PLoS ONE: Withaferin A synergistisk Den terapeutiske virkning af doxorubicin gennem ROS-medieret Autophagy i æggestokkene Cancer

abstrakt

Anvendelse af doxorubicin (Dox) til behandling af cancer er begrænset på grund af dets alvorlige bivirkninger. Vi brugte kombination strategi ved at kombinere doxorubicin (Dox) med withaferin A (WFA) for at minimere de skadelige virkninger af Dox. Behandling af forskellige epitelial ovariekræft cellelinier (A2780, A2780 /CP70 og CaOV3) med kombination af WFA og Dox (WFA /DOX) viste en tids- og dosisafhængig synergistisk effekt på hæmning af celledeling og induktion af celledød, således reducere kravet dosis af Dox. Kombinationsbehandling resulterede i en betydelig forøgelse af ROS produktion resulterer i enorme DNA-skader, induktion af autophagy analyseret af transmissions elektron mikroskop og stigning i ekspressionen af ​​autophagy markør LC3B, og kulminerede i celledød analyseret af kløvet caspase 3. Vi valideret kombinationsbehandling på tumor vækst anvendelse af en in vitro 3Dimension (3D) tumormodel og mere klassiske

in vivo

xenograft model af ovariecancer. Begge tumormodeller viste en reduktion i tumorvækst 70 og 80% sammenlignet med kontrol eller dyr behandlet med WFA eller Dox alene. Immunohistokemisk analyse af tumorvæv fra dyr behandlet med WFA /Dox kombination viste en signifikant reduktion i celleproliferation og dannelse af mikrokar ledsaget af forøget i LC3B niveau, kløvet caspase 3, og DNA-beskadigelse. Tilsammen vore data antyder, at kombinere WFA med Dox nedsætter kravet dosis af Dox derfor minimere /eliminere de alvorlige bivirkninger forbundet med høje doser af DOX, tyder anvendelsen af ​​denne kombination strategi til behandling af ovarie- og andre cancere med ingen eller minimale bivirkninger

Henvisning:. Fong MY, Jin S, Rane M, Singh RK, Gupta R, Kakar SS (2012) Withaferin A synergistisk den terapeutiske effekt af doxorubicin gennem ROS-medieret Autophagy i kræft i æggestokkene . PLoS ONE 7 (7): e42265. doi: 10,1371 /journal.pone.0042265

Redaktør: Yunli Zhou, Harvard Medical School, USA

Modtaget: Maj 22, 2012; Accepteret: 2 jul 2012; Udgivet: 30 Jul 2012

Copyright: © Fong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding kom fra National Institutes of Health /National Cancer Institute CA124630. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Raj K Singh er ansat af Vivo Biosciences Inc. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft i æggestokkene er den mest dødbringende malignitet af den kvindelige reproduktive tarmkanalen [1]. På grund af manglende symptomer på et tidligt stadium af sygdommen, de fem-års overlevelse er kun 27,2% [1]. Den hovedspor behandling af kræft i æggestokkene er cytoreduktive kirurgi efterfulgt af platinbaseret [2] kemoterapi. Oprindeligt, ovariecancer reagerer positivt i 70 til 80% af tilfældene [3]. Men inden for 18 til 24 måneder efter første behandling, tumor tilbagefald, som (for ca. 70% af patienterne) tilskrives de kræftsvulster efter at være blevet platinresistent [3] Dette dårlig overlevelse for kvinder med platin-resistente ovariecarcinomer point til et presserende behov for en alternativ behandling strategi.

Doxorubicin (Dox) er et bredspektret anthracylin isoleret fra

Streptomyces peucetius Hoteller, som har været anvendt til behandling af flere kræftformer, herunder ovarie, bryst og prostata [4]. Faktisk anthracylins er de mest udbredte FDA godkendte anticancerlægemiddel [5]. Dox effektivitet er blevet tilskrevet dens evne til at indskyde mellem DNA-strengene til at fungere som en topoisomerase II inhibitor og /eller binde covalent til proteiner involveret i DNA-replikation og transkription [5]. Anvendelsen af ​​Dox er begrænset af alvorlige dosisafhængige bivirkninger herunder akut kvalme og opkastning, stomatitis, neurologiske forstyrrelser, myocardial toksicitet, alopecia og knoglemarvsaplasi [5]. Alternativt er pegyleret liposomal doxorubicin (PLD) (DOXIL) betragtes som en af ​​de standard behandlingsmuligheder i tilbagevendende ovariecancer (ROC) [6]. Trods forholdsvis lavere bivirkninger, Doxil har meget lav svarprocent ( 20%) [6]

