PLoS ONE: Evaluering af virkningerne af den Cancer Therapy Everolimus på det centrale nervesystem i mus

Abstrakt

Kræft og behandlinger kan fremkalde kognitive svækkelser i kræftpatienter, og årsagssammenhængen mellem kemoterapi og kognitive dysfunktioner blev for nylig valideret i dyremodeller. Nye kræft målrettede behandlinger er blevet udbredt, og deres indvirkning på hjernens funktioner og livskvalitet skal udforskes. Vi evaluerede virkningen af ​​everolimus, et anticancer-middel rettet mod mTOR pathway, på kognitive funktioner, cerebral metabolisme og hippocampus celledeling /vaskulær tæthed i mus. Voksne mus modtog everolimus dagligt i 2 uger, og adfærdsmæssige tests blev udført fra 1 uge efter sidste behandling. Everolimus-behandlede mus viste en markant reduktion i vægtforøgelse fra den sidste dag i behandlingsperioden.

Ex vivo

analyse viste ændret cytochrom oxidase aktivitet i selektive cerebrale regioner involveret i energibalance, fødeindtagelse, belønning, indlæring og hukommelse modulation, søvn /vågner cyklus regulering, og ophidselse. Ligesom kemoterapi, gjorde everolimus ikke ændre følelsesmæssige reaktivitet, indlæring og hukommelse forestillinger, men i modsætning til kemoterapi, påvirkede ikke adfærdsmæssige fleksibilitet eller reaktivitet til nyhed.

In vivo

hippocampus neural celledeling og vaskulær tæthed var også uændret efter everolimus behandlinger. Som konklusion havde to uger dagligt everolimus behandling ved klinisk dosis ikke fremkalder ændring af kognitive præstationer evalueret i hippocampal- og præfrontal cortex-afhængige opgaver, der ville vare ved i en til fire uger efter afslutningen af ​​behandlingen er afsluttet. Imidlertid akut everolimus behandling forårsagede selektive CO modifikationer uden at ændre mTOR effektor P70S6 kinase i cerebrale områder involveret i spiseadfærd og /eller af søvn /vågen-cyklussen, i det mindste delvis under kontrol af den ensomme kernen og den parasubthalamic region af hypothalamus. Således kan dette område er et vigtigt mål for everolimus-medierende perifere modifikationer, som tidligere er blevet forbundet med symptomer som vægttab og træthed

Henvisning:. Dubois M, Le Joncour V, Tonon MC, Anouar Y , Proust F, Morin F, et al. (2014) Evaluering af virkningerne af den Cancer Therapy Everolimus på det centrale nervesystem i mus. PLoS ONE 9 (12): e113533. doi: 10,1371 /journal.pone.0113533

Redaktør: David L. McCormick, IIT Research Institute, USA

Modtaget: 17. april, 2014 Accepteret: 24 oktober 2014; Udgivet: December 1, 2014

Copyright: © 2014 Dubois et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af universitetet i Roue, Inserm og Baclesse centret modtager tilskud fra Novartis (Novartis) 071160-001141-05. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikt: The Grant til baclesse center of Caen, Frankrig, af Novartis (Novartis- 071.160-31 001.141-05) var en generel pædagogisk tilskud og blev brugt til at støtte en post-doc førende forskning i everolimus. Desuden forfatterne modtagne everolimus og mikroemulsionen gennem en MTA med Novartis. Pr Florence Joly er medlem af en høring videnskabelig bestyrelse Novartis. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Selv om fremkomsten af ​​potente anticancer midler har forbedret patient overlevelse, er der stigende tegn på, at både kræft og dens behandlinger kan inducere kognitive dysfunktioner, der påvirker daglige livskvalitet. Patienter, der får kemoterapi rapport opmærksomhed og koncentration ombygninger, visuelle og verbale hukommelse underskud, og opbremsning af psykomotorisk behandling (kaldet “chemofog” eller “chemobrain”), som kan vare i flere år efter behandlingen er afsluttet [1]. I de senere år er targeted midler i stigende grad blevet anvendt i cancerbehandling, og tidligere rapporter tyder på, at nogle af dem kan gennemtrænge blod-hjerne-barrieren og virker direkte i hjernen, der påvirker cerebral angiogenese og funktion [2]. I overensstemmelse med denne hypotese, administration af bevacizumab til patienter med metastatisk kolorektal cancer og sunitinib i patienter med metastatisk nyrekræft resulterede i flere rapporterede tilfælde af posterior leukoencefalopati [3], [4]. Endvidere kan en uforklarlig træthed eller asteni, forbundet med målrettede kræftbehandling, som ikke kan modvirkes ved hvile eller sove alvorligt påvirke både kognitive funktion og livskvalitet [5].

