PLoS ONE: Tovejs funktioner Arsen som kræftfremkaldende og en Anti-Cancer Agent i Human planocellulært Carcinoma

Abstrakt

Tovejs kræft-fremme og anti-cancer effekter af arsen til kræftceller er blevet afsløret i tidligere undersøgelser. Men hver af disse effekter (kræft-fremmende eller anti-cancer) er fundet i forskellige celler ved forskellige behandledes-koncentrationen af ​​arsen. I denne undersøgelse, vi for første gang vist, at arsen i en koncentration på 3 uM, svarende til gennemsnitlig koncentration i drikkevand i kræft-udsatte områder i Bangladesh, samtidig udtryk for tovejs virkninger på humane pladecellekræft HSC5 celler med forskellige veje. Behandling med 3 uM af arsen fremmes celleinvasion via opregulering af ekspression af MT1-MMP og nedregulering af ekspression af p14ARF og samtidigt induceret celle apoptose ved inhibering af ekspression af N-cadherin og forøgelse af ekspression af p21 (WAF1 /CIP1) ved begge transkript og proteinniveauer i HSC5 celler. Vi viste også, at hæmning af MT1-MMP-ekspression ved NSC405020 resulterede i fald af arsen-medieret invasion af HSC5 celler involverer fald i fosforylerede ekstracellulære signal-regulerede kinaser (Perk). Tilsammen vores biologiske og biokemiske fund antydede, at arsen udtrykte tovejs virkninger som et kræftfremkaldende stof, og en anti-cancer middel i humane planocellulært karcinom HSC5 celler med forskellige veje. Vores resultater kan spille en vigtig videnskabelig tydelig for yderligere undersøgelser for at finde ud af en bedre måde til behandling af arsen-induceret kræft, især i pladecellekræft

Henvisning:. Thang ND, Yajima I, Kumasaka MY, Kato M (2014) Tovejs funktioner Arsen som kræftfremkaldende og en Anti-Cancer Agent i human pladecellecarcinom. PLoS ONE 9 (5): e96945. doi: 10,1371 /journal.pone.0096945

Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA

Modtaget: 10. februar, 2014 Accepteret: 13. april, 2014 Udgivet: 9. maj 2014

Copyright: © 2014 Thang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning er finansieret af Vietnam National Foundation for Videnskab og Teknologi Development (NAFOSTED) under tilskud nummer 106-NN.02-2013.07. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Arsen forurening i drikkevand brøndvand er et alvorligt problem for folkesundheden i verden [1], [2]. Arsen er et veldokumenteret kræftfremkaldende for mennesker. Kronisk lavdosis eksponering af arsen forårsaget misfarvning af huden, kronisk forstoppelse, hypertension, perifer vaskulær sygdom, iskæmisk hjertesygdom, og mange typer af cancer, herunder hud, lunge, blære, lever og nyre kræft [3]. Virkninger af arsen som et middel til carcinogenese eller tumorprogression eller et anti-tumor lægemiddel afhænger af koncentrationen [4] – [6], varighed af eksponering [6], [7] og cancer celletyper [3] – [7] . Tidligere auto radiografiske dyreundersøgelser viste, at kutant pladecellecarcinom (SCC) er en af ​​de repræsentative arsen-medierede cancere [8]. Selvom arsen er blevet bredt anerkendt som kræftfremkaldende, er det også blevet klinisk bruges som et effektivt kemoterapeutisk middel i behandlingen af ​​leukæmi hos mennesker [9]. Arsen gav også udtryk for sin anti-cancer effekter på forskellige faste kræftformer, herunder kutan karcinom, ved at fremme apoptotisk celledød [10], [11]. De tovejs kræft-fremme og anti-cancer effekter af arsen på kræftcellerne har ført til en vanskelig situation at klarlægge mekanismen af ​​arsen-medieret kræft. Selv om der var mange undersøgelser, der fokuserer på at afsløre den mekanisme af virkningerne af arsen på kræftceller, er det stadig uklart.