For nylig kombinationsbehandling med Dox har høstet mere opmærksomhed.. Kombinere Dox med sildenafil resulterede i en forbedret celledød via nedregulering af Bcl-2 koblet til øget caspase 3 ved at udbygge de Dox-induceret dannelse af reaktive ilt arter (ROS), mens formildende Dox-induceret hjertedysfunktion [7]. Dox er også blevet kombineret med HO-3867, en syntetisk curcumin analog, for at opnå øget celledød og nedsat myocardial toksicitet ved anvendelse af lavere doser af Dox [8]. Derfor har kombinationsbehandling vist sig at være en nyttig metode til at reducere de bivirkninger forbundet med Dox, men bevare sin terapeutiske funktion.

Withaferin A (WFA) er bioaktive, celle gennemtrængelig steroide lacton have withanolide skelet som sit grundlæggende struktur. WFA er isoleret fra planten

withania somniferia

, som har været en del af indisk ayurvedisk medicin i århundreder, og er nu tilgængelig som en over-the-counter kosttilskud i USA Det har været anvendt til behandling af en lang række betingelser på grund af sine anti-inflammatoriske og anti-bakterielle egenskaber. For nylig er det blevet foreslået som et potentielt anti-cancer forbindelse som det har vist sig at hæmme tumorvækst, angiogenese og metastase [9], [10]. Adskillige biologiske funktioner har været påvirket af WFA herunder induktion af apoptose gennem inaktivering af Akt og NF-KB [11] samt nedgang af pro-overlevelse protein Bcl-2 [12], [13], induktion af Par-4 [14 ], hæmning af Hsp90 og Notch-1 [15], G2 /M cellecyklusstop [16], FOXO3a og Bim regulering [9], generation af ROS [17], [18] og nedregulering af ekspressionen af ​​HPV E6 og E7 oncoproteiner [19].

en tidligere undersøgelse har vist, at WFA forbedrer den cytotoksiske virkning af Dox i et osteogent sarkom (U2OS) og brystcancer-cellelinie (MCF-7) ved anvendelse af en celleproliferationsassay [20] . Imidlertid har den kombinerede effekt af Dox og WFA ikke undersøgt i kræft i æggestokkene, en virkningsmekanisme bestemt eller kombinationsbehandling testet

in vivo

til undertrykkelse af tumorvækst. Vi foreslog, at WFA når det kombineres med Dox vil fremkalde en synergistisk effekt på undertrykkelse af æggestokkene tumor vækst. For at teste hypotesen, studerede vi den kombinerede virkning af Dox og WFA på cisplatin-sensitive ovarieepitelceller cancercellelinie A2780, cisplatin-resistente ovariecancer epitelcellelinie A2780 /CP70, og p53 mutant ovariecancer epitelcellelinje CaOV3. For første gang viste vi, at celledød blev induceret ved ROS produktion og DNA-skade, der fører til induktion af autofagi og afsluttet med celledød i caspase 3 afhængig måde. Vi viste også, at effekten af ​​Dox og WFA

in vitro

ved hjælp af 3D tumorer genereret fra A2780-celler på en human ekstracellulær matrix. Endvidere undersøgte vi effekten af ​​kombinationsbehandlingen

in vivo

på tumorvækst, spredning, angiogenese, autophagy, celledød, og DNA-beskadigelse ved anvendelse xenotransplantattumorer fremstillet ved at injicere A2780 celler i nøgne mus.

Materialer og metoder

Etisk Statement

Dyr arbejde rapporteret i manuskriptet blev udført efter godkendelse af protokollen fra University of Louisville Animal Care Brug Udvalg (IACUC).