phosphotidylinositol-3-kinase (PI3K ) /AKT /pattedyr mål for rapamycin (mTOR) signaleringskaskade er en central molekylær mål for kræftbehandlingen [6]. mTOR signalering komponenter udtrykkes ved høje niveauer i flere områder af hjernen [7], [8], og mTOR pathway er kendt for at være involveret i forskellige neurobiologiske processer, herunder neuritudvækst [9], axon regenerering [10], myelination [11], og cellulær metabolisme [12]. Især har mTOR blevet vist at være en central regulator af cellevækst og kontrolleres af et stort antal signaler, herunder næringsstoffer, såsom glucose og aminosyrer og vækstfaktorer, såsom insulin og IGF-1. mTOR aktivering stimulerer også proteinsyntese og cellulær hypertrofi i forskellige celler og organer. Desuden er mTOR aktivering involveret i hippocampus synaptisk plasticitet og indlæring og hukommelse processer

via

proteinsyntese [13]. For eksempel har inhibering af mTOR aktivitet ved rapamycin vist sig at blokere inhibitorisk undgåelse langtidshukommelse [14] og for at forringe auditive [15], frygt [16], [17] og rumlig hukommelse konsolidering [18]. Desuden genetiske defekter i Ras /Erk /PI3K /mTOR signalveje kan være kausalt forbundet med flere humane genetiske sygdomme klassificeret som neuro-cardio-facial-kutane og hamartom syndromer, og dermed kan være ansvarlig for kognitive svækkelser [19]. Således kan det foreslås, at langvarig administration af mTOR-hæmmere forekommer i kræftbehandling kan påvirke hjernens funktioner er involveret i kognition og /eller metabolisme.

Everolimus (Afinitor, Novartis, Basel, Schweiz), en oralt administreret rapamycinderivat, direkte blokerer kinaseaktiviteten af ​​raptor /mTOR kompleks (mTORC1)

via

binding til FKBP-12 og således danner en inhibitorisk kompleks med mTOR [20]. Denne type af mTOR-hæmmer er godt karakteriseret for antineoplastiske egenskaber,

dvs

fremkalde fald i tumorcellevækst, proliferation og angiogenese

in vitro

in vivo

[ ,,,0],21] – [23]. Imidlertid generelle bivirkninger, herunder træthed, ødem, asteni, pyreksi, slimhindeinflammation, anoreksi, vægttab og smerter er blevet rapporteret [24] – [27]. Mere specifikt centralnervesystemet (CNS) bivirkninger, herunder hovedpine /migræne eller dysgeusi, er også beskrevet [26].

Målet med undersøgelsen var at evaluere potentiel kognitiv funktion-svækkelse sandsynligvis blive induceret ved målrettede behandlinger såsom everolimus ved anvendelse af en valideret mus adfærdsmæssig model [28]. Vi opnåede især opmærksomhed i den anvendte dosis for at være så meget som muligt i behandling af kræftpatienter betingelser. Faktisk er baseret på farmakokinetiske /dynamiske undersøgelser [29] – [31] den mest tilpasset og angivet dosis i avancerede hormon receptor-positiv, HER2-negativ brystkræft, avancerede neuroendokrine tumorer af pancreas oprindelse, fremskredent renalcellecarcinom, renal angiomyolipoma med tuberøs sklerose kompleks (TSC) er 10 mg /dag, men i tilfælde af toksicitet, den foreslåede dosis er 5 mg /dagligt. Også, blev en række undersøgelser udført i dyremodeller med denne 5 mg /daglig administration [22], [32], [33] og undersøgelser viste, at dette everolimus dosis er oralt aktiv i mus, og at steady state opnås inden for to uger med daglig dosering [22]. Dette 5 mg /kg /d tidsplan synes at være den minimale koncentration for den maksimale effektive dosis uden tilsyneladende toksicitet.