Anholdelse af cellecyklus og apoptose er relateret til celledød og skal betragtes som vigtige måder til kræft behandling [12] – [15]. Tidligere undersøgelser har vist, at arsen inducerer apoptose i cancerceller via aktivering af ekspression af tumor suppressorer af p21 (WAF1 /CIP1) og p14ARF (p19ARF i mus) [12] – [15]. p21 (WAF1 /CIP1) og p14ARF spiller vigtige roller i at kontrollere cellecyklusstandsningen ved at regulere aktiviteten af ​​cycliner og cyclinafhængige kinaser (CDK) [16] – [19]. p21 (WAF1 /CIP1) og p14ARF er i stand til at hæmme cellevækst gennem cellecyklus arrest i hudkræft celler, herunder melanom, pladecellekræft og basalcellekræft [20] – [24]. Andre rapporter viste, at udsættelse for arsen årsag celletransformation gennem hæmning af både protein og genekspression af tumorsuppressorer p19ARF [22] – [24].

Invasion er hal mærke for malignitet kvalitet af kræftceller. Det forlyder, at arsen reducerer invasive og metastatiske egenskaber af gliom-tumorceller via hæmning af aktivering af matrixmetalloproteinase-14 (MT1-MMP) [7], [25], som er i stand til at drive invasion af cancerceller hovedsagelig ved nedbrydning ECM barrierer. MT1-MMP er også betragtes som en opstrøms af ERK. ERK er et centralt molekyle i de store signalering kassetter af mitogenaktiveret proteinkinase pathway [26],. ERK spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft, [26], [27]. Således kan MT1-MMP kunne regulere den phosphorylerede niveau af ERK [26], [27]. Men i de andre undersøgelser, høj koncentration af arsen forbedrer MT1-MMP-ekspression i fibroblastceller [28], – [30]. Tidligere undersøgelser rapporterede også, at arsen reducerer ekspressionen af ​​E-cadheriner [31], [32]. Nedregulering af E-cadherin er korreleret med opregulering af N-cadherin, en invasion promotor molekyle [33] -. N-cadherin-afhængig adhæsion forringer opregulering af cyclin-afhængige kinase inhibitor p21 [37], [38]. Ektopisk udtryk for N-cadherin øger tumorcellemotilitet [35], [39].

Vores tidligere rapport viste, at der er omkring 3 uM (210,7 pg /L) af arsen i arsenik-forurenet drikkevand brøndvand (n = 72) i cancer-udsatte områder i Bangladesh [40]. Der er mange typer af cancer, herunder pladecellecarcinomer (SCC) forekommer i disse områder [40]. I denne undersøgelse har vi for første gang vist, at arsen i en koncentration på 3 uM samtidigt fungerede som cancer-promotor og anticancerlægemiddel i humane pladecellecarcinom HSC5 celler med forskellige mekanismer.

Materialer og metoder

Reagenser

Natrium arsenid (arsen) blev købt fra Sigma. NSC405020 blev købt fra Millipore. Arsen blev opløst i vand til anvendelse. NSC405020 blev opløst i DMSO til brug.

Cell kultur

Menneskelige transformerede keratinocytter HSC5 celler [40] (Health Science Research Resources Bank, Japan) blev dyrket i RPMI-1640, suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i 5% CO2.

Crystal violet assay

Crystal violet assay blev udført under anvendelse af den tidligere beskrevne metode [40]. Kort beskrevet blev celler (3 x 10

4 celler) blev udpladet i seks-brønds plader og dyrket i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med arsen og dyrket i yderligere 3 dage. De levedygtige adhærente celler blev fikseret med 10% formalin og farvet med 0,1% krystalviolet. Absorbans ved 595 nm i de farvede celler solubiliseret med 0,1% SDS blev målt under anvendelse af en mikropladelæser.