Cell kultur

Humant epitelial ovariecancer tumor cisplatin-sensitive (A2780) cellelinje blev opnået som en gave fra Dr. Denise Connolly (Fox Chase Cancer center, Philadelphia, PA). Cellelinien blev oprindeligt frembragt fra human ovariecancer patient før behandling [21]. Den cisplatin-resistente (A2780 /CP70) cellelinien blev opnået som en gave fra Dr. Christopher stater (University of Louisville, Louisville, KY). Denne cellelinie blev afledt fra A2780 cellelinie efter behandling med cisplatin [22]. CaOV3 cellelinje blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC). A2780 og A2780 /CP70 celler blev dyrket i RPMI-medium indeholdende 10% FBS, 1% penicillin /streptomycin og 0,05% (vol /vol) Insulin (Sigma). Caov3 celler blev dyrket i DMEM medium indeholdende 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. Antistoffer mod phospho-BAD Ser

136, Bd-XL, spaltet caspase 3, og GAPDH blev erhvervet fra Cell Signaling Technology. Ki67 antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, CD31 og LC3B fra ABCAM. Doxorubicin, withaferin A, N-acetyl-L-cystein, superoxiddismutase, katalase, og DMSO blev indkøbt fra Sigma.

celleproliferation (MTT) Assays Salg

A2780, A2780 /CP70, og Caov3 celler, der vokser i vækstfase blev trypsinbehandlet og blev podet i plader med 96 brønde. Efter 24 timers udpladning blev cellerne behandlet i tre eksemplarer med forskellige doser af Dox og WFA både alene eller en kombination af WFA /Dox for 24, 48 og 72 timer. Efter angivne tidsrum blev 20 pi MTT reagens fra celleproliferation (Promega) tilsat til hver brønd og inkuberet i ca. 1 time. Farveudvikling blev bedømt ved en ELISA-læser ved 492 nM som tidligere [23] beskrevne. Dox blev solubiliseret i vand og WFA blev solubiliseret i DMSO. DMSO (0,1% v /v) blev anvendt som en vehikelkontrol.

Isobologram Analyse

A2780 og A2780 /CP70-celler blev behandlet i triplikater i 48 timer under anvendelse af 7 koncentrationer af Dox og WFA både alene eller en kombination af WFA /Dox ved et konstant forhold, som beskrevet ovenfor. Levedygtige celler blev kvantificeret ved MTT-assays som beskrevet ovenfor og fraktion påvirkede blev beregnet ud fra procent inhibering. Fraktion påvirket blev derefter anvendt i CalcuSyn software til at generere en dosisresponskurve og isobologram.

celleapoptose assays under anvendelse af flowcytometri for Annexin V

A2780 blev behandlet med Dox og WFA både alene eller kombination af WFA /Dox, som beskrevet ovenfor i 24 timer. Celler blev dissocieret med versen (Invitrogen), vasket med PBS og resuspenderet i Annexin V-bindingsbuffer til en koncentration på 1 × 10

6 celler /ml. Annexin V-FITC (2 pi, BD Biosciences) blev inkuberet i 15 min i mørke med 100 pi cellesuspension. Fire hundrede pi Annexin V-bindingsbuffer blev tilsat til suspensionen. To pi propedium iodid (PI) blev tilsat til opløsningen og straks bruges på en FACSCaliber (BD Biosciences) som beskrevet af Betts et al [24]. Annexin V og PI farvede celler blev analyseret under anvendelse FlowJo software.

reaktive oxygenspecies (ROS) Assays Salg

A2780 celle blev podet på glasbund 35 mm

2 retter natten over efterfulgt af behandling med Dox og WFA som beskrevet ovenfor i 24 timer. Celler blev derefter inkuberet med 2 uM H

2DCFDA (Invitrogen) i vækstmedium i 30 min ved 37 ° C som beskrevet af Das et al [7]. Celler blev vasket med PBS, ses under konfokalt mikroskop, og fotograferet.

DNA Damage Analyse ved hjælp TUNEL assays Salg

A2780 celler blev podet på kammerobjektglas og behandlet med Dox og WFA som beskrevet ovenfor. Celler blev derefter analyseret for DNA-skader ved anvendelse deadend fluorometrisk TUNEL-assay kit (Promega) ifølge producentens instruktioner. Celler blev undersøgt under konfokalt mikroskop og fotograferes.

TUNEL assays for vævssnit blev udført ved anvendelse af en ApopTag Plus Peroxidase Apoptosis Detection Kit (Millipore, Billerica, MA) ifølge producentens instruktioner.