De potentielle langvarige virkninger af everolimus behandling på mus kognition og neurobiologiske processer blev evalueret ved hjælp hippocampal- og frontal cortex-afhængig adfærdsmæssige opgaver og på hippocampal celleproliferation, eller vaskulær niche densitet henholdsvis. Dens akut effekt på neurale celle aktivitet blev undersøgt

ex vivo via

vurdering af regionale hjernens cytochrom oxidase aktivitet.

Materiale og metoder

Dyr og etiske udsagn

Mand C57BL /6J Rj mus (Janvier, Le Genest Saint Isle, Frankrig) 7 uger været opstaldet under kontrollerede standard miljøforhold: 22 ± 1 ° C; 5 dyr pr bur; 12 timer /12 timer lys /mørke cyklus (lys på: 0:00); vand og mad til rådighed

ad libitum

. I løbet af 2-ugers prøvetid, blev dyrene håndteret dagligt for vægt overvågning. Behandling administration begyndte, da musene var 9 uger gamle. Mus blev vejet dagligt fra den dag, den 1. behandling indtagelse til den 36. dag efter den sidste administration. Vægten af ​​dyr inden 1. injektion (D0) blev anvendt som grundlag værdi til beregning af vægtforøgelse under eksperimentet. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den franske Etisk Udvalg samt retningslinjerne i Europa-Parlamentets direktiv 2010/63 /EU og Rådet om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Dette projekt blev godkendt af “Comité d’Ethique normandie en Matière d’eksperimenteren Animale” CENOMEXA under den nationale udvalg for dyreforsøg, og modtaget følgende nummer N /12-11-12 /35 /11-17. Animal manipulationer blev udført under tilsyn af en autoriseret investigator (H. Castel;. Tilladelsen ikke 76,98 fra Ministère de l’Alimentation, de l’Agriculture et de la Pêche)

Drug administration

.

En mikroemulsion af everolimus formuleret ved 2% (vægt /volumen), som leveres af Novartis (Rueil-Malmaison, Frankrig), blev opløst i 0,9% NaCI og administreret dagligt ved oral sondeernæring (5 ml /kg)

via

en fødenål (fine Science Tools, Heidelberg, Tyskland) ved 5 mg /kg i 14 på hinanden følgende dage [34].

cytochrom oxidase aktivitet og hjernens stofskifte

Mus, som fik vehikel (

n

= 8) eller everolimus (

n

= 9) i 2 uger blev straks aflivet efter den sidste behandlingsdag at studere cytochrom oxidase aktivitet i forskellige cerebrale områder. Mus blev bedøvet ved anvendelse af isofluoran, halshugget, og deres hjerner fjernes hurtigt 24 timer efter den sidste dag med behandling, frosset i 2-methylbutan (Sigma-Aldrich, San-Quentin Fallavier, Frankrig) ved -30 ° C og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Cryostatsektioner, hver 30 um tyk, blev skåret fra Bregma +3.20 mm til -6,48 mm og opbevaret ved -20 ° C indtil bearbejdning. For hvert dyr blev 8 partier af 41 på hinanden følgende skiver taget, såsom på et dias 2 sektioner blev adskilt af 240 um.

Alle hjernen skiver af et parti per dyr blev behandlet samtidigt under de samme betingelser. Protokollen blev tilpasset fra tidligere udgivelser [35], [36]. Snit blev inkuberet i mørke (37 ° C, 50 minutter) i 0,1 M phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 120 mg horse-hjerte cytochrom c, 24 g saccharose, 300 mg DAB-4-HCI og 108 mg katalase ( Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrig) per 540 ml. Skiverne blev vasket (5 min) med kold buffer (10% sucrose i PBS), nedsænket i 30 minutter i en 10% formalin /bufferopløsning, og vasket to gange (5 minutter) i puffer før dehydrering. Sektioner blev derefter dække-gled med EUKITT (VWR International, Strasbourg, Frankrig) og mikroskopisk undersøgt.

