Molecule i BI-TK /GCV Treatment System. PLoS ONE 9 (6): e98764. doi: 10,1371 /journal.pone.0098764

Redaktør: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences Center, USA

Modtaget: December 30, 2013; Accepteret: 6 maj 2014; Udgivet: 6 juni 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af forskningen bevilling fra Natural Scientific Foundation of China (nr 81.072.087 /H1619). URL for National Natural Science Foundation of China: https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal0/default.htm. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den mest almindelige urologisk cancer i. Asien og dens kliniske ledelse er ekstremt dyrt [1]. I 2014 forventes omkring 74.690 nye tilfælde af blærekræft, der skal diagnosticeres, og omkring 15.580 af dem vil dø [2]. Blærekræft kan opdeles i to store kliniske og patologiske undertyper: overfladisk ikke-muskel-invasiv type og avanceret muskel-invasiv type, [3]. Generelt er overfladisk blærekræft behandlet med endoskopisk resektion med gunstig prognose, men det undertiden opstår igen med grad progression [4]. Forvaltningen af ​​fremskreden blærekræft er en stor udfordring, og disse patienter har en mindre gunstig prognose med en meget lav 5-års overlevelsesraten; Derfor er det nødvendigt mere aggressive terapeutiske muligheder, såsom radikal cystektomi og urinafledning [5]. Endvidere blærekræft især den avancerede type opstår igen i et betydeligt antal patienter, og selv er dødelig, og derfor helst bør udvikles mindre aggressive metoder til bekæmpelse af sygdommen.

Herpes simplex virus thymidinkinase (HSV -TK) -medieret selvmord genterapi som en bredt accepteret strategi for blærekræft kan konvertere ikke-toksiske nukleosidanalog ganciclovir (GCV) til en toksisk triphosphoryleret formular, som efterfølgende forårsager dødsfald hurtigt delende celler [6]. Vi har tidligere tyet til

Bifidobacterium infantis

(BI), som er et tumor-targeting bakterie, fordi den selektivt lokaliseres og prolifererer inden den hypoxiske regioner af tumorer som en ikke-patogen og anaerob bakterie [7], [8] . Vi fandt, at BI og TK /GCV (BI-TK /GCV) systemet udviste en bæredygtig anti-tumorvækst aktivitet i gnaver blærekræft model in vivo, som involverede både ydre og indre apoptoseveje [9].

i et forsøg på at forstå de underliggende molekylære mekanismer og identificere potentielt mål proteinmolekylet af denne sikker og effektiv behandling systemet, vi tyet til massespektrometri (MS) -baserede isobare tags for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) for at opnå omfattende differential proteinprofiler. Desuden undersøgte vi den molekylære vej af Peroxiredoxin-I (Prx-I), en af ​​de identificerede nedreguleret proteiner i blærekræft identificeret ved iTRAQ efter behandling med BI-TK /GCV.

Materialer og metoder

Materialer

BI-TK /GCV behandling systemet blev konstrueret med succes af vores forskningsgruppe (Chongqing, Kina) [9].

Forsøgsdyr

halvfjerds Sprague-Dawley rotter (6-8 uger gamle, vejer 180-200 g) blev købt fra Chongqing National Biological Industry Base of Experimental Animal center (Kina) og opstaldet under SPF-tilstand ved 23-27 ° C og fugtighed 55-65% med 12 timers lys-mørke cyklus. Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal brug og Omsorgsudvalget Chongqing Medical University. En rotte blære tumormodel blev bygget af perfusion af N-methyl-nitrosourea (MNU) (Sigma, USA). MNU blev fortyndet i 20 g /l af en citronsyreopløsning pufferopløsning. Hver blære blev perfuseret med 0,1 ml gang hver 2. uge, i alt fire perfusioner.