Protein Isolation og Western blot-analyse

A2780 celler blev podet i plader med 6 brønde og behandlet med Dox og WFA både alene eller en kombination af WFA /Dox som beskrevet ovenfor i 24 timer. Cellelysater blev fremstillet som tidligere [25] beskrevne. Proteiner blev opløst på SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (GE Healthcare). Primære antistoffer blev fortyndet som angivet af fabrikanten og inkuberet natten over ved 4 ° C. Antistofbinding blev afsløret ved peroxidasemærket sekundære antistoffer visualiseret under anvendelse af forstærket chemioluminescence (GE Healthcare) som tidligere beskrevet [26]. Blots blev derefter igen probet med GAPDH at normalisere forskellene i lastning.

tredimensionelle (3D) tumorvækst assays

A2780-celler (15.000 /perle) blev blandet med Hubiogel® i et forhold på 01:04 og dispenseret i 10 pi perler og fik lov til at polymerisere før de suspenderes i varmt vækstmedium til dannelse sfæriske tumorer. Hver kugleformet tumor (1 mm

3) blev overført til 96 brønds plade (en tumor /brønd) og behandlet med Dox (0,2, 2 uM), WFA (0,5, 2 uM), eller en kombination af WFA /Dox (0,5 pM /0,2 uM eller 2,0 uM /0,2 uM). Medium blev udskiftet (to gange /uge) med medium indeholdende frisk middel. Tumorvækst blev udført på dag 1, 3 og 7 under anvendelse af MTT-assays som beskrevet ovenfor. Tumorer efter behandlingen blev inkuberet med calcein AM (Invitrogen) i 30 minutter og undersøgt ved anvendelse af Nikon B-2EIC fluorescens mikroskop under anvendelse FITC filter blok på Ex

465-495 nm og Em

515-555 nm) og fotograferet.

xenograft tumordannelse og Behandling med Dox, WFA eller WFA /DOX

A2780 celler blev blandet med Matrigel (BD Biosciences) ved et 1:01 forhold. Celler (2 x 10

6) blev bilateralt injiceret subkutant i den ventrale flanke af 5-6 uger gamle nu /nu-mus (Charles River) og tumorer fik lov at vokse i 20 dage, indtil de nåede til 100 mm

3 i størrelse som tidligere [27] beskrevne. Musene blev derefter randomiseret i 6 grupper og injiceret med: 1) PBS, 2) 10% DMSO + 90% glyceryl trioctanoate (vehikel), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, eller 6) Dox 1 mg /kg + WFA 2 mg /kg. Mus blev behandlet hver anden dag i.p. under anvendelse af 100 pi volumen og tumorer blev målt med digital skydelære før hver behandling. Dox blev solubiliseret i saltvand henviser WFA blev solubiliseret i DMSO og glyceryl trioctanoate (10:90 v /v). Mus blev aflivet efter 12 dage fra begyndelsen af ​​behandlingen. Alle behandlinger blev godkendt af IACUC, University of Louisville.

immunhistokemisk analyse af tumorvæv

xenotransplantattumorer blev fikseret i 10% formalin og indstøbt i paraffin til sektionering. Objektglas blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i en gradueret række af ethanol. Antigen genfinding blev udført ved at inkubere objektglassene i 10 mM natriumcitrat, pH 6,0 i 20 minutter ved 95 ° C efterfulgt af behandling med 0,3% H

2O

2 i methanol i 20 min [28]. Slides blev behandlet ved hjælp af Vectastain ABC Elite Anti-kanin-kit (Vector Labs). Sektioner blev inkuberet med primære antistoffer for Ki67 (fortyndet 1:50, Santa Cruz Biotechnology), CD31 (01:50, ABCAM), LC3B (1:500, ABCAM), og kløvet caspase 3 (1:200, Cell Signaling) på 4 ° C natten over. Objektglas blev skyllet med PBS og inkuberet med sekundært antistof ifølge leverandørens instruktioner. Color er udviklet ved hjælp DAB (Vector Labs) og modfarvet med hæmatoxylin QS (Vector Labs) at farve kerner som tidligere beskrevet [28].

Statistisk analyse

Værdier blev udtrykt som middel ± SD. P-værdier blev bestemt ved ANOVA-analyse efterfulgt af Student-Newman-Keuls test for multiple sammenligninger.