Produktet af histokemiske reaktion (oxideret DAB) var synlig med optisk mikroskopi. I hvert område af interesse, blev dens farvningsintensitet målt ved densitometrisk analyse ved hjælp af en computer-assisteret billedanalyse arbejdsstation (SAMBA Technologies, Meylan, Frankrig) [37]. For hvert område undersøges, blev mindst 2 skiver per dyr anvendes, afhængigt af anteroposteriore længde regionen, med målinger udført bilateralt når det er muligt. Baggrunden blev trukket for hvert dias. De forskellige cerebrale regioner blev identificeret ved hjælp af Franklin og Paxinos [38] mus hjernen atlas.

Behavioral test

I alt 14 mus fik everolimus behandling og 12 mus fik opløsningsmiddel kun (køretøj gruppe) i 2 uger. Adfærdstestning begyndte 7 dage efter den sidste administration behandling og varede 23 dage (fig. S3A). blev udført Alle eksperimenter 13:00 til 18:00, i begyndelsen af ​​dyrenes aktive fase.

Kognitive funktioner blev evalueret under anvendelse af Morris water maze, hvori mus skal flygte fra et vandbassin ved at finde en platform placeres i puljen [39]. En cylindrisk beholder (diameter 93 cm, højde 45 cm) blev fyldt med vand (opretholdt ved 23 ± 1 ° C) til en højde på 40 cm, gjort uigennemsigtig med hvid, inaktivt, vandig akryl emulsion (Accusol OP 301, Viewpoint, Frankrig ). Tanken blev anbragt i en belyst rum (50 lux på den centrale overflade af puljen) med ekstra-labyrint signaler på væggene. Vandet labyrint var opdelt i fire virtuelle kvadranter: nord-vest (NW), nord-øst, syd-øst, og syd-vest, og dyreadfærd blev video spores. På dag 1 blev dyrene bekendt med puljen og deres motivation og visuo-motoriske evner evalueres. En flugt platform (diameter 9,7 cm) blev anbragt i tanken center, spirende 1 cm over vandoverfladen og med en lille sort kugle fastgjort på den for at lette dens visning på den del af dyrene. Mus blev anbragt på platformen i 20 sekunder. Umiddelbart efter en session består af fire 60-sekunders forsøg (inter-trial interval: 30 minutter) blev gennemført. Dyrene blev placeret, mod væggen, på en af ​​fire startsteder (nord, syd, øst eller vest) og lov til at svømme til den synlige platform for højst 60 sekunder. Mus ikke finde den platform blev placeret manuelt på det i 20 sekunder. På dag 2-5 blev rumlige indlæringsevne evalueret i en uddannelse fase af 4 daglige forsøg, maksimalt 60 sekunder hver, hvori flugtplatformen blev placeret i NW kvadrant, nedsænket 1 cm under vandoverfladen. 2 timer efter den sidste retssag mod den sidste dag i uddannelsen periode blev en sonde test udført ved at fjerne platformen og lade dyrene til at svømme i 60 sekunder, med tid brugt i den tidligere korrekt kvadrant (NW) målt. Rumlig hukommelse evner blev evalueret i en hentning fase på dag 10, ved hjælp af en enkelt session af 4 forsøg under de samme betingelser som uddannelsen fase. Learning plasticitet blev evalueret i en overførsel fase over 4 dage i træk (4 forsøg /dag, højst 60 sekunder hver) ved dagligt skiftende den skjulte platform placering. Afstand krydsede og flygte latens blev målt.

Hippocampal celleproliferation, vaskulær tæthed og phosphoryleret P70S6 kinase immunolabeling

5-brom-2-deoxyuridin (BrdU) -mærkede celler i og uden for subgranular zone af hippocampus (SGZ) blev talt. For at mærke voksen-genereret celler i gyrus dentatus af hippocampus, 6 intraperitoneale injektioner (50 mg /kg) BrdU (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrig) blev administreret i løbet af de sidste dage i behandlingsperioden i mus ikke undergår adfærdsmæssige evaluering (fig. S3C). Dagen efter den sidste sonde, og 3 timer efter BrdU injektion, mus blev bedøvet ved hjælp isofluoran, halshugget, og deres hjerner fjernes hurtigt, frosset i to-methylbutan (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrig) ved -30 ° C og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Hjerner blev skåret med en kryostat i serielle kranssektioner (tykkelse 20 um) fra den forreste del af den dorsale hippocampus (anteroposteriore, 1,20 mm fra bregma -1,44 mm). Hver 12. sektion, hver adskilt af 240 um, blev monteret på objektglas overtrukket med gelatine-krom alun og opbevaret ved -20 ° C indtil bearbejdning.