Invasion assay

celleinvasion evne blev vurderet ved invasion assay ifølge fremgangsmåden tidligere rapporteret [41 ]. Kort fortalt, 2 × 10

5 celler i 300 ml dyrkningsmedium med 0,5% FBS blev anvendt på Matrigelcoatede øvre kammer 8 mm i diameter (8 mm i porestørrelse). Så de øvre kamre blev anbragt i 24-brønds dyrkningsplader indeholdende 600 ml konditioneret medium med 0,5% FBS at udløse invasion aktivitet og blev inkuberet i 12 timer. Invaderende celler blev farvet med hematoxyline-eosin eller krystalviolet og talt under et mikroskop.

Real-time PCR-analyse

Total RNA blev fremstillet af cellelinje prøver ved hjælp af en High Pure RNA Kit (Roche Diagnostics) ifølge fremgangsmåden beskrevet tidligere [41]. cDNA blev dernæst syntetiseret ved revers transskription af totalt RNA under anvendelse af Super-criptTMIII revers transkriptase inkluderet i RT enzymblandingen og RT-reaktionsblanding ifølge protokollen beskrevet tidligere [41]. Real-time kvantitativ RT-PCR med SYBR green blev udført under anvendelse strøm SYBR1 Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) i et ABI Prism7500 Detektionssekvensen systemet (Applied Biosystems). Ekspressionsniveauerne af p14ARF, p21 (WAF1 /CIP1), MT1-MMP og N-cadherin transkripter målt ved kvantitativ RT-PCR (real-time PCR) blev justeret gennem transkriptet ekspressionsniveauet af TATA-box-bindende protein (TBP) . PCR blev udført ved anvendelse af 10 ml strøm SYBR1 Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) indeholdende 900 nM fremadrettet primer og 900 nM revers primer i et slutvolumen på 20 ml. Sekvenser af primere præsenteres som nedenfor:

Fremad: GTGGTCTCGGACCATGTC

og omvendt: GTAGCCATATTGCTGTAGCC for MT1-MMP

Fremad:. ATTGCTGTTTTGGACCGAGA

og omvendt: CACTTGAGGGGCATTGTCAT for N-cadherin

Fremad:. AAGTCAGTTCCTTGTGGAGC

og omvendt:. ATTAGCGCATCACAGTCGCG for p21 (WAF1 /CIP1)

Fremad: ATGGTGCGCAGGTTCTTGGT

og Reverse : TGCCCATCATCATGACCTGG for p14ARF

Fremad:. CACGAACCACGGCACTGATT

og omvendt:. TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC for TBP

Immunblotanalyse

Immunoblotanalyse blev udført i overensstemmelse med den beskrevne metode tidligere [42]. Kanin polyklonale først antistoffer mod phosphoryleret threonin- 202 i ERK1 og phosphoryleret tyrosin 204 i ERK2 (Cell Signaling), anti-matrixmetalloproteinase-14 (MT1-MMP) hængselregion antistof (Millipore), ERK1 /2 (Cell Signaling), ged polyklonale antistoffer mod p14ARF og p21 (WAF1 /CIP1) (Santa Cruz), muse monoklonalt antistof mod N-cadherin (

BD

Biosciences) og muse-monoklonalt antistof mod a-tubulin (SIGMA).

Statistiske analyse

Statistisk analyse i dette forsøg blev udført ifølge den tidligere beskrevet [40] metode. Resultaterne fra tre uafhængige forsøg i hver gruppe blev statistisk analyseret ved t-test. Den SPSS (version 18) softwarepakke (SPSS Japan Inc.) blev anvendt til disse statistiske analyser, og signifikansniveau blev sat til p. 0,05