Resultater

WFA synergistisk antitumorvirkningen af ​​doxorubicin

Dox anvendes typisk på 5 uM til at efterligne den koncentration, der findes i plasma fra patienter, der gennemgår Dox behandling [29]. Men ved denne dosis, patienter til stede med alvorlige bivirkninger siden en koncentration på 1 uM er nødvendig for at opretholde forskellige mekanismer af handlinger Dox [29]. For at minimere eller eliminere disse bivirkninger, udforskede vi muligheden for at anvende en Dox /WFA kombinationsbehandling. Æggestokkene cancercellelinier A2780 og CaOV3 og en cisplatin-resistente cellelinje A2780 /CP70 blev behandlet med forskellige koncentrationer af Dox og WFA både alene og i kombination. Dox /WFA kombination inhiberede celleproliferation af alle tre cellelinjer på en dosis- og tidsafhængig måde. Når Dox og WFA blev anvendt alene, IC

50 værdier for A2780-celler efter 48 timers behandling var 0,8 uM og 4,1 uM (fig. 1A-B). Når celler blev co-behandlet med en kombination af Dox med 1,5 uM WFA, IC

50 værdi for Dox faldt til 0,16 uM (fig. 1a). Ligeledes når 200 nM Dox blev kombineret med WFA, IC

50 værdi for WFA faldt til 1,5 uM (fig. 1B). Celler ved samtidig behandlet med 200 nM af Dox og 2,0 uM af WFA resulterede hos 90 til 95% celledød (fig. 1B), hvorimod behandling af celler med Dox alene (200 nM) og WFA alene (2,0 uM) resulterede i 9 % og 20% ​​hæmning hhv. For A2780 /CP70 celler, IC

50 værdier for Dox og WFA var 0,65 uM og 6 uM hhv. Kombinere Dox med 1,5 uM WFA reduceret IC

50 værdi Dox til 0,18 uM, og kombination WFA med 200 nM Dox reduceret IC

50 værdi til 1,2 pM (Fig. 1C-D). Caov3 celler var mere følsomme over for behandling med Dox og WFA alene eller en kombination af Dox /WFA (resultater ikke vist). IC

50 værdier er opsummeret i tabel 1. Disse resultater antyder, at Dox /WFA kombination fungerer på en synergistisk måde til at mediere antitumoraktivitet. Celleproliferation data efter 24 timer og 72 timer af behandlingen er vist i fig. S1 og S2.

A2780 og A2780 /CP-celler blev udpladet i plader med 96 brønde. Efter 24 timers udpladning blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af Dox og WFA, både alene eller i kombination. Efter 48 timers behandling blev cellelevedygtighed analyseret under anvendelse MTT-assays. De viste værdier er gennemsnit ± SD af fire uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med kontrol, # p 0,05 sammenlignet med Dox eller WFA alene. (E) Isobologram analyse af A2780-celler (n = 4) og (F) A2780 /CP70 (n = 4) ved anvendelse 7 doser Dox og WFA holdt ved et konstant forhold og celledød blev analyseret ved MTT-assays. Resultaterne blev analyseret med CalcuSyn software.

For at bekræfte, at effekten af ​​kombinationen af ​​WFA med Dox var synergistisk, vi udførte isobologram analyse. Både A2780 og A2780 /CP70 celler blev behandlet med 7 koncentrationer af Dox og WFA i et konstant forhold i 48 timer og celleproliferation blev analyseret ved MTT-assays. CalcuSyn software blev anvendt til at generere isobologrammer, hvilket viser, at Dox og WFA virker synergistisk (fig. 1 E-F) for begge cellelinier.

For at bestemme om apoptose var årsag til celledød, udførte vi Annexin V FITC flowcytometri i A2780 celler behandlet med Dox og WFA både alene eller i kombination. Analyse af Dox, WFA, og Dox med WFA behandlede prøver viste en ikke-signifikant stigning i forhold kontrol for Annexin V (fig. S3). For at bekræfte vores teknik blev positive kontrolprøver fremstillet under anvendelse af UV eksponering i 30 sekunder og analysere celler 4 timer, 6 timer og 24 timer efter eksponering for at sikre effektiv farvning (Fig. S4). Derudover undersøgte vi iboende apoptotiske proteiner phospho-BAD

136 (pBAD

136) og Bd-XL. Vi fandt ingen signifikante ændringer i pBAD

136 eller Bd-XL (Fig. S5), hvilket indikerer, at en alternativ vej til iboende apoptose bliver brugt til at inducere celledød.