Seks hippocampale snit fra hver af 4 dyr pr gruppe blev farvet samtidigt til BrdU visualisering. Hjerneskiver blev fikseret (4% paraformaldehyd i PBS, vasket 3 × 5 minutter med PBS pH 7,4, og inkuberet (2 N HCI; 45 ° C; 45 minutter) for at denaturere DNA Snit blev derefter vasket (PBS, 3 × 5 minutter). , inkuberet i 1 time i blokeringsopløsning indeholdende 1:50 normal donkey serum, 1% bovint serumalbumin og 0,3% Triton X-100 (VWR International, Strasbourg, Frankrig) i PBS, og inkuberet natten over ved 4 ° C med fåre anti -BrdU immunoglobulin G. (IgG; Abcam, Paris, Frankrig) ved 1:400 i blokeringsopløsning Efterfølgende blev snit vasket (PBS, 4 × 5 minutter) og inkuberes (2 timer, stuetemperatur) med Alexa 488-konjugeret æsel-anti -sheep IgG (Invitrogen, Boulogne-Billancourt, Frankrig) ved 1:400 i PBS. skyllet sektioner blev dækning gled med Mowiol. snittene blev undersøgt på et Nikon Eclipse E600 mikroskop (Nikon instrument, Champigny-sur-Marne, Frankrig) interface med Mercator software (ExploraNova, La Rochelle, Frankrig). En modificeret unbiased stereologiske fremgangsmåde blev anvendt til at tælle BrdU-positive celler i SGZ af gyrus dentatus og i området uden for SGZ [40], [41]. Antallet af farvede celler i 6 sektioner blev talt bilateralt, og som hver 12. afsnit blev anvendt, var dette tal ganget med 12. Alle tællinger blev udført af en investigator blindet til behandlingsgruppe.

Ved undersøgelse af hippocampal vaskulær niche densitet blev hjernesnit faste, vasket, og inkuberet som beskrevet ovenfor. Det primære antistof var kanin-anti-IQGAP1 (H-109) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Tebu-bio, Le-Perray-en-Yvelines, Frankrig) fortyndet 1:400 i blokeringsopløsning, og det sekundære antistof var Alexa 488 -konjugeret æsel-anti-kanin IgG ved 1:400 i PBS. Snit blev modfarvet med nuklear markør DAPI (1 ug /ml). Immunofluorescens blev observeret under et konfokal mikroskop og IQGAP1-mærkede strukturer i SGZ vurderet i 3 sektioner adskilt af 240 um (mellem Bregma -1,68 mm og -2,16 mm).

For at undersøge de aktive former (phosphoryleret) af P70S6 kinase (p-p70S6k), hjerneudsnit fra køretøjet og everolimus-behandlede mus blev fikseret, vasket, og p-p70S6k-ekspression blev målt ved hjælp af det primære antistof-anti-p-p70S6k (Abcam ab60948, Paris, Frankrig) fortyndet 1:200 i blokerende opløsning, og det sekundære antistof var Alexa 488-konjugeret æsel-anti-kanin IgG ved 1:400 i blokeringsopløsning. P-p70S6k-mærkede strukturer blev vurderet i 2 eller 3 sektioner adskilt af 240 um (mellem Bregma -0,98 mm og -1.70 mm for bue, Re, Rh, submed, VM, mellem -1,22 mm og -1,94 mm for EP, Ect og PRH;. mellem -2,06 mm og -2.54 mm for PSTh) med Nikon Eclipse E600 mikroskop (Nikon instrument, Champigny-sur-Marne, Frankrig) interface med den imaging software NIS-Elements