Studies in vivo

Sixty tumorbærende Sprague-Dawley-rotter blev tilfældigt inddelt i fire grupper (hver

n

= 15): en normal saltvandsopløsning gruppe, en BI gruppe, en BI /pGEX-1 gruppe, og en BI-TK-gruppe. Efter Bifidobacterium blev koncentreret, blev ca. 0,5 ml de tilsvarende interventioner injiceret via halevenen (bakterie Stillingen 4,4 × 10

9) en gang om ugen i 4 uger. Alle grupper modtog daglige intraperitoneal injektion af GCV (50 mg /kg) i 28 dage. Alle rotterne blev aflivet under bedøvelse med natriumpentobarbital. En del af blærekræft væv fra de fire grupper blev bevaret i paraffin til immunhistokemisk (IHC) analyse, og resten af ​​vævene blev holdt ved -80 ° C til yderligere analyse.

forberedelse proteinprøve og iTRAQ mærkning

vævene blev lyseret i en lysisbuffer (7 m urinstof, 1 mg /ml DNasel, 1 MMNA

3VO

4, og 1 mm phenylmethan sulfonylfl uoride, PMSF) og centrifugeret ved 6000 g og 4 ° C i 30 minutter. Supernatanten blev opsamlet, og samlede proteinindhold blev målt ved anvendelse 2D Kvantificering Kit (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige). Hver prøve blev fordøjet med 20 pi 0,1 pg /pl trypsin-opløsning (Promega, Madison, USA) ved 37 ° C natten over og derefter mærket med iTRAQ tags som følger: (i) normalt saltvand gruppe, 114 tags; (Ii) BI-TK-gruppe, 115 tags; (Iii) BI /pGEX-1 gruppe, 116 tags; (Iv) BI gruppe, 117 tags. De mærkede prøver blev samlet forud for yderligere analyse.

Stærk kationbytter (SCX) kromatografi

For at reducere prøve kompleksitet for væskekromatografi (LC) -MS /MS-analyse, de puljede prøver fortyndet 10 gange med en SCX puffer A (10 mm KH

2PO

4 i 25% acetonitril ved pH 3,0) og anvendt til en 2,1 x 200 mm polysulfoethyl A SCX-søjle (PolyLC, Columbia, USA). Søjlen blev elueret med en gradient af 0-25% SCX puffer B (10 mM KH

2PO

4 ved pH 3,0 i 25% acetonitril indeholdende 350 mM KCI) i løbet af 30 minutter efterfulgt af en gradient af 25- 100% SCX buffer B over 40 min. Disse SCX fraktioner blev frysetørret i et vakuum koncentrator og underkastet C-18 oprydning hjælp ekstraktionskolonne (100 mg kapacitet, Supelco; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA).

elektrosprayionkilde-kvadrupol tid -of-flyvning MS (ESI-Q-TOF-MS) Analyse

MS blev udført ved hjælp af en nano-LC koblet online til en QStar Elite massespektrometer (Applied Biosystems). LC eluenten blev rettet mod en ESI kilde til Q-TOF-MS-analyse. Et massespektrometer blev sat til at udføre information afhængige konvertering (IDA) i den positive ion-mode, med et udvalgt masse række 300-2,000 m /z. Peptider med +2 til +4 opladningstilstand blev udvalgt til tandem-massespektrometri, og tidspunktet for summation af MS /MS-begivenheder blev sat til 3 s. Relativ kvantificering af proteiner, i tilfælde af iTRAQ, blev udført på de MS /MS scanninger og var forholdet mellem arealerne under toppe ved 113, 114, 115 og 116 Da, der var massen af ​​de mærker, der svarer til iTRAQ reagenser.

proteomiske analyse

de bioinformatiske processer og molekylære funktion af de identificerede proteiner i BI-TK gruppe efter behandling blev klassificeret af PANTHER klassifikationssystem (www.pantherdb.org). De veje for differentielt udtrykte proteiner identificeret af iTRAQ blev analyseret af Ingenuity pathway analyse (IPA) program (https://www.ingenuity.com). På software Opfindsomhed blev dataene anvendes til at udvinde interaktive netværk blandt proteinerne i indekset (IPI) database International Protein. Et netværk med en højere end 2 score normalt betragtes som gyldig.