Dox og WFA Produce ROS til at fremkalde celledød

Dox er kendt for at producere ROS som en del af dens mekanismer [4], [5]. Der har også været mange rapporter om WFA genererer ROS produktion som en del af sine apoptotiske mekanismer i forskellige cancertyper [12], [17], [18], [30]. Derfor har vi spurgt, om WFA kunne øge virkningen af ​​lav koncentration af Dox efter 24 timers behandling, vi brugte H

2DCFDA at bestemme generation af ROS. H

2DCFDA er en stabil ikke-polær forbindelse, som let diffunderer ind i cellerne. Denne forbindelse hydrolyseres derefter af intracellulære esteraser til dannelse DCFH, som igen oxideres med hydrogenperoxid til opnåelse af stærkt fluorescerende forbindelse 2’7′-dichlorofluorescein (DCF). Efter 6 timers behandling med WFA 1,5 uM signifikant forøget ROS-positive celler fra 2% til 17% i forhold til kontrolceller (resultater ikke vist). Efter 24 timers behandling viste Dox 200 nM et lavt antal ROS-positive celler, 18% (fig. 2A-B). Mens WFA 0,5 uM (23%) ikke var signifikant forskellig fra Dox, kombination af Dox 200 nM med WFA 0,5 uM resulterede i en signifikant stigning til 37%. Denne virkning var betydeligt større med en kombination af Dox 200 nM med WFA 1,5 uM, stigende til 90% ROS positive celler (fig. 2A-B). Behandling med WFA 2 uM beskadigede cellerne for meget til at producere ROS, hvilket indikerer, at effekten af ​​WFA på ROS produktion er dosisafhængig og ved kombination med Dox fremkalder en synergistisk effekt.

For at bekræfte, at ROS er ansvarlige for vores observerede celledød, vi co-behandlet A2780 celler med ROS ådselæder N-acetyl-L-cystein (NAC, 5 mM) eller med enzymatiske antioxidanter superoxiddismutase (SOD) og katalase sammen med Dox og WFA behandlinger for 24 og 48 timer som beskrevet ovenfor. Mens NAC var ineffektiv til at blokere celledød induceret af Dox efter 24 timer, det billede moderat beskyttelse efter 48 timers behandling (fig. 3A) bestemt ved MTT-assays. NAC var meget effektiv til at blokere celledød induceret af WFA efter 24 timer og fortsatte med at yde beskyttelse efter 48 h inkubation (fig. 3C). NAC var også effektive til at blokere Dox /WFA kombinationsbehandlingen (fig. 3B-D). For at skelne mellem den store form af ROS produceret af Dox og WFA behandling, vi behandlede cellerne med enzymatiske antioxidanter katalase 500 U /ml eller SOD 100 U /ml. Det er blevet rapporteret, at katalase ofte bruges af celler til at nedbryde hydrogenperoxid [31], mens SOD specifikt katalyserer superoxidanioner [32]. Efter 48 timers behandling, SOD signifikant blokeret celledød induceret af Dox og WFA alene og i kombination (fig. 4). Svarende til SOD, viste katalase beskyttelse af celledød ved Dox og WFA både alene eller en kombination af WFA /Dox (resultater ikke vist), hvilket indikerer, at superoxidanioner er de store ROS arter produceret af Dox og WFA.

A2780 celler blev udpladet i glasbund retter. Efter 24 timers udpladning blev cellerne behandlet med Dox og WFA, både alene eller en kombination af WFA /DOX som beskrevet i figur 1. Efter 24 timers behandling blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende H

2DCFDA og inkuberet i 30 min. Celler blev skyllet med PBS og undersøges under konfokalt mikroskop. (A) ROS positive celler (grøn farve) blev talt baseret på 3 lav effekt felter. Middelværdi ± standardafvigelse. P-værdier blev bestemt ved ANOVA-analyse efterfulgt af Student-Newman-Keuls test for multiple sammenligninger. * P 0,05 fra kontrol, $ P 0,05 sammenlignet med Dox, P 0,05 sammenlignet med WFA. (B) Konfokal mikroskopi analyse af celler, indikerer generation af ROS (grøn farve).

A2780 celler blev co-behandlet med NAC og Dox, WFA eller en kombination af WFA /WFA i 48 timer. Celleproliferation blev bestemt ved anvendelse MTT-assays. De viste værdier er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. P 0,05 sammenlignet med kontrol, # P 0,05 sammenlignet med ingen NAC og NAC

Cell proliferation blev bestemt ved anvendelse af MTT-assays.. De viste værdier er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med kontrol, # P. 0,05 sammenlignet med ingen SOD og SOD

Som ROS forårsager DNA-skader, udførte vi TUNEL-assay til at visualisere omfanget af DNA-skader, når de behandles med Dox og WFA alene eller i kombination. Efter 24 timers behandling, Dox 200 nM resulterede i DNA-skader i få celler, mens WFA 1,5 uM alene let øget antal beskadigede celler (fig. 5). Men behandling med Dox 200 nM og WFA 1,5 uM kombination resulterede i en forbedret virkning til at inducere DNA-beskadigelse. Næsten hver celle viste DNA-skader (fig. 5).

