PLoS ONE: En stigning i Reactive Oxygen Species ved Deregulering af Arnt Forbedrer kemoterapeutisk lægemiddel-induceret Cancer Cell Death

Abstrakt

Baggrund

Unikke kendetegn ved tumor mikromiljøer kan anvendes som mål for kræft terapi. Aryl carbonhydrid receptor nuklear translokatoren (Arnt) er en vigtig mediator af tumorudvikling. Men fortsat uklart, den funktionelle rolle af Arnt i kemoterapeutisk lægemiddel-behandlet kræft.

Metodologi /vigtigste resultater

Her fandt vi, at knockdown af Arnt i cancerceller reduceret spredning sats og transformationen evne af disse celler. Desuden blev cisplatin-induceret celle apoptose forøget i Arnt-deficiente celler. Ekspression af Arnt faldt også i nærvær af cisplatin gennem proteasomalaktivitet nedbrydningsvej. Imidlertid blev ARNT niveau opretholdes i cisplatin-behandlede lægemiddelresistente celler, som forhindrede celle fra apoptose. Interessant, reaktive ilt arter (ROS) dramatisk forøget, da Arnt blev slået ned i kræftceller, øge cisplatin-induceret apoptose. ROS fremmes celledød blev inhiberet i celler behandlet med ROS scavenger, N-acetyl-cystein (NAC).

Konklusioner /Signifikans

Disse resultater antydede, at anticancer aktivitet af cisplatin skyldes dets induktion af produktionen af ​​ROS af Arnt nedbrydning. Målretning ARNT kunne være en potentiel strategi for afskaffelse lægemiddelresistens i cancerceller

Henvisning:. Shieh J-M, Shen C-J, Chang W-C, Cheng H-C, Chan Y-Y, Huang W-C, et al. (2014) En stigning i Reactive Oxygen Species ved Deregulering af Arnt Forbedrer kemoterapeutisk lægemiddel-induceret celledød. PLoS ONE 9 (6): e99242. doi: 10,1371 /journal.pone.0099242

Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei Medicin University, Taiwan

Modtaget: Februar 17, 2014 Accepteret: 13. maj 2014 Udgivet: 12 Jun 2014

Copyright: © 2014 Shieh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud NSC 102-2628-B-006-011-MY3 fra National Science Rådet for Kina. Denne forskning blev delvist understøttet af hovedkvarteret for University Advancement på National Cheng Kung University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

aryl hydrocarbon receptor nuklear translokatoren (Arnt), også kendt som hypoxi-inducerbare faktor (HIF) -1β, er en transkriptionsfaktor, der hører til den grundlæggende helix-loop-helix Per-Arnt-Sim (bHLH -Pas) familie, såsom endotel PAS domæne protein 1 (EPAS1), HIF-1α, og aryl hydrocarbon receptor (AhR) [1] – [3]. Den ARNT danner en heterodimer med HIF-1α som reaktion på varierende iltindholdet af mikromiljøer, og yderligere fremmer celleoverlevelse og angiogenese [4] – [6]. Hertil kommer, afbrydelse af Arnt i muse embryonale stamceller forårsager hypoglykæmi, en angiogenese mangel og en manglende reaktion på hypoxi [7]. Desuden Arnt er en mediator i normoksiske betingelser, når cellerne står skadelige faktorer i mikromiljøet, såsom 2,3,7,8-tetra-chlordibenzo [b, e] [1], [4] -dioxin (TCDD) eller anti -cancer narkotika [8], [9]. Den ARNT dimeriserer med aryl hydrocarbon receptor (AhR) og regulerer Sp1 transkription aktivitet, efter opregulering af promotoren for cytochrom P450-underfamilien polypeptid 1 (CYP1A1) til at modstå xenobiotiske belastninger, fx TCDD [3]. Når regulering af Arnt i celler, kan det stabiliseres gennem interaktion med BRCA1 proteinet under TCDD stress [10]. På den anden side, at aktive caspase-3 spalter Arnt under apoptose reducere celleoverlevelsessignaler [11]. Tab af HIF-1α og Arnt fører også til en øget respons på strålebehandling, en reduktion i tumorvækst, og fald i angiogenese i tumorer transplanteret ind immun-deficiente mus [12]. I vores tidligere undersøgelser fandt vi, at ARNT interageret med c-Jun til dannelse c-Jun /Arnt og c-Jun /Arnt /Sp1 komplekser, der fremmer udtryk for cyclooxygenase (COX) -2, 12 (S) -lipoxygenase, og p21

WAF1 /CIP1

, i epidermal vækstfaktor (EGF) -behandlede cervikale cancerceller i et normoxisk tilstand [1], [13]. Disse undersøgelser indikerede, at ARNT interagerer med HIF-1α som reaktion på hypoxiske betingelser og også binder med specifikke transkriptionsfaktorer, som har evnen til at udløse signalering af tumorigenese i en normoxisk tilstand.