Kultur af neurale stamceller celler og endotelceller

i neural stamcelle (NSC) kultur, hjerne fra C57BL /6J Rj nyfødte mus blev vasket i trypsin. Cellesuspensionen blev centrifugeret ved 100 G i 4 minutter, og cellerne blev anbragt i frisk serum-frit medium. Dette medium bestod af Neurobasal (100 ml, Gibco, Saint-Aubin, Frankrig) suppleret med 5 mM HEPES buffer (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrig), 1 ml B27 og 1 ml N2 vækst supplement (Gibco), 20 uL epidermal vækstfaktor (20 ng /mL; Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrig), 10 pi basisk fibroblastvækstfaktor (10 ng /ml; Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrig), og 7,32 pi heparin (Sigma- Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Frankrig) og blev tilsat med 33 mM glucose. Celler blev udpladet ved en densitet på 100 levedygtige celler pr mikroliter i dette medium og blev dyrket i 25 cm

2 kolber ved 37 ° C i en CO 5%

2-95% luft befugtet inkubator. På dag 7 blev veludviklede neurosfærer opsamlet og fordøjet i trypsin i 10 minutter ved 37 ° C. Sekundære neurosfærer (P

1) og senere passager blev dannet ved mekanisk og enzymatisk dissociation af primære neurosfærer. Celler blev derefter inkuberet i fravær eller nærvær af køretøjet eller everolimus i 24 til 48 timer. Ved hjælp af en 4 × målsætning om et Nikon (Nikon Eclipse TS100, Kingston, England) omvendt mikroskop, vi målte den gennemsnitlige diameter på 20 tilfældigt udvalgte neurosfærer per brønd ( 40 um i diameter) i synsfeltet i 4 forskellige områder af 3 brønde i 24-brønds dyrkningsplader.

i endothelial cellekultur, anvendte vi polyomavirus mellemstor tumorantigen (mT) transformerede musehjerne kapillar endotel cellelinje (bEND.3, opnået fra Dr. D. Gorecki , Portsmouth University, England). Celler blev dyrket i høj glucose (4,5 g /L) -holdige Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 1,5 g /l natriumbicarbonat, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO

2. Til bestemmelse celleoverlevelse og proliferation blev celler udpladet i tredobbeltbestemmelse i flere sæt af 12-brønds dyrkningsplader. Inkubation ± køretøj /everolimus i 24-48 timer var i FBS-frit medium. Celleproliferation blev kvantificeret ved elektronisk tælle celle tal (Z2, Beckman Coulter, Villepinte, Frankrig).

Statistisk analyse

vægtøgning og rumlig læring forestillinger blev analyseret af 3-måder ANOVA med gentagne målinger efterfulgt af mindst signifikant forskel (LSD) post hoc-analyser, når de var nødvendige. For probe test af Morris water maze, tid brugt i kvadrant hvor platformen var placeret blev sammenlignet med den forudsagte tilfældigt ved hjælp af χ

2 tests. Andre adfærdsmæssige data, immunhistokemisk og cytochrom oxidase aktivitetsdata blev analyseret med Student

t

tests. Disse data blev analyseret med Statistica © 5.1. Data for hippocampale celleproliferation og data af kulturen undersøgelser blev analyseret med den ikke-parametriske Mann-Whitney U-test og ANOVA af Kruskal-Wallis efterfulgt af Dunns test med GraphPad Prism 5. For alle statistiske test blev mærkbarhedsgrænse sat til

s

≤.05.

Resultater

Everolimus-induceret vægtøgning ændringer

Vi først evalueret konsekvenserne af en kronisk mTOR hæmning på kropsvægt i mus. Administration af everolimus (5 mg /kg) dagligt til unge mus med sonde i 2 uger produceret nogen synlig morbiditet og /eller mortalitet. Henviser til, at kontrol (emulsion) gruppe fortsatte med at tage på i vægt i løbet af forsøget, havde everolimus-behandlede mus reduceret vægt (behandling × dag interaktion: F

23.552 = 8,29,

s

. 001) fra 17rd dage efter indførelsen af ​​mTOR-hæmmer, og fortsatte med at veje mindre hele den følgende forsøgsperioden (LSD post hoc

s

0,01;.. figur 1)

Kropsvægt af køretøj og og everolimus-behandlede mus blev evalueret på lang sigt efter afslutningen af ​​behandlingsperioden (grå søjle). Mus modtog vehikel eller everolimus en gang dagligt i 14 sammenhængende dage. Søjler repræsenterer standardafvigelse på middelværdien. ANOVA, Behandling x Day interaktion

s

0,001 efterfulgt af LSD post hoc: **

s

0,01, ***

s

. 001.