Validering af Western blot og IHC

Western blotting og IHC blev brugt til at bekræfte ekspressionen af ​​Prx-I. T Proteinprøverne (ca. 20 mg) blev adskilt under anvendelse af SDS-PAGE. Efter SDS-PAGE-elektroforese blev proteiner overført til PVDF-membraner. Efterfølgende blev lysater inkuberet med et primært anti-Prx-I kanin-monoklonalt antistof (1:1500) (Abcam, USA). De immunreaktive signaler blev detekteret ved forøget kemiluminescens (Amersham Biosciences, Sverige). Procedurerne blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. Blære kræft væv fra fire grupper blev inkuberet natten over med primære antistoffer. Vævene blev inkuberet med sekundære antistoffer i 2 timer. Cellekernerne blev modfarvet med hematoxylin. Andelen af ​​positivt farvede tumorceller blev bestemt af Image-Pro Plus (IPP) 6,0 og blev gradueret som følger: 0, negativ; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 50%. Den immunfarvning intensitet blev scoret som følger: 0, fraværende; 1, lysegul; 2, gullig brun; 3, brun. Proteinet i blære kræft væv blev evalueret ved hjælp af farvning (SI):.

SI

= andelen × intensiteten af ​​positive tumorceller

Prx-1 knockdown af shRNA

T24-celler blev underkastet PRX1 knockdown. Kort hårnål RNA (shRNA) blev exprssed med GV102-system (GeneChem, Kina). De tre par sense- og antisense-sekvenser af oligonukleotider målrettet mod humant PRX1 (GeneBank_ID: NM_002574) var som følger: PRDX1-RNAi (sh-1) sense-strengen 5′-GATCCCGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCTTTTTGGAT-3 ‘, PRDX1-RNAi (sh-1) antisense-streng 5’-AGCTATCCAAAAAGCTTTCAGTGATAGGGCAGAACTCGAGTTCTGCCCTATCACTGAAAGCGG-3 ‘; PRDX1-RNAi (sh-2) sense-strengen 5’-GATCCCGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCTTTTTGGAT-3 ‘, PRDX1-RNAi (sh-2) antisense-streng 5′-AGCTATCCAAAAAGATGAGACTTTGAGACTAGTTCTCGAGAACTAGTCTCAAAGTCTCATCGG-3′; PRDX1-RNAi (sh-3) sense-strengen 5’-GATCCCCCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGTTTTTGGAT-3 ‘, PRDX1-RNAi (sh-3) antisense-streng 5′-AGCTATCCAAAAACCATGAACATTCCTTTGGTATCTCGAGATACCAAAGGAATGTTCATGGGG-3’.A scramblet sekvens af Prx-I mål blev anvendt som en negativ kontrol (con sh). T24-celler blev transient transficeret med PRX1-shRNA ekspressionsvektorer ved anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, USA). Ikke-inficerede T24 celler (forældrekontrol) og Prx-jeg styre shRNA inficerede T24 celler (con sh) blev også anvendt. Den højeste effektivitet af knockdown af shRNA vektorer i T24-celler blev bestemt ved kvantitativ realtids-polymerasekædereaktion (QRT-PCR). Primersekvenserne for Prx-I var 5′-AGCCTGTCTGACTACAAAG-3 ‘(fremad) og 5′-TCTGCCCTATCACTGAAAG-3′ (revers), hvilket gav et 104 bp produkt. De primer sekvenser for den interne kontrol GAPDH var 5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ‘(fremad) og 5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’ (tilbage), hvilket gav et 110 bp produkt. Ekspressionen værdi Prx-I sammenlignet med den for GAPDH blev beregnet som 2-ΔΔCt. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer. Derefter udtrykkene for Prx-I i T24-celler slået af shRNAs blev målt ved Western blotting.

Celleproliferationsassay

Efter transfektion med Prx-I shRNA i 24 timer, de T24-celler podet i 96-brønds dyrkningsplader ved en tæthed på 4 x 10

3-celler i et endeligt volumen på 100 pl /brønd, og utransficerede celler blev anvendt som kontrol. Celleproliferationen blev beregnet ved forskellige tidspunkter (24, 48 og 72 h) ved hjælp Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Sigma, USA). Eksperimenter blev udført i overensstemmelse med producentens protokol. Absorbansen ved 450/630 nm blev målt med en Thermo spektrofotometer (Waltham, USA). Den gennemsnitlige absorbans fra seks brønde pr gruppe blev beregnet.