Cisplatin er en stor kemoterapeutisk lægemiddel anvendt med mange former for kræft, især testikel-, ovarie-, esophageal, hals-, gastrisk, prostata og ikke-småcellet lungecancer [14]. Efter indstrømning i en celle, cisplatin hydrolyseres og bliver dets aktive form. Tværbinding af DNA-strenge sker ved aktiv cisplatin binding til DNA på position 7 af guanin, som forårsager celledød [15], [16]. Ud over at forårsage apoptose ved at inducere cytochrom c-frigivelse som reaktion på DNA-stress, cisplatin inducerer også celle apoptose forårsaget af reaktive oxygenforbindelser (ROS) gennem en p53-medieret p38a mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway i HCT1116 tyktarmscancerceller [ ,,,0],17]. ROS er konstant genereres og elimineret under normal fysiologisk og biologisk funktion [18]. Under oxidant stress, såsom hypoxi eller xenobiotikum stimulation, kan ROS elimineres ved scavenging proteiner, såsom superoxid dismutases (Sods) og glutathionperoxidase. Cancerceller udviser større tolerance af ROS, end normale celler. Et lavt niveau af ROS letter cancerceller køre cellevækst-associerede gener, men en højere produktion af ROS også forårsager celler til at undergå apoptose [19]. Men kræftceller tilpasse sig skader fra cisplatin ved opregulering effluxtransportører, såsom ATP-bindende kassette (ABC) transporter. Multilægemiddelresistens 1 (MDR1) er et medlem af lægemiddel efflux ABC transportører, som pumper anticancerlægemidler ydersiden af ​​membranen [20]. Desuden overekspression af MDR1 tillader humane KB carcinomceller til effektivt at modstå colchicin, vinblastin og doxorubicin [21]. Anti-cancer medicin forårsage kræftceller til at erhverve modstand gennem overekspression af resistente gener. Derfor forstå den molekylære mekanisme er involveret i reguleringen af ​​erhvervelse af resistens i kræftceller vil være til gavn for effektiv behandling.

I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at Arnt interageret med Sp1 at regulere MDR1 udtryk og beskyttede celler fra cisplatin -induceret apoptose [9]. Den ARNT-reguleret udstrømning af lægemidler blev også observeret i MDR1-opreguleret cancerceller. Disse resultater viser, at Arnt er en af ​​tilsynsmyndighederne at opretholde overlevelse kræftceller under cisplatin behandling. For yderligere at forfølge potentielle rolle Arnt i at opretholde celle overlevelse, blev virkningen af ​​Arnt niveau på kemoterapeutisk effektivitet undersøgt i forskellige kræfttyper. I denne undersøgelse fandt vi, at deregulering af Arnt ikke kun reduceret cellelevedygtighed, men fremmes cisplatin-induceret celledød ved at øge produktionen af ​​ROS. Disse resultater viste, at Arnt samtidig kunne regulere MDR1 udtryk og reducere ROS plan for at beskytte kræftceller fra lægemiddel-induceret apoptose.

Resultater

Den Arnt regulerer kræft celledeling

at præcisere, at ARNT er essentiel for tumorcellevækst under normoxiske betingelser blev celleproliferation bestemt ved en BrdU inkorporering assay under en ARNT-knockdown tilstand. Som vist i fig. 1A, celleproliferationen var signifikant reduceret i siARNT celler. Resultater fra puls-mærkning af BrdU (20 min) og synkronisering af celler ved thymidin blok viste at siARNT reduceret DNA-syntese (fig. 1B) og tilbageholdes cellerne i S-fase progression af cellecyklussen (Fig. S1), hhv. Disse resultater antydede, at ARNT regulerer celleproliferation eventuelt gennem styring af S-fase progression i normoxi.