Resultater

Arsen induceret apoptose af HSC5 celler

Vores tidligere feltarbejde viste, at koncentrationen af ​​arsen i arsenik-forurenet drikkevand i kræft-udsatte områder i Bangladesh er ca. 3 uM (210,7 ug /L) [40]. Der er imidlertid en kendsgerning, at det er vanskeligt at identificere virkningerne af arsen på cancerudvikling [3] – [11] besluttede vi derfor at undersøge virkninger af arsen på apoptose af HSC5 celler. HSC5 celler blev behandlet med arsen ved 0, 1,0, 3,0, 5,0 og 10,0 uM i 24 timer. Den viste, at den højere koncentration af arsen forårsagede stærkere apoptose af cellerne. Ved en koncentration på 1 uM, arsen havde ingen virkning på celler døde (figur 1A). Dog på 3 um og 5 um, arsen forårsagede fald i cellelevedygtighed næsten 2 og 5 folds, henholdsvis (figur 1A). 10 uM af arsen førte til næsten alle celler døde (data ikke vist). Vi derefter undersøgt effekten af ​​3 uM af arsen på de døde af HSC5 celler med et tidsforløb. Behandling med arsen i 24 timer, 48 timer og 72 timer faldt betydeligt levedygtighed HSC5 celler 1,4, 1,8 og 1,7 gange henholdsvis (figur 1B). Disse resultater viste, at apoptose af HSC5 celler blev direkte forårsaget af arsen.

levedygtighed HSC5 celler behandlet med 0, 1,0, 3,0 og 5,0 uM af arsen blev evalueret ved krystalviolet (CV). Celler blev præsenteret i fotografier (A) og forhold mellem arsen behandlet levende celler og kontrol levende celler blev præsenteret i en graf (B). ** Signifikant forskellige (p 0,01) fra kontrol fra t-test

Arsen forfremmet invasion af HSC5 celler

Vi næste undersøgte virkningerne af arsen på invasion af. HSC5 celler. Celler blev forbehandlet med arsen ved forskellige koncentrationer (0, 1,0, 3,0, 5,0 og 10,0 uM) i 24 timer før høst for invasion assay. Behandling med 1 uM af arsen havde ingen virkning, men 3 um og 5 um fremmet invasion af HSC5 ca. 1,8 og 3,7 folds, henholdsvis (figur 2A). Ved 10 pM, arsen forårsagede død af næsten alle celler, derfor var det ikke muligt at undersøge effekten af ​​arsen på invasion af cellen ved denne koncentration. Vi derefter undersøgte effekten af ​​3 uM af arsen på invasion af HSC5 celler med et tidsforløb for 0, 24, 48 og 72 timer. Forbehandlet med arsen i 24, 48 og 72 timer øget invasion af HSC5 celler 2.14, 2.27 og 1.75 folds, henholdsvis (figur 2B). Der resultater antydede, at arsen resulterede i at fremme invasion af HSC5 celler. Behandling med 3 uM eller 5 uM arsen øget apoptose (figur 1) og samtidig fremmes invasion af HSC5 celler (figur 2). Disse resultater er videnskabeligt evidents for bifunctions af arsen som et kræftfremkaldende stof og anti-cancer middel i kræft pladecellekræft HSC5 celler. Baseres på disse resultater og data fra feltarbejdet, besluttede vi at bruge 3 pM af arsen til yderligere forsøg.

Invasiv evne af HSC5 celler behandlet 0, 1,0, 3,0 og 5,0 uM af arsen blev evalueret ved invasion assay. Antal invaderende HSC5 celler behandlet med arsen i invasionen assayet blev præsenteret i fotografier (A) og en graf (B). ** Signifikant forskellige (p 0,01). Fra kontrol fra t-test

Arsen forfremmet invasion af HSC5 celler ved opregulering af MT1-MMP og nedregulering af p14RAF både udskrift og udtryk niveauer

Vi næste undersøgte den molekylære mekanisme af arsen-medieret cellulær invasion i HSC5 celler. Behandling med 3 uM arsen induceret transkript og ekspressionsniveauer af MT1-MMP (figur 3A-B) og inhiberede transcript og ekspressionsniveauer af p14ARF (figur 3C-D). Tidligere undersøgelser [20] – [24], [27] viste, at MT1-MMP og p14ARF kunne spille vigtige roller i modulering vækst og invasion af pladecellecarcinom celler. I overensstemmelse med disse tidligere rapporter [20] – [24], [27], vores resultater antydede, at arsen kan fremme invasion af HSC5 celler via opregulering af MT1-MMP og nedregulering af p14ARF