Flowcytometrisk analyse

Efter transfektion i 48 timer blev cellerne trypsiniseret og centrifugeret ved 1500 rpm i 5 min. Cellerne blev høstet og vasket med PBS to gange. Efter farvet med 50 pg /ml Annexin V-fluoresceinisothiocyanat (FITC) (BD Biosciences, USA) og 20 pi 500 pg /ml propidiumiodid (PI) (Sigma, USA) i apoptose detektion blev cellerne inkuberet i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter og udsat for flowcytometrianalyse (FACS). Derefter blev cellerne opsamlet, vasket med PBS, fikseret med 75% ethanol ved -20 ° C natten over. De fikserede celler blev vasket med kold PBS to gange, tilsættes 500 pi DNA farveopløsning (herunder 200 ug /ml RNase A og 20 pg /mL propidiumiodidfarvning opløsning) og inkuberet i 30 minutter. Endelig blev cellerne underkastet cellecyklusanalyse ved FACS. Data blev analyseret og evalueret på programmet ModFit (Topsham, USA).

Effekt af Prx-I på phospho-NF-KB-P50 og p65

Forbindelsen mellem Prx-I og NF-kappa-B (NF-KB) kompleks signalering var blevet antydet i proteinet pathway af IPA. Derfor, for at undersøge, om virkningen af ​​Prx-I på apoptotiske signalproteiner henføres til NF-KB-inhibering, evaluerede vi nukleare niveauer af phospho-NF-KB p50 og p65 (Abcam, USA) ved Western blot.

Statistisk analyse

dataene blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) og sammenlignet ved hjælp af variansanalyse. Niveauet af signifikant forskel blev defineret som p 0,05. Alle analyser blev udført på SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, USA) til Windows.

Resultater

Kvantificering og identifikation af differentielt udtrykte proteiner ved iTRAQ

I alt 2343 unikke proteiner blev identificeret med 95% sikkerhed ved ProteinPilot søgealgoritme mod IPI rotte protein database v3.49. En streng cutoff værdien af ​​en 1,3-gange ændring ført til en endelig sæt af 402 differentielt udtrykte proteiner, herunder 192 ned-regulerede proteiner og 210 up-regulerede proteiner i BI-TK gruppe efter behandling. Påfaldende, en roman molekyle Prx- Jeg tegnede vores særlig opmærksomhed, med en 0,52-fold fald i BI-TK gruppe versus normalt saltvand gruppen. Et skematisk diagram af iTRAQ er vist i figur 1A, og MS /MS spektrum af Prx- I (peptidsekvens: VVGDHVEVHAR) er vist i figur 1B. De iTRAQ tags er som følger: (i) normalt saltvand gruppe, 114 tags; (Ii) BI-TK-gruppe, 115 tags; (Iii) BI /pGEX-1 gruppe, 116 tags; (Iv) BI-gruppen, 117 tags. Proteinet id i IPI, navn og hovedfunktioner med overflod ændringer indbegrebet i tabel S1

A:. Skematisk diagram, der viser arbejdsgangen for iTRAQ. B: MS /MS-spektrum viser peptiderne i Prx-I (peptidsekvens: VVGGDHVEVHAR). De 4 peak konturer beskriver, at de prøvevolumener er de samme som garanterer resultaterne er autentiske og pålidelige.

Bioinformatik funktionel analyse af differentielt udtrykte proteiner efter behandling med BI-TK /GCV

for at undersøge i deres biologiske roller i helbredende virkning af BI-TK /GCV om blærekræft blev de differentielt udtrykte proteiner kategoriseret i forskellige processer og funktion klasser baseret på systemet PANTHER klassificering. I biologisk proces analyse, den største andel af differentielt udtrykte proteiner var i metaboliske proces, efterfulgt af cellulær proces og celle proces kommunikation (figur 2A). Især de proteiner, der er involveret i katalytisk aktivitet, binding, strukturel molekyle aktivitet, enzym regulator aktivitet, og receptoraktivitet var de fem molekylære funktionskategorier (figur 2B). Endvidere proteiner involveret i antioxidant aktivitet udgjorde 1,3% hhv. Figur 2C viser de primære veje genereret af IPA af differentielt udtrykte proteiner. Dette netværk scorede 36 og bestod af 37 proteiner involveret i apoptose, oxidativ stress, og metabolisme. Især er Prx-I, den markant down-udtrykte protein efter behandling, er direkte forbundet med transkriptionsfaktor NF-kappa-B (NF-KB) kompleks pathway i dette netværk, hvilket indikerer, at Prx-I kan spille en vigtig rolle i apoptose af blærekræft af BI-TK /GCV-system dels gennem NF-KB-signalering pathway.