(A) HeLa-celler blev transficeret med 30 nM Arnt siRNA oligonukleotider og kapløbet oligonukleotider (SC) ved lipofektion. BrdU-inkorporering assay blev udført som beskrevet i Materialer og metoder. Fejlsøjler angiver middelværdien + SD (n = 3). Statistisk signifikans (*** P 0,001; ** P 0,01) mellem kontrol og siARNT oligonucleatides-behandlede celler blev analyseret ved Students

t

test. (B) HeLa-celler blev transficeret med 30 nM Arnt siRNA oligonukleotider og kapløbet oligonukleotider (SC) ved lipofektion og mærket med 20 nM BrdU i 20 minutter eller 24 timer. Celler blev fikseret og farvet med anti-BrdU-antistoffer efterfulgt af anti-muse FITC og DAPI. Procentdelen af ​​cancerceller med positiv nukleare og BrdU-farvning blev beregnet ved at tælle immunpositive celler i fire tilfældigt valgt. Fejlsøjler angiver middelværdien + SD (n = 4). Statistisk signifikans (*** P 0,001; ** P 0,01) mellem kontrol- og siARNT oligonucleatides-behandlede celler blev analyseret ved Students

t

test

Knockdown af Arnt hæmmer. transformation celle

Baseret på resultaterne, der arnt udtryk øger spredningen af ​​kræftceller, blev effekten af ​​Arnt på celledeling yderligere bekræftet ved hjælp af en koloni formation assay. Som vist i fig. 2A, selv om størrelsen ikke var i overensstemmelse med forældrenes celler, antallet af koloni faldt mere åbenlyst i Arnt-defekte celler. Den nedsatte proliferationshastighed blev også observeret i Arnt manglende celler (fig. S2). Interessant fandt vi, at væksten af ​​shARNT celler blev inhiberet under 3D-kultur tilstand (fig. 2B), men ikke i 2D-dyrkningsbetingelser (Fig. 2A). Disse resultater indikerede, at depletering af Arnt reduceret evne cellulær transformation ved cancerceller.

(A) under en normoxisk tilstand, A375 parentale celler (P), shLacZ celler (Z), og Arnt-lyddæmpede celler ( shARNT # 1 og # 2) blev inkuberet i frisk dyrkningsmedium i normoxisk tilstand. Efter 7 dage blev cellerne fikseret og farvet med Giemsa farve. Forsøget blev udført ved kolonidannelse assayet. (B) Nedbrydningen af ​​Arnt hæmmer cellulær transformation i kræftceller. Celler blev podet i det øverste lag af agarmedium. Efter inkubation i 3 uger med suppleret medium blev celler fikseret og farvet med Giemsa. Forsøget blev udført ved blød agar-assay. Lignende resultater opnåedes i tre uafhængige forsøg.

ARNT-knockdown fører lægemiddelresistente celler til at være mere følsomme over for cisplatin

Blandt kemoterapeutiske lægemidler, cisplatin inducerer celledød ved at danne cisplatin DNA addukter, der fører til DNA-beskadigelse og forringer progression af S-fasen. Muligheden for, at Arnt styrer celledeling gennem regulering af S-fasen progression fik os til at undersøge, om det producerede nogen virkning på cisplatin-induceret celledød. For at tydeliggøre betydningen af ​​Arnt i regulering cisplatin resistens, anvendte vi et par celler, HONE-1 og skærpe-1-C15 (HONE-1 cisplatin-resistente celler). Stabil Arnt Knockdown cellelinier blev dannet ved stabilt transficere HONE-1 og HONE-1-C15-cellelinier med shARNT vektoren (fig. S3). Som vist i fig. 3, cisplatin-induceret apoptose var mere markant i shARNT celler end i parentale HONE-1-celler. Desuden cisplatin forårsagede mindre celledød i Hone-1-C15-celler end i HONE-1-celler, selv med høj koncentration behandling. Men HONE-1-C15 celler mistet deres modstand evne i en Arnt-knockdown tilstand (fig. 3). Under cisplatin behandling, den ARNT var også nedbrudt i parentale Hone-1 celler, men ikke hos resistente HONE-1-C15-celler (fig. 4). Cisplatin fremmet mere caspase-3 aktivering i HONE-1-celler, men ikke i Hone-1-C15-celler, selv når en højere koncentration af cisplatin blev påført Hone-1-C15-celler (Fig. 4). Men begge HONE-1 og HONE-1-C15-celler blev mere følsom over for cisplatin, når ARNT var mangelfuld (fig. 4). Disse resultater bekræftede, at ekspression af Arnt er en væsentlig faktor, der regulerer lægemiddelresistens ved cancerceller.