A og C). transkript ekspressionsniveauer af MT1-MMP og P14 blev målt ved real-time PCR. **, Signifikant forskellige (p 0,01) fra kontrollen ved t-test. B og D) Protein ekspressionsniveauer af MT1-MMP og P14 blev målt ved immunoblot. Tubulin blev anvendt som en positiv kontrol. Tre uafhængige forsøg blev udført, og de samme resultater blev opnået.

Arsen induceret apoptose af HSC5 celler ved nedregulering af N-cadherin og og opregulering af p21 (WAF1 /CIP1) ved begge transkriptniveauer og ekspressionsniveauer

Vi undersøgte derefter den molekylære mekanisme af arsen-medieret apoptose i HSC5 celler. Behandling med 3 uM af arsen stærkt reduceret transkriptniveauer og ekspressionsniveauer af N-cadherin (Figur 4A-B) og fremmes transcript og ekspressionsniveauer af p21 (WAF1 /CIP1) (figur 4C-D). Tidligere undersøgelser [20] – [24], [29] – [36] viste, at N-cadherin og p21 (WAF1 /CIP1) kan spille vigtige roller ved modulering af apoptose af humane pladecellecarcinom celler. Vores resultater i denne undersøgelse antydede, at arsen kan forårsage apoptose af HSC5 celler gennem nedregulering af N-cadherin og /eller opregulering af p21 (WAF1 /CIP1).

A og C) transkript ekspressionsniveauer af N-cadherin og p21 blev målt ved real-time PCR. ***, Signifikant forskellige (p 0,001) fra kontrol ved t-test. B og D) Protein ekspressionsniveauer af N-cadherin og p21 blev målt ved immunoblot. Tubulin blev anvendt som en positiv kontrol. Tre uafhængige forsøg blev udført, og de samme resultater blev opnået.

Inhibering af arsen-medieret fremme af invasion HSC5 celler ved en MT1-MMP-inhibitor

Vi undersøgte dernæst virkningen af ​​NSC405020 , et MT1-MMP-inhibitor, om arsen-medieret invasion af HSC5 celler (figur 5). Da MT1-MMP er blevet rapporteret at være potentielle placeret opstrøms for ERK [41], [42] og kan være forbundet med arsen-medieret invasion (figur 2). Behandling med 3 uM arsen igen forøget invasion (figur 5A) med en stigning i ekspressionsniveauet af MT1-MMP (figur 5B). Imidlertid var der ingen ændring i den phosphorylerede niveau af ERK (pERK). Disse resultater viste, at tovejs virkninger af arsen ved denne koncentration på pERK var balance. Arsen-medieret invasion blev blokeret ved behandling med 1 uM af NSC405020 (figur 5A). NSC405020 (1 uM) forårsagede at falde udtryk niveau af MT1-MMP samt nedgang af phosphoryleret af ERK i HSC5 celler (Figur 5B).

A), invasiv aktivitet HSC5 behandlet med 3 pM af arsen blev evalueret invasion assay. Niveau af invasiv evne præsenteres som antallet af invaderende celler i en graf (venstre) og fotografier (højre). ** Signifikant forskellige (p 0,01) fra kontrol fra t-test. Phosphorylerede niveauer af ERK (P-ERK) og protein ekspressionsniveauer af MT1-MMP og ERK i HSC5 celler behandlet med 3 uM arsen i 24 timer er præsenteret. Tubulin protein ekspressionsniveauerne præsenteres som en intern kontrol.