Kortsigtede konsekvenser af everolimus på cerebral cytochrom oxidase aktivitet og P70S6 kinase phosphotylated formular

for at vurdere virkningen af ​​mTOR-hæmmer på cerebral cellemetabolisme, en histokemisk analyse afslører cytochrom oxidase-aktivitet er blevet udført i hjernen skiver af kontrol og behandlede mus (tabel 1). I everolimus-behandlede mus, 4 dage efter afslutningen af ​​behandlingsperioden, et signifikant fald (

s Restaurant .05) af cytochrom oxidase aktivitet var til stede i skallen del af accumbens kernen (t

13 = 2,52), den prelimbic cortex (t

15 = 2,20), den laterale præoptiske område (t

14 = 2,33) og motoren trigeminus kerne (t

13 = 2,38). Desuden everolimus behandling resulterede i øget metabolisk aktivitet i ectorhinal cortex (t

14 = -2,61), den entopeduncular kerne (t

13 = -2,27), den parasubthalamic kerne af hypothalamus (t

14 = -2,91), den ensomme kerne (t

13 = -2,49), og i de thalamiske reuniens (t

14 = -2,48), rombisk (t

14 = -2,31), submedius (t

14 = -2,30), og ventromedial (t

14 = -2,56) kerner (alle

s

0,05) (figur 2A og tabel 1).. For at undersøge den mulige direkte eller indirekte inhibering af mTOR i disse hjerneområder blev aktiviteten af ​​en nedstrøms effektor af mTOR pathway vurderet ved immunfarvet niveauer af phospho-P70S6 kinase (p-p70S6k) i forskellige hjerneområder der udviser eller ikke CO metaboliske ændringer. Behandlingen ikke signifikant ændre p70S6k-positiv mærkning i ectorhinal cortex, entopeduncular kerne, reuniens, rombeformede, ventromediale og submedial thalamiske kerner og parasubthalamic kerne udviser modificerede CO aktiviteter, samt i perirhinal cortex og buet hypothalamus kerne viser ingen ændringer i CO aktiviteter (fig. 2B og C).

(a) CO aktivitet i selektive køretøj og og everolimus-behandlede mus hjerneområder. (B) Repræsentative billeder af Phospho-p70S6k (p-p70S6k) immunolabeling i cortex, entopeduncular kerne, thalamus og hypothalamus køretøj eller everolimus-behandlede mus. (C) Mean procent af P-p70S6k-mærket overflade (normaliseret til køretøjet) (+ SEM) i de forskellige hjerneområder. Arc: buet kerne; Ect: ectorhinal cortex; EP: entopeduncular kerne; PRH: perirhinal cortex; PSTh: parasubthalamic kerne; Re: reuniens thalamus kerne; Rh: rombeformede thalamic kerne; Submed: submedial thalamic kerne; VM:. Ventromedial thalamiske nuleus

Ingen følelsesmæssige og kognitive ændringer efter everolimus behandling

Følelsesmæssig adfærd

Syv dage efter afslutningen af ​​behandlingsperioden. den procentdel af open arm poster i den forhøjede plus maze (Se Materialer og metoder S1) var ikke signifikant forskellig mellem de 2 behandlingsgrupper, hvilket antyder, at everolimus påvirkede ikke angst-lignende opførsel (t

24 = 1,66,

s

0,05;. figur S1A). I testen med tvungen svømning, ubevægelighed varighed var ikke statistisk forskellige mellem grupperne, hvilket indikerer, at everolimus ikke ændrede depressive-lignende adfærd (t

24 = 0,65,

s Restaurant .05;. Fig S1B ).

Rumlig indlæring og hukommelse.