høne-1 shLacZ celler (Z), Hone-1 ARNT-deficiente celler (shARNT), HONE-1-C15 shLacZ celler (Z), og skærpe-1-C15 ARNT-deficiente celler (shARNT) blev behandlet med eller uden cisplatin (20 uM cisplatin for HONE-1 shLacZ celler og HONE-1 ARNT-deficiente celler, 80 og 100 uM cisplatin for HONE -1-C15 shLacZ celler og HONE-1-C15 ARNT-deficiente celler) i 24 timer. Apoptotiske celler blev undersøgt ved farvning med annexin V-FITC /propidiumiodid (PI), og flowcytometri blev anvendt til at analysere celle apoptose. Den apoptotiske blev beregnet. * Sen apoptose; # Tidlig apoptose. Lignende resultater opnåedes i tre uafhængige forsøg.

høne-1 celler blev transficeret med 50 nM siARNT eller 50 nM stealth RNAi negativ kontrol (SC) i 24 timer og behandlet med eller uden cisplatin (60 uM for HONE-1-celler og 80 pM for HONE-1-C15-celler) i frisk dyrkningsmedium i 24 timer. Totalt protein (herunder levende celler og døde celler) blev ekstraheret, analyseret med Western blotting og detekteret med Arnt, caspase-3, og a-tubulin-antistoffer. Lignende resultater blev opnået i tre uafhængige forsøg.

Kemoterapeutiske lægemidler inducerer Arnt nedbrydning og celle apoptose

For at tydeliggøre involveret i nedregulering af Arnt i cisplatin-behandlede følsomme celler mekanisme, udtryk for Arnt blev undersøgt yderligere i forskellige cancer cellelinjer. Som vist i fig. 5A, cisplatin produceret ingen effekt på det transkriptionelle niveau af Arnt messenger (m) RNA. Imidlertid blev cisplatin-induceret ARNT deregulering vendt i celler behandlet med en proteasominhibitor (fig. 5B). Disse resultater viste, at cisplatin udløste ARNT nedbrydning gennem proteasom-afhængige veje i følsomme celler. Interessant nok kunne cisplatin-induceret ARNT deregulering også vendes, når forskellige typer af cancerceller blev forbehandlet med ROS scavenger NAC (fig. S4). Disse resultater viste, at produktion af ROS, mindst er én af årsagerne til at eliminere ARNT i cisplatin-behandlede cancerceller. For yderligere at undersøge, om deregulering af Arnt også er påkrævet for andre kemoterapeutiske lægemidler, såsom taxol og doxorubicin at inducere celledød, blev HeLa og HeLa cisplatin-resistente (HeLa R) celler behandlet med disse lægemidler, og udtryk for Arnt og fragmenteret DNA blev undersøgt . Doxorubicin og taxol hæmmede Arnt udtryk og steg i fragmenteret DNA i HeLa-celler (Fig 5C . 5D). Imidlertid ekspression af Arnt blev ikke ændret i HeLa R-celler efter behandling med taxol eller doxorubicin (fig. 5C), og disse resultater var i overensstemmelse med manglen på fragmenteret DNA observeret i HeLa R-celler (fig. 5D). Desuden shARNT cellelinier var også mere følsomme over for cisplatin-induceret celledød (fig. 3). Disse resultater antydede, at Arnt spiller en central rolle i at bidrage til modstanden ved kræftceller til forskellige kemoterapeutiske stoffer. Vi fandt også, caspaseinhibitoren, zVAD, blokerede ekspressionen af ​​p53 og aktivering af caspase-3 i cisplatin-behandlede celler (fig. 5e). Interessant nok blev cisplatin-induceret deregulering af Arnt restaureret i zVAD behandlede følsomme HeLa-celler (fig. 5E). Desuden blev cisplatin-induceret caspase-3-aktivering, udtømning af Arnt, og en stigning af p53 vendt i celler forbehandlet med NAC (Fig. S4). Disse resultater indikerede, at cisplatin-induceret aktivering af caspase-3-medieret ekspression af Arnt og p53. ZVAD blokeret caspase-3 og reddede ARNT ekspression i cisplatin-behandlede sensitive celler, hvilket antyder, at caspase-3-aktivering er essentiel for cisplatin-induceret celledød i sensitive celler.