Diskussion

Arsen er blevet betragtet som et middel til carcinogenese og tumor progression for lang tid siden [1], [2 ]. På baggrund af analysen af ​​52.202 hånd rør-brønd vandprøver i de sidste 14 år i Bangladesh viste, at omkring 36 millioner og 22 millioner mennesker kunne være at drikke As-forurenet vand over 10 og 50 ug /l [43]. Dette kan være den vigtigste årsag til alvorligt problem for udvikling af cancer, især for hudkræft i Bangladesh [3]. I en kontrast måde, arsen også er blevet anvendt som et lægemiddel til behandling af mange typer af cancere [8] – [11]. Baseres på vores tidligere resultat [40], vi undersøgt virkningerne af 3 uM arsen på cellulær invasion, et adelsmærke for malignitet kvalitet af kræft celle og apoptose, en markør for celle død i kræftbehandling. Vores Resultatet viste, at arsen samtidigt stærkt induceret apoptose (figur 1) og fremmes invasion (figur 2), i HSC5 celler. Disse resultater antydede, at ved denne koncentration, arsen udtrykte tovejs funktioner i pladecellekræft HSC5 celler. Vi undersøgte derefter de molekylære mekanismer i forbindelse med disse begivenheder i HSC5 celler. Vores resultater viste, at 3 pM arsen forbedret cellulær invasion gennem opregulering af membrantype 1 matrixmetalloproteinase (MT1-MMP) (figur 3A), som spiller afgørende roller i tumorigenese [7], og nedregulering af p14ARF (figur 3B), som er et inhibitor til celleproliferation [20] – [24] på både transkriptniveauer og ekspressionsniveauer. Det er første gang, vi viste, at der er en mulighed i et samarbejde mellem MT1-MMP og p14ARF i udviklingen af ​​kræft i HSC5 celler. I den anden side viste vores resultater, at 3 pM arsen induceret apoptose af HSC5 celler via nedregulering af N-cadherin (figur 4A), som spiller rolle i celledifferentiation, transformation, samt invasion [33] – [36] og opregulering p21 (WAF1 /CIP1) (figur 4B), en tumor suppressor [20] – [24] på både transkriptniveauer og ekspressionsniveauer. Vores resultater i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [37], [38] foreslog, at N-cadherin kunne deltage til den tilknyttede-cellecyklusstop gennem den nukleare akkumulering af cyclin-afhængige kinaseinhibitorer p21. Selvom både p14ARF og p21 (WAF1 /CIP1) blev rapporteret som molekyler, som spiller en vigtig rolle i styring cellecyklusstandsningen ved at regulere aktiviteterne i cycliner og cyclinafhængige kinaser (CDK) [16] – [19], i denne undersøgelse, disse molekyler udtrykt deres forskellige virkninger på invasion og apoptose af HSC5 celler. Endvidere viste vi, at NSC405020, en MT1-MMP-inhibitor, inhiberede arsen-medieret fremme af invasion HSC5 celler (figur 5). Det kan forklares, at behandling med NSC405020 resulterede i faldende udtryk niveau af MT1-MMP. Til gengæld MT1-MMP reguleret det phosphorylerede niveau af ekstracellulære signal-regulerede kinaser (Perk) [26], [27], som spiller en vigtig rolle i cellulær invasion, proliferation og tumor udvikling [26], [27]. Endelig nedregulering af MT1-MMP og pERK af NSC405020 ført til faldende invasionen af ​​HSC5 celler (figur 5). Tovejs kræft-fremme og anti-cancer effekter af arsen kræftceller celler er blevet afsløret. Imidlertid arsenik som en cancer-middel eller et anti-cancer lægemiddel blev fundet i forskellige celler ved forskellige behandlet-koncentration i en bestemt rapport [1] – [3], [8] – [11]. Det er første gang, vi samtidig viste tovejs funktioner af arsen i humane planocellulært karcinom HSC5 celler med distinkte molekylære veje. Denne undersøgelse var med til at forklare, hvorfor selvom der er mange mennesker har været udsat for arsen, ikke alle af dem har arsenicosis sygdomme, herunder cancere. Vores resultater gav vigtige oplysninger om andre undersøgelser i fremtiden at finde ud af en bedre måde til behandling af arsen-induceret kræft, især i pladecellekræft.