Under fortrolige fase af Morris water maze test, svømning hastighed (t

24 = -0,69,

s

0,05; ikke vist), krydsede afstand (t

24 = 0,49,

s

0,05; ikke vist) og tid, det tager at finde den opstod platform (t

24 = 0,93 ,

s

0,05;. figur 3A) blev ikke signifikant ændret ved behandling, hvilket indikerer, at motivation og visuo-motor evne var upåvirket af everolimus. Under købet fase gjorde everolimus ikke ændre rumlig indlæring 15 dage efter afslutningen af ​​behandlingsperioden, da flugten latenstid (F

1,24 = 0,94,

s

0,05; Fig . 3B) og afstand krydsede (F

1,24 = 0,32,

s

0,05;. figur 3C) var ikke signifikant forskellig mellem grupperne. Forestillinger væsentligt forbedret, da testen blev gentaget (undslippe latens F

3,72 = 18,38,

s

0,001 og afstand krydsede F

3,72 = 19,51,

p

0,001). Under sonden test, alle mus brugt betydeligt mere tid i den tidligere korrekt kvadrant end forudsagt ved en tilfældighed (køretøj: X

2

11 = 117,67,

s

0,001; everolimus: X

2

13 = 231,80,

s

0,001;. figur 3D). Under hentning fase, gjorde everolimus-behandlede mus ikke vise rumlig hukommelse ydeevne nyrefunktion, da deres flugt latenstid (t

24 = 0,49,

s

0,05;. Figur 3B) og afstand krydsede ( t

24 = 0,40,

s

0,05;. figur 3C) ikke adskiller sig væsentligt fra de køretøjer mus

(A) Motivation og visuo-motoriske evner efter. køretøj eller everolimus behandling (Student

t

test,

s

0,05). (B og C) Under uddannelsen og genfinding (R) faser, latenstid (B) og afstand krydsede (C) efter køretøj eller everolimus behandling (ANOVA, Day effekt ***

s

0,001) . (D) I løbet af sonden test, tid, dyr af begge grupper i kvadrant hvor platformen var placeret under træningen fase (χ

2, ***

s

0,001

vs

chance). Under overførslen fase, flygte latency (E), krydsede afstand (F), og svømning hastighed (G) i køretøj og eller everolimus-behandlede mus (ANOVA, Behandling effekt *

s

0,05, Trial effekt ***

s

0,001 efterfulgt af LSD post hoc

##

s

0,01). (H) I løbet af 1. dag i overdragelsesfasen, tid brugt i den tidligere korrekt nordvestlige kvadrant efter køretøj eller everolimus behandling (Student

t

test,

s

0,05). Dataene er middel + SEM

Under overførslen fase af Morris water maze test, dyr forbedret deres præstationer på tværs forsøg (flugt latenstid:. F

3,72 = 9,76,

s

0,001; afstand krydsede F

3,72 = 14,99,

s

0,001;. figurerne 3E og 3F). Learning plasticitet, vurderet ved daglige modifikation af platformen placering, var upåvirket af behandling; undslippe ventetid før at finde den skjulte platform var ens mellem grupperne (F

1,24 = 3,36,

s

0,05;. figur 3E). Men afstanden krydses af everolimus-behandlede mus var signifikant øget i forhold til køretøjets mus (F

1,24 = 6,08,

s

0,05;. Figur 3F). ANOVA vurdering afslørede en betydelig behandling × forsøg interaktion i form af svømning hastighed (F

3,72 = 3,69,

s

0,05). LSD post hoc analyser viste, at everolimus-behandlede mus svømmede hurtigere end køretøjer mus i løbet af de første og tredje forsøg (

s

0,01;. Figur 3G). Under dag en af ​​overdragelsen fase gjorde everolimus ikke ændre den tid i kvadrant, der var korrekt under træningen fase (t

24 = -0,39,

s

0,05;. Fig 3H ), hvilket tyder på fravær af adfærdsmæssige perseveration.

spontan aktivitet og anerkendelse hukommelse.

Everolimus ændrede ikke spontan bevægeapparatet og vertikale aktiviteter. Afstanden krydsede og skæve antal var ikke signifikant forskellig mellem behandlingsgrupperne (t

24 = 0,63,

s

0,05 og t

24 = 0,39,

s

0,05, henholdsvis;. figurerne S1c og S1D). I objektet anerkendelse test, dyr af begge grupper opdaget nyhed, med længere udforskning varigheder af romanen objektet

vs

de velkendte dem (køretøj: t

11 = -2,90,

s

0,05; everolimus: t

13 = -4,51,

s

0,001, fig S1E).. Som vist i fig. Scale bar, 100 pm. Fig. Scale bar, 100 pm.