(A) HeLa-celler blev behandlet med cisplatin for 24 timer. Totalt RNA blev ekstraheret til revers-transkription PCR med Arnt og GAPDH-primere. (B) HeLa-celler blev behandlet med 10 pM MG132 eller 1 uM lactacystin i 4 timer efterfulgt af cisplatin i 36 timer. Ekspression af Arnt og actin blev analyseret ved Western blotting-analyse under anvendelse af anti-Arnt og anti-actin-antistoffer. (C) HeLa og HeLaR celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af taxol og doxorubicin i 24 timer. Expressions of Arnt og actin blev detekteret ved Western blotting-analyse under anvendelse af anti-Arnt og anti-actin-antistoffer. (D) Efter 30 uM cisplatin behandling af HeLa og HeLa R celler blev apoptotiske DNA-fragmentering bestemmes som beskrevet i “Materialer og metoder”. (E) Celler blev transficeret med 30 nM Arnt siRNA oligonukleotider og scrambled oligonukleotider (SC) ved lipofektion. Efter 30 pM zVAD behandling i 30 minutter efterfulgt af 30 uM cisplatin i 36 timer blev lysater af celler fremstillet og underkastet SDS-PAGE og analyseret ved Western blotting med antistoffer mod Arnt, procaspase-3, caspase-3, p53, og actin . Lignende resultater opnåedes i tre uafhængige forsøg.

Stigningen i ROS i Arnt-knockdown celler bidrager til cisplatin-induceret apoptose

Udover at deregulere effluxpumper, en stigning i ROS niveau er en anden måde for kemoterapeutiske lægemidler til at fremkalde apoptose. Som vist i fig. S4, udtømning af ROS dramatisk inhiberede cisplatin-induceret celle apoptose. For yderligere at klarlægge den mekanisme er involveret i Arnt-regulerede cisplatin modstand, blev rollen af ​​ROS i cisplatin-induceret celledød undersøgt. Først identificerede vi mængden af ​​ROS i forældrenes (P), shLacZ (Z), og shARNT celler. Interessant fandt vi, at ROS var naturligvis højere i Arnt-deficiente celler end i parentale celler under normoxiske betingelser (fig. 6 og fig. S5A). Stigningen af ​​ROS blev reduceret i shARNT celler behandlet med NAC (fig. S5A). Desuden blev cisplatin-forstærket ROS beløb elimineret i celler behandlet med NAC (fig. S5B). Cisplatin inducerede også højere produktion af ROS i shARNT celler (Fig. S5C), og mængden af ​​ROS blev reduceret i celler behandlet med NAC. Disse resultater antydede, at ekspressionen af ​​Arnt inhiberede cisplatin-forstærket ROS-produktion. For at afklare, om stigningen i ROS i shARNT celler spiller en rolle i cisplatin-induceret apoptose, blev NAC brugt til at udtømme ROS, og apoptose-forholdet blev analyseret. Som vist i fig. 7, NAC signifikant hæmmet cisplatin-induceret celledød i shARNT celler (Fig. 7). Disse resultater viste, at Arnt beskyttet kræftceller fra cisplatin-induceret apoptose, i det mindste ved at reducere ROS produktion i celler.

A375 forældrenes og shARNT celler blev inkuberet under en normoxisk tilstand natten over og farvet med carboxy-DCFDA at overvåge ROS produktion. FL1 fluorescens indikerede fluorescens værdien af ​​carboxy-2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (carboxy-DCFDA). Lignende resultater opnåedes i tre uafhængige forsøg.