A2780 celler blev behandlet med Dox, WFA både alene eller en kombination af WFA /Dox. Efter 24 timers behandling blev DNA beskadigelse analyseret under anvendelse TUNNEL assays. Billeder blev opnået ved anvendelse af konfokal mikroskopi ved 20X forstørrelse.

Kombination af Dox og WFA celledød ved autofagi

Forskellige anticancer kemoterapier herunder Dox er blevet vist at inducere autofagi, som samvirker med apoptose at inducere celledød [33] – [38] som et middel til at eliminere beskadigede organeller, der kan producere et højt niveau af ROS og dermed begrænse kromosomal ustabilitet [39]. Derfor undersøger rolle kemoterapi agent Dox kombineret med WFA i autofagi er en allé af interesse. Elektronmikroskopi analyse af kontrol- celler behandlet med DMSO viste tilstedeværelsen af ​​mitokondrier og en intakt nuklear konvolut (fig. 6). Mens WFA 0,5 uM alene havde ringe eller ingen effekt, WFA 1,5 og 2 uM viste nogle autophagosomes som indikator for autophagy, men forlod mitokondrierne intakte, eventuelt som en tilpasning mekanisme. Celler, når de behandles med Dox 200 nM alene viste dannelse af autophagosomes indeholder cytoplasma og destruktion af mitokondrier. Behandling af celler med Dox /WFA kombination resulterede i en forbedret virkning på en dosis-afhængig måde. Dox 200 nm plus WFA 2 uM viste intense autophagic vakuoler sammen med kollaps af den nukleare indhylle, membran disintegration, og fravær af mitokondrier (fig. 6), hvilket indikerer intens celleskader ved behandling med Dox /WFA kombination.

A2780 celler blev behandlet med Dox og WFA, både alene eller en kombination af WFA /Dox. Efter 24 timers behandling blev celler skyllet med PBS, fikseret og behandlet til TEM-analyse. Electron mikroskopiske billeder på 5,600X forstørrelse vises.

For at bekræfte induktion af autophagy ved behandling af celler med Dox /WFA kombination, bestemt vi udtryk for den kanoniske markør for autophagosome dannelse, mikrotubuli-associeret protein-1 lette kæde 3B (LC3B) [38]. Western blot-analyse af cellerne viste to specifikke bånd: et øvre bånd (18 kDa), der repræsenterer LC3B-I og et nedre bånd (16 kDa) svarende til LC3B-II (fig. 7). Cytosolisk LC3B-I omdannes til LC3B-II gennem lipidering og tillader LC3B-II kan blive forbundet med autophagic vesikler. Behandling med Dox-induceret produktion af LC3B-II (fig. 7), mens WFA alene stimulerede produktionen af ​​præ-markøren LC3B-I samt LC3B-II (fig. 7). Kombinationsbehandling forbedret LC3B-II på en dosis-afhængig måde med Dox 200 nM med WFA 2 pM viser den højeste ekspression (fig. 7). At afgøre, om autofagi var en tilpasning respons eller en mekanisme for celledød, undersøgte vi spaltet caspase 3 som en markør for celledød. Western blot analyse viste en beskeden stigning i celle behandlet med Dox 200 nM. I modsætning hertil WFA 0.5 uM viste ingen tegn på celledød, mens WFA 1,5 og 2 uM viste en stigning i niveauet af spaltede caspase 3. Behandling af celler med Dox /WFA kombination viste en yderligere forøgelse af celledød i en dosis- afhængig måde (fig. 7), hvilket indikerer, at autofagi fremmer celledød snarere end inducere en tilpasning mekanisme til fremme celleoverlevelse med Dox /WFA kombinationsbehandling.

Efter 24 timers behandling blev cellerne vasket med PBS og lyseres. Western blot analyse blev udført for LC3B, caspase 3 og GAPDH proteiner.