PANTHER klassificering af proteiner baseret på (A) Biologisk proces og (B) molekylære funktion. (C) i samspil netværk af proteiner med overflod forandringer, som den Ingenuity pathway analyse (IPA). Netværket indebar tilslutning af Prx-I og NF-KB-komplekset.

Validering af Prx-I ved Western blot og IHC

forskellen ekspressionsniveauer af Prx- I identificeret ved iTRAQ fremgangsmåde blev valideret ved Western blot (figur 3A). Sammenlignet med normal saltopløsning gruppe, ekspression af Prx-I er nedreguleret i de tre andre grupper (især i BI-TK-gruppe), hvilket svarer til de resultater, der opnås ved iTRAQ. Desuden blev Prx-I-ekspression i tumorvæv verificeret ved IHC-analyse (figur 3B). PRX-I-indhold i blæren cancerceller af BI-TK-gruppen var signifikant lavere end i de andre grupper (p 0,05, figur 3B)., Hvilket er i overensstemmelse med resultaterne opnået ved iTRAQ og Western blot

A: udtryk af Prx-i i fire grupper ved Western blot analyse. Beta-actin blev anvendt som en loading kontrol. B: Repræsentative billeder viser immunoexpression af Prx-I i tumorvæv på fire grupper. Sammenlignet med normal saltopløsning gruppe, ekspression af Prx-I er nedreguleret i de tre andre grupper (især i BI-TK-gruppe), hvilket svarer til de resultater, der opnås ved iTRAQ. (Asterisk (*) indikerer P 0,05 i BI-TK versus normalt saltvand gruppe)

qPCR og Western blot for den interfererende effektiviteten i T24 celler

For det første Prx- i mRNA niveauer fra fire shRNA vektorer transficeret i 48 timer i T24 cellelinier blev målt ved qPCR anvendelse af lipofectamin 2000. Prx-i-ekspression faldt med ca. 40%, 26%, 18% og 1% i sh-1, sh -2, SH-3 og con SH-grupper, sammenlignet med den parentale gruppe (figur 4A). For at bekræfte dette interfererende effektivitet blev protein ekspressionsniveauer af Prx-I i T24-celler efter transfektion undersøgt ved Western blot. Resultaterne viste, at Prx-I-niveauer faldt signifikant med ~48%, 30%, 18% og 3% fra baseline i sh-1, sh-2, SH-3 og con SH-grupper henholdsvis (figur 4B), hvilket indikerer, at højest forstyrrende effektivitet i T24 celler var i sh-1 gruppe

A:. udtrykket af Prx-i mRNA blev undersøgt ved qPCR. GAPDH tjente som en intern kontrol. B: PRX-I-proteinniveauer blev analyseret ved Western blot efter transfektion. Sh-1 behandling førte til en betydelig reduktion i Prx-I protein-ekspression i T-24 celler. (Asterisk (*) indikerer P 0,05 i sh-1 versus forældrenes gruppe)

Prx-I knockdown hæmmede T-24 cellevækst

Virkningerne af Prx-I shRNA transfektion på T24 cellevækst blev undersøgt gennem CCK8 assays. En let hæmning i vækst blev observeret ved 24 timer efter transfektion. Endvidere blev indlysende inhibitoriske virkninger på celleproliferation observeret i Prx-I knockdown-celler ved 48 og 72 timer, sammenlignet med de parentale og con SH-grupper (figur 5, p 0,05), hvilket antyder, at inhibering af Prx-I kunne undertrykke T24 cellevækst in vitro.

de vækstrater i Prx-i knockdown gruppen blev reduceret betydeligt, sammenlignet med de forældre og con SH-grupper, målt ved CCK8 assay.