Celler blev forbehandlet med 10-acetylcystein (NAC) i 1 time før A375 parentale celler (P), shLacZ celler (Z), og Arnt-lyddæmpede celler (shARNT # 1 og # 2) blev behandlet med 5 pM cisplatin, og derefter blev inkuberet i 24 timer. Apoptotiske celler blev undersøgt ved farvning med annexin V-FITC /propidiumiodid (PI), og flowcytometri blev anvendt til at analysere celle apoptose. Den apoptotiske blev beregnet. * Sen apoptose; # Tidlig apoptose. Lignende resultater blev opnået i tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Kræft terapeutiske applikationer, såsom radikal behandling kombineret med kemo-terapeutisk medicin medieret af induktion af ROS, er store måder at fjerne cancerceller [22]. Men kræftceller er i stand til modstand mod skader forårsaget af ROS-induceret apoptose gennem alternative antiapoptotiske veje, såsom Akt, Kras, BRAF, og Myc [23], [24]. I denne undersøgelse har vi vist, at ARNT tillagt en anti-apoptose evne på cancerceller behandlet med anti-cancer lægemiddel, cisplatin. Endvidere cisplatin producerede større ROS-generering i Arnt-knockdown celler, hvilket resulterer i forøgelse af celledød. Svarende til vores fund, Arnt beskyttet mod celleskader ved at reducere ROS-niveauer, leukæmiceller var følsomme for troglitazon, som også inducerer apoptose gennem intracellulær ROS [25]. Resistente leukæmiceller udviste en overflod af Arnt og også fulgt opregulering af SOD’er (SOD2), nuklear faktor erythroide 2-relateret faktor 2 (Nrf2) transskript, og intracellulær glutathion koncentration [25]. SOD2 reducerer antioxidanter og Nrf2 øger antioxidant enzymaktiviteter [25]. Desuden Nrf2 regulerer transskriptionen af ​​mir125b at inhibere AhR repressor (AhRR), som beskytter nyre fra akut skade [26]. Dette indikerer, at dannelsen af ​​AhR /Arnt komplekser kan reguleres ved mir125b [8]. Disse resultater tyder på, at Arnt kan regulere SOD2 udtryk eller Arnt /AhR kompleksdannelse at reducere celle skade forårsaget af øget ROS.

Med hensyn til regulering af Arnt, fandt vi, at cisplatin kan hæmme Arnt på nogle uopdagede måder. ARNT blev nedbrudt på en dosis-afhængig måde i ikke-resistente celler behandlet med cisplatin. ARNT halveringstid syntes at være vigtige for apoptose forårsaget af cisplatin. For eksempel proteasom inhibitorer, såsom MG132 og lactacystin, blokerede nedbrydningen af ​​Arnt forårsaget af cisplatin. viste imidlertid cisplatin-resistente cancercellelinier, at ARNT stabilitet ikke blev ændret under behandling med cisplatin. Disse cancerceller med konstante Arnt niveauer viste også en god evne til at forhindre evne af apoptose. Disse resultater svarede til en tidligere undersøgelse, hvor Arnt forstyrrelser var korreleret med proteasomalaktivitet nedbrydning via ubiquitinering proces [27]. I overensstemmelse med vores resultater, at Arnt blev forarmet af anti-cancer medicin, Arnt blev også nedbrudt af curcumin i normoxiske og hypoxiske forhold i forskellige cancer celletyper [27]. Endvidere kan ekspression af Arnt genoprettes ved behandling med NAC, et ROS scavenger, i nærvær af curcumin. Disse resultater er i overensstemmelse med vores resultater, at NAC reddet udtryk for Arnt i cisplatin-behandlede sensitive celler. Den Arnt kan også blive forstyrret hjælp H

2O

2 i cancerceller [27]. Foruden ROS og konsistent med det faktum, at caspase-3 og caspase-9 også spalte ARNT på Asp 151 aminosyre websted in vitro [11], fandt vi, at cisplatin-induceret nedbrydning af Arnt blev undertrykt efter behandling med caspaseinhibitoren zVAD. Således kan cisplatin-aktiverede caspaser forårsage deregulering af Arnt i narkotikarelaterede følsomme celler, men ikke i resistente celler. Kemoterapeutiske lægemidler, såsom taxol og doxorubicin kan også henholdsvis inducere cancercelle apoptose gennem caspase-10 og p53 pathways [28], [29]. I denne undersøgelse taxol og doxorubicin også forbedret Arnt nedbrydning, hvilket resulterer i apoptose af sensitive celler. Disse resultater viste, at Arnt er en væsentlig faktor i at beskytte kræftceller mod narkotika-induceret skade. En tidligere undersøgelse viste også, at spaltning af Arnt forstærkes af hypoxi induceret aktiv caspase, og dette nedreguleret transkriptionsaktivitet overlevelse gener induceret af HIF [27]. Produktion af ROS er en af ​​virkninger hvorigennem cisplatin forårsager celledød [17]. Det blev også rapporteret, at mir-24 induceret af ROS forårsager udtømning af Arnt i proteinniveau i humane hepatocellulært carcinom-cellelinier [30]. Tilsammen kunne ROS induceres ved udtømning af Arnt, og derefter frembringer negativ feedback regulering af Arnt ved induktion af mirRNA yderligere. For grunden til, forebyggelse af Arnt nedbrydning i den indledende behandling af narkotika er vigtig for overlevelsen af ​​kræftceller. Imidlertid, om den ROS-induceret mir-24 er årsag til undertrykkelse af Arnt i cisplatin-behandlede celler vil blive undersøgt i vores yderligere studier. Selv om der er involveret i opregulering af ROS niveau induceret ved udtømning af Arnt mekanisme ikke var klar og ville også blive undersøgt, vi spekuleret på, at undertrykkelsen af ​​Arnt kunne være en af ​​mekanismer, der er ansvarlige for at ændre niveauet af ROS i cisplatin-induceret celledød.