Effekt af Dox og WFA på 3D tumorer in vitro

Ud over at analysere hæmning af tumorcellevækst, vi evalueret virkningerne af Dox og WFA både alene eller WFA /Dox kombination til deres anti-tumor effekt ved anvendelse af en 3D mini-tumormodel, der emulerer

in vivo

-lignende flercellet tumorvækst og biologi. Levedygtige mini-tumorer (1 mm

3 størrelse) af A2780 ovariecancerceller blev genereret ved hjælp af en 3D menneskelig Biogel kultur-system (HuBiogel®, Vivo Biosciences Inc.). Hubiogel® har vist sig at repræsentere den humane matrix mere nøjagtigt end Matrigel for at forudsige prækliniske endpoints [40]. Mini-tumorer blev behandlet med 1) Dox 0.2 uM, 2) Dox 2.0 uM, 3) WFA 0,5 uM, 4) WFA 2,0 pM, 5) Dox 0.2 uM med WFA 0,5 uM, og 6) Dox 0.2 uM med WFA 2 uM . Målinger af tumorvækst blev udført på dag 1, 3 og 7 under anvendelse af MTT-assays og fluorescensmikroskopi. Medium og DMSO behandlede tumorer fortsatte med at vokse hele behandlingen, mens Dox 0,2 uM havde deres vækst standset på dag 7 (Fig. 8A). DOX 2,0 uM alene og WFA 2,0 uM alene behandlede tumorer viste nedsat vækst og denne hæmmende effekt blev forstærket ved behandling med Dox 0,2 pM plus WFA 2,0 pM (Fig. 8A). Kombination af Dox 0,2 uM med WFA 0,5 uM opnået en drastisk forbedret effekt i forhold til enten forbindelsen alene (Fig. 8A). Mikroskopi-analyse af tumorer efter dag 3 og 7 er vist i fig. 8B og 8C henholdsvis indikerer synergieffekt af Dox og WFA kombination på undertrykkelse af tumorvækst.

(A) A2780 Celler blev kombineret med Hubiogel® i et 01:04 forhold og vokset fra 10 pi perler. Tumorer blev behandlet med Dox og WFA, både alene eller en kombination af WFA /Dox. Tumorer blev behandlet to gange /uge ved at erstatte mediet med medium indeholdende frisk middel. Tumorvækst blev målt ved anvendelse MTT-assays efter dag 3 eller 7 af behandlingen. (B-C) Tumorer efter behandling blev inkuberet med calcein AM i 30 minutter, og billeder blev taget ved hjælp fluorescensmikroskop efter 3 dages behandling (B) eller 7 dages behandling (C).

effekt af Dox og WFA på xenograft tumor Growth

for at undersøge effekten af ​​Dox og WFA alene eller i kombination på tumorvækst

in vivo

blev mus tumorxenoplantater udviklet ved at indsprøjte A2780 celler (2 × 10

6) subkutant bilateralt i den ventrale flanke af 5-6 uger gamle nu /nu-mus. Tumorer fik lov til at vokse, indtil de nåede 100 mm

3 i størrelse. På dag 20 post-celle injektion blev mus randomiseret i 6 grupper med hver 5 mus og behandles med forskellige midler: 1) negativ kontrol (PBS), 2) vehikelkontrol (10% DMSO og 90% glyceryl trioctanoate), 3) Dox 9 mg /kg, 4) Dox 1 mg /kg, 5) WFA 2 mg /kg, og 6) Dox 1 mg /kg med WFA 2 mg /kg som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Tumorer blev målt hver anden dag og mus blev administreret med 100 pi i.p. volumen i 12 dage for en samlet periode på 32 dage. Mus, der modtog Dox 9 mg /kg viste sig at være meget syge med et tab af appetit resulterer i vægttab, efter den første behandling og efterfølgende døde efter 4 behandlinger. Mus i de andre grupper syntes at være sund uden tab af appetit eller vægt under hele behandlingsperioden. Tumorvolumenet var ikke signifikant forskellig mellem køretøj, Dox 1 mg /kg og WFA 2 mg /kg grupper. Imidlertid mus, som modtog Dox 1 mg /kg med WFA 2 mg /kg (gruppe 6) viste en meget signifikant (70 til 80%) reduktion i tumorvækst (fig. 9A). Tilsvarende tumorvægt målt på dag 32 indsamlet på tidspunktet for at ofre dyrene udviste en drastisk reduktion af Dox 1 mg /kg med WFA 2 mg /kg-gruppen (fig. 9B) i forhold til andre grupper, hvilket indikerer, at kombinationen af ​​WFA med Dox fremkalder en synergistisk effekt på tumor undertrykkelse af tumorvækst

in vivo

.

(a) tumorer vækst blev målt fra dag 20-32 (post-celle injektion) og behandles hver anden dag * P 0,05.