Effekt af PRX-i shRNA transfektion på apoptose og cellecyklus af T-24 celle

virkningerne af PRX-i knockdown på apoptose og cellecyklus af T24 celle blev undersøgt. Efter 48 timers transfektion, den apoptose sats i sh-1 gruppe (21,99 ± 1,10%) var signifikant højere sammenlignet med den con shRNA gruppen (4,51 ± 0,73%) og forældrenes gruppe (4,96 ± 0,46%) (P 0,05) (Figur 6A). Cell cyklus analyse viste, at G0 /G1-fasen forholdet i sh-1 gruppe (61,13 ± 0,50%) var signifikant højere sammenlignet med den con sh gruppen (49,62 ± 0,84%) og forældrenes gruppe (48,03 ± 1,17%) (P 0,05) (Figur 6B)

A:. Prx-i knockdown induceret apoptose i T24 celler. B:. Repræsentative billeder af FACS-analyse viser Prx-I knockdown induceret G0 /G1 cellecyklusstandsning i T24-celler med et tilsvarende fald i S-fase celler (P 0,05)

Virkning af Prx- i på NF-KB-vejen

som beskrevet ovenfor, Prx-i er direkte forbundet med NF-KB-kompleks, som er blevet impliceret i proteinet pathway (figur 2C). For at undersøge, om virkningerne af Prx-I på apoptotiske signalproteiner henføres til NF-KB-inhibering, blev de aktiverede former af phospho-NF-KB-P50 og p65 undersøgt ved Western blot efter transfektion med Prx-I shRNA i T24 celler. Et signifikant fald (P 0 · 05) i proteinet ekspression af både phospho-NF-KB p50 og p65 blev observeret i sh-1 gruppe (figur 7), sammenlignet med de con sh og forældregrupper, hvilket indikerer, at Prx-I knockdown inhiberede aktivering af NF-KB P50 og p65 i T24-celler.

Et signifikant fald i proteinet ekspression af både phospho-NF-KB p50 og p65 i sh-1 gruppe. (Asterisk (*) indikerer P 0,05 i sh-1 versus forældrenes gruppe)

Diskussion

I vores tidligere undersøgelse, BI-TK /GCV blev konstrueret og vist sig effektive i inhibering gradvis vækst i blæren tumor, som var relateret til apoptose in vivo [9], [10], hvilket indikerer, at BI-TK /GCV var en vellykket behandling, og kan tilvejebringe en hidtil ukendt strategi til behandling af fremskreden eller metastatisk blærecancer i fremtiden .

i denne undersøgelse blev en proteomik tilgang iTRAQ anvendes til at identificere differentielt udtrykte proteiner med henblik på at afsløre de molekylære mekanismer og giver teoretisk støtte for effektiviteten af ​​BI-TK /GCV-system. iTRAQ identificeret 402 differentielt udtrykte proteiner i blærekræft væv efter behandling, herunder 192 nedreguleret proteiner og 210 opreguleres proteiner. Målretningsindstillingerne proteiner med differentiel overflod (tabel S1) spillede afgørende roller i en række cellulære veje, herunder metabolisme, apoptose, antioxidant aktivitet, cellecyklus, proliferation, signaltransduktion og celleadhæsion. Selv om den nøjagtige mekanisme, ved hvilken BI-TK /GCV når sine intracellulære mål er uklar, er rettet mod proteiner af BI-TK /GCV skulle deltage i celleproliferation og apoptose af blære cancerceller, og tilvejebringe nye mål for det fremtidige behandling.

Prx-jeg stod i vores proteomisk analyse, fordi det sjældent var blevet forbundet direkte med blærekræft, selv om det har vist sig at ned-express i blærekræft væv efter behandling med BI-TK /GCV. Pattedyrs peroxiredoxin (Prx) familie, som består af seks proteiner er H