generelt ARNT kan interagere med HIF-1α at regulere gener involveret i at fremme angiogenese, interagere med c-Jun og Sp1 at modulere MDR1 udtryk eller regulere EGF-induceret ekspression af COX-2, 12 (S ) -lipoxygenase, og p21

WAF1 /CIP1

, der fornemmer ændringen af ​​microenvironmental komponent [1], [13]. Arnt spiller også afgørende rolle i reguleringen tumor progression, afgiftning, og udstrømning af anti-cancer medicin, som øger overlevelsen chance under ugunstige forhold [3], [8], [9], [24]. I kemoterapeutisk behandling af cancer, cisplatin akkumuleres i cancerceller, der forårsager DNA-skader og inducerer apoptose. Lægemidlet efflukspumpen, MDR1, opreguleres af Arnt at forhindre cisplatin-induceret apoptose [9]. Udover at regulere medikamentresistens i tidligere undersøgelse, Arnt beskytter også celler fra microenvironmental toksicitet. For eksempel, Ahr /Arnt kompleks sanser miljøgifte og regulerer veje er ansvarlige for afgiftning. F.eks TCDD inducerer mange gener medieres af AHR /ARNT kompleks, såsom cytochrom P450 1A1 (CYP1A1), som kan afgifte af polycykliske aromatiske forbindelser [8], [31]. I denne undersøgelse fandt vi, at Arnt spiller yderligere rolle i nedregulering af ROS til at forhindre kræftceller, der lider skade fra cisplatin behandling. Tilsammen har vi spekuleret på, at Arnt er en central mægler til at fjerne cytotoksicitet ophidset af miljømæssige faktorer.

Som konklusion, vores resultater viste, at udtømning af Arnt fremmet i effekten af ​​anti-cancer medicin på kræft celledød. I vores forståelse, der var mindst to mekanismer involveret i Arnt-forårsaget lægemiddelresistens: MDR1 opregulering [9] og forebyggelse af ROS produktion. Selv om den er involveret i reguleringen af ​​ROS produktion af Arnt udtryk mekanisme forbliver ukendt, kan udvikling af antagonister rettet mod Arnt give nye strategier for at ødelægge resistente kræftceller.

Materialer og metoder

Cellekulturer

cellelinjer af human malignt melanom (A375) og humant livmoderhalskræft (HeLa) blev indkøbt fra American Type Culture Collection. Humane nasopharyngeale carcinomaceller (HONE1 og skærpe-1-C15) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Jane-Yang Chang (National Health Research Institutes, Taiwan) [32]. A375 og HeLa cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) med 1% glucose (Gibco). Hone-1-celler og deres afledte cisplatin-resistente variant, HONE-1-C15, blev opretholdt i RPMI-medium 1640 (GIBCO). Alle cellelinier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone), 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich), og 100 U /ml penicillin (Sigma-Aldrich) i dyrkningsmedium og inkuberet med 5% CO

2 ved 37 ° C i vedligeholdelse. Cisplatin-resistente HONE-1-C15-celler blev holdt i medium indeholdende 15 uM cisplatin. De ARNT-deficiente A375 cellelinier var uafhængige stabile cellelinjer inficeret med lentiviral vektor-afledt ARNT lille hårnål (sh) RNA [9]. De ARNT-manglende HONE-1 og skærpe-1-C15 cellelinier blev stabile cellelinier inficeret med lentiviral vektor-afledt ARNT shRNA [9]. Lægemiddelresistens tidsplaner blev anvendt til udvikling af underlinjer resistente over for cisplatin [9]. HeLa-celler blev udsat for cisplatin for en 9-måneders periode. Modstanden sublinie opnået ved denne procedure benævnes HeLa R.

trypanblå eksklusion assay

Celler blev udpladet med 5 x 10

4 per brønd i 24-brønds plader. Efter cellerne fik lov til at binde natten over blev mediet udskiftet med frisk medium med eller uden cisplatin. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C under en befugtet hypoxisk tilstand (1% O

2) i yderligere 24 timer og trypsineret at resuspendere dem i medium indeholdende serum. Trypanblåt på 20 pi og 20 pi af en celle suspension var blandet til måling af antallet af levende celler (med en fortyndingsfaktor på 2). Farvede celler blev talt og betragtet som døde celler.

bromdeoxyuridin (BrdU) inkorporering assay

DNA-syntese i prolifererende celler blev detekteret ved BrdU-inkorporering (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Parentale og Arnt Knockdown celler blev spredt ud på plader med 96 brønde og inkuberet i 24 timer. 5-bromdeoxyuridin (BrdU) reagens blev tilsat til dyrkningsmedier til 0 til 48 timer blev 100 pi fikseringsopløsning tilsat til cellerne i 30 minutter. Cellerne blev vasket med vaskebuffer og inkuberet i 1 time med 100 pi 1 x BrdU antistof. Efter tilsætning af 100 pi 1 x HRP-konjugat opløsning i 30 minutter blev 100 pi TMB-substrat-opløsning tilsat. Efter 30 min inkubation blev stopopløsning tilsat. OD blev målt ved 450 nm under anvendelse af en pladelæser. For immunofluorescens, celler transficeret med 30 nM Arnt siRNA oligonukleotider blev puls-mærket med 20 nM BrdU i 20 minutter eller 24 timer. Celler blev fikseret og farvet med anti-BrdU-antistoffer efterfulgt af anti-muse FITC og DAPI. Procentdelen af ​​kræftceller med positiv nukleare og BrdU farvning blev beregnet ved at tælle immunpositive celler i fire tilfældigt valgt ved hjælp Billede J software.

Colony dannelse assay

Celler blev udsået som separate enkelte celler i 6 Tja celle-dyrkningsplader. Efter cellerne fik lov til at binde natten over, blev celler behandlet med eller uden 1 pM cisplatin i 8 timer, og mediet blev ændret til frisk dyrkningsmedium. Dyrkningsmediet blev udskiftet hver 2. dag. Efter inkubation i 7 dage blev cellen koloni vasket med PBS to gange og fikseret med 4% paraformaldehyd (PFA, Sigma-Aldrich). Methanol (JT Baker) blev anvendt til at forøge penetrationen af ​​celler, og Giemsa farve (Sigma-Aldrich) blev anvendt til cellefarvning. Koloni-numre blev bestemt med Image J software [33]. Den kolonidannelse blev bekræftet mindst tre gange.

blød agar-assay

High-glucose DMEM indeholdende 10% FBS med 0,5% agarose blev udpladet på bunden (1,5 ml /brønd) af 6-brønds plader. Efter den basale agar havde congealed, 5 × 10

3-celler blev resuspenderet i høj glucose DMEM indeholdende 10% FBS med 0,25% agarose og lagt oven (1,5 ml /brønd) 6-brønds plader. Celler blev inkuberet med 0,5 ml suppleret medium efter topagarlag havde congealed. Dyrkningsmediet blev udskiftet hver 2. dag. Efter inkubation i 2 uger blev cellerne vasket med PBS to gange og fikseret med 4% PFA. Methanol blev anvendt til at forøge penetrationen af ​​celler, og Giemsa farve blev anvendt til cellefarvning. Den kolonidannelse blev bekræftet mindst tre gange.

revers transkription-PCR (RT-PCR)

Cell RNA blev ekstraheret ved TriZol (Invriogen) reagens efterfulgt af manuskriptet. To ug RNA blev vendt ved ImProm-II ™ revers transkriptase (Promega) og anvendt til cDNA template af polymerasekædereaktion (PCR). 50 ng cDNA skabelon blev anvendt til PCR med 2,5 U Tag DNA-polymerase (MD Bio, Taiwan) [34]. De primersæt blev anvendt som følger: Arnt (F): 5′-TGGGTCCAGCCATTGCCTCT-3 ‘, Arnt (R): 5′-CGAGCCAGGGCACTACAGGT-3′, GAPDH (F): 5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3 ‘, GAPDH (R ): 5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3 ‘. PCR-reaktionerne blev derefter elektroforese med 2% SeaKem LE agarose gel (Lonza, ME, USA).

Western blot-analyse

Celler blev høstet med 1x CCLR eller RIPA-buffer (10 mM Tris-buffer