2O

2-fjernende enzymer i prokaryote og eukaryote celler [11] – [13]. PRX-I tilhører typisk-2-Cys og er den mest rigelige og ubikvitært fordelt isoform af PRDX [14], [15], som er blevet tæt forbundet med celleproliferation og differentiering, intracellulær redox signalering, og apoptose [16] – [19]. PRX-I er højt udtrykt i faste organer og væv af nogle kræftformer [20] -, og er også positivt associeret med helingsfrekvens og progression af blærekræft [24], [25]. Tilsvarende Prx-I over-ekspression er forbundet med nedsat samlet overlevelse, dårlig klinisk resultat, og resistens af cancerceller til strålebehandling og kemoterapi [26] – [28], mens ned-ekspression af Prx-I ved RNAi er forbundet med terapeutiske udfordringer for leverkræft, kræft i spiserøret, og kræft i skjoldbruskkirtlen [29] – [31]. Faktisk, baseret på iTRAQ analyse (tabel S1), Western blot (fig. 3A) og IHC-analyse (fig. 3B) i den foreliggende undersøgelse, Prx-I-ekspression faldt betydeligt i blærekræft væv efter behandling med BI-TK /GCV , hvilket indikerer, at Prx-i kan bidrage til virkningen af ​​BI-TK /GCV-behandling på anti-vækst og pro-apoptose af blærecancer. Knockdown af Prx-I genet ved shRNA undertrykt signifikant vækst, fremmes apoptose og reguleret cellecyklussen i blære cancerceller (figur 6, 7). Disse resultater viser den positive rolle Prx-I i udviklingen af ​​blærekræft. Vi formoder, at BI-TK /GCV behandling systemet er i stand til at forhindre tumorvækst og inducere apoptose i gnaver blærekræft model ved nedregulering Prx-I-ekspression. Men hvad signalvej det er gennem?

Heldigvis har forbindelserne mellem Prk-I og NF-KB-komplekset signalering blevet stiltiende i proteinet vej i IPA (Figur 2C), der får os til at finde fingerpeg . Prxs har været impliceret som centrale regulatoriske faktorer i redox signalering [32] – [34]. Prxs kan slukke den anden messenger H

2O

2 og hæmme signaltransduktion ved at aktivere stofskiftet i H

2O

2. Overoxidation af Prx fra et cystein-sulfensyre (Cys-SOH) til en cysteinsulfinsyre (Cys-SO

2H) kan stoppe metabolismen af ​​H

2O

2, hvilket tillader akkumulering af H

2O

2 koncentration og udbredelsen af ​​signaltransduktion. Reduktion af Cys-SO2H til Cys-SOH opnås gennem handlinger sulfiredoxin, der genskaber Prx-medieret H

2O

2 stofskifte [35] – [37]. Cytoplasmatisk PRX1 regulerer H

2O

2-afhængige NF-KB-aktivering og nuklear translokation, og nuklear PRX1 regulerer NF-KB /DNA-binding gennem eliminering af H

2O

2 som en p50 subunit oxidant [ ,,,0],38]. PRX1 forøger p65-medieret cyclooxygenase (COX) -2 genekspression i østrogenreceptor (ER) deficiente humane brystcancerceller (MDA-MB-231), og knockdown af Prx-I kan dæmpe COX-2-ekspression ved at reducere belægning af NF -κB ved sin opstrømspromotorelement, hvilket indikerer, at Prx-i virker som en chaperone at forbedre transaktiveringspotentialet af NF-kappaB i ER-deficient-brystcancerceller [39]. Faktisk, i den foreliggende undersøgelse, knockdown af Prx-I reducerede protein udtryk for phospho-NF-KB p50 og p65, og dermed det undertrykte vækst, fremmes apoptose og reguleret cellecyklussen af ​​blære cancerceller ved at hæmme NF-KB-vejen, der var i overensstemmelse med IPA-netværket (Figur 2C).

konklusioner

samlet set identificerede vi, at Prx-i sammen med NF-KB-vejen bidrog til blærekræft for første gang. BI-TK /GCV behandlingssystem udviste en bæredygtig anti-tumorvækst aktivitet og inducerede apoptose i blærekræft væv ved inhibering af Prx-I gennem NF-KB-vejen. Vores forskning giver et nyt indblik i blærekræft behandling og indikerer, at BI-TK /GCV behandlingssystem ved at målrette på Prx-I kan være en roman terapeutisk strategi i fremtiden.

Støtte oplysninger

tabel S1.

iTRAQ Analyse af forskelligt udtrykte proteiner i normal saltvandsopløsning gruppe (iTRAQ 114), BI-TK gruppe (iTRAQ 115), BI /pGEX-1 gruppe (iTRAQ 116) og BI-gruppen (iTRAQ 117)

doi.: 10,1371 /journal.pone.0098764.s001

(DOCX)