Abstrakte
Mekaniske egenskaber for celler er blevet anerkendt som en biomarkør for cellulær cytoskeletorganisation. Som kemiske behandlinger fører til celle cytoskeletale omlejringer dermed ændringer af cellulære mekaniske egenskaber, efterforske cellulære mekanisk ejendom variationer giver indsigtsfulde viden til effekter af kemiske behandlinger på kræftceller. I denne undersøgelse, er virkningerne af otte forskellige anticancer lægemidler på de mekaniske egenskaber af human prostatacancer celle (PC-3) undersøgte ved hjælp af en nyudviklet kontrol-baserede nanoindentation måling (CNM) protokol om atomic force mikroskop (AFM). Den CNM-protokollen overvinder grænserne for andre eksisterende metoder til i-væske nanoindentation måling af levende celler på AFM, især til måling af mekaniske egenskaber af levende celler. Youngs modul af PC-3-celler behandlet med de otte medikamenter blev målt ved at variere kraft Belastningen over tre størrelsesordener, og sammenlignet med værdierne for kontrollen. Resultaterne viste, at Youngs modul af PC-3-celler øges betydeligt ved de otte testede lægemidler, og blev meget mere udtalte, efterhånden som den kraft belastningen steg. Desuden blev to forskellige tendenser klart udtrykt, hvor under behandlingen af Disulfiram, paclitaxel, og MK-2206, eksponenten koefficient på den frekvens- modul funktion forblev næsten uændret, mens med Celebrex, BAY, Totamine, TPA, og Vaproic syre, den eksponentielle rate blev signifikant øget
Henvisning:. Ren J, Huang H, Liu Y, Zheng X, Zou Q (2015) En atomic force mikroskop Study Revealed to mekanismer i Effekt af Anticancer Drugs om rate-afhængig Youngs modul af humane prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (5): e0126107. doi: 10,1371 /journal.pone.0126107
Academic Redaktør: Etienne Dague, LAAS-CNRS, FRANCE
Modtaget: Oktober 3, 2014 Accepteret: 30 marts 2015; Udgivet: 1. maj 2015
Copyright: © 2015 Ren et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NSF KARRIERE award tilskud CMMI-1066055 (https://www.nsf.gov/awardsearch/showAward?AWD_ID=1066055) og IDBR tilskud (DBI- 1353890) (https://www.nsf.gov/awards/award_visualization_noscript.jsp?org=CMMI®ion=US-NJ instId=0026294000).
Competing interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Mekaniske egenskaber af levende celler er kendt for at være tæt forbundet med cellernes vækst scenen og funktionalitet.. Ændringer i mekaniske egenskaber er blevet anerkendt som en indikator for patologiske ændringer af celler [1-3], og dermed kan tjene som en biomarkør for cellulære fænotypiske begivenheder, for eksempel dem der er forbundet med celleadhæsion og cytoskeletorganisation [4-6]. Især som en reaktion på den miljømæssige og /eller mekanisk stand variationer, cellecytoskelettet undergår dynamiske omlejringer, hvilket til gengæld yderligere inducerer ændringer i cellulære mekaniske [7] egenskaber. Derfor studier af mekaniske egenskaber af celler bidrager til en bedre forståelse af cellers reaktioner på kemiske behandlinger, herunder medicinsk behandling af cancerceller. Det er blevet rapporteret, at sygdomme, såsom cancere ændrer de mekaniske egenskaber af de celler [1, 8, 9], og omvendt, variationer af mekaniske egenskaber af cancercelle forårsaget af anticancerlægemidler kan anvendes til at evaluere effekten af disse kemikalier [10 , 11]. Undersøgelser af mekaniske egenskaber af kræftceller kan yderligere bidrage til at opklare de fysiske mekanismer involveret i kræft udvikling, progression og metastase. Derfor undersøgelse af cellulære mekaniske egenskaber bliver en uundværlig og vigtig komponent i udviklingen af nye strategier til forebyggelse og diagnose af kræft.
Atomic force mikroskop (AFM) er blevet et stærkt værktøj til at studere mekaniske egenskaber af enkelt levende celle på grund af sin unikke evne at anvende kraft stimuli og derefter måle responsen på bestemte steder i en fysiologisk venligt miljø med piconewton kraft og nanometer rumlige resolutioner [8, 12]. Specifikt AFM er blevet benyttet til at undersøge udviklingen af celle- mekaniske egenskaber som følge af celle-abnormaliteter (fx cancerformer) og kemiske behandlinger på kræftceller [7, 8]. For eksempel har det vist sig, at Youngs modul af cancerøse humane epitelceller tendens til at være væsentligt lavere end normale dem [3], Youngs modul brystkræftcellers stiger monotont med stigningen af den kraft load rate [8], og efter F-actin forstyrrelser lægemiddelbehandling den gennemsnitlige elasticitetsmodul fibroblastceller faldt tydeligt [10]. Men disse undersøgelser [3, 8, 10] er blevet begrænset til måling af statisk cellulære mekanisk adfærd i lavfrekvente områder (med kraft belastning på under 5 Hz) og mindre kraft amplituder (under 2 NN). De dynamiske mekaniske adfærd af kræftceller i højere frekvensområder, og virkningerne af kemiske behandlinger på frekvensafhængige viskoelastiske opførsel af cancerceller er stort set ukendt. Som kemiske behandlinger fører til dynamiske omlejringer af cellecytoskelettet, og dermed, dynamiske udvikling af mekaniske egenskaber af celler [7, 10], evolution af dynamiske mekaniske adfærd af kræftceller leverer indsigtsfulde oplysninger til anticancer lægemiddeludvikling.
Undersøgelser af frekvensafhængige biomekaniske egenskaber af levende celler er blevet begrænset af evnen til nuværende AFM mekanisk måleteknikker. Konkret opstår grænsen skyldes i høj grad den nuværende metode til indrykningsdybden måling på AFM, ved at trække cantilever afbøjning fra cantilever basen forskydning [8, 13]. Væsentlige fejl og usikkerheder induceres i fordybningen målt som proben acceleration (i forhold til den faste ende af udliggeren fastgjort til den piezoelektriske scanner) ignoreres, og den første kontakt punkt er stort set usikker [8, 13-15]. Især er sonden acceleration effekt udtalt og stiger betydeligt, når målingen stigende frekvens. Selvom den kraft-modulation metode er blevet anvendt til at måle frekvensafhængige viskoelasticitet af levende celler [16, 17], ved at øge en sinusformet svingning til belastningen /losse force profil med konstant hastighed, er sonden acceleration virkning fuldstændig ignoreret, og store usikkerhedsmomenter i fordybningen målt i den relativt høje frekvens region [14, 18]. Endvidere er en sådan strategi yderligere begrænset af den forholdsvis lille amplitude af den dynamiske kraft, der påføres (snesevis af PECO newton) anvendt-mens at afhøre en række biologiske reaktioner i cellen, excitation kraft langt større amplitude skal anvendes som mekaniske egenskaber af levende celler er amplitude afhængig [19, 20]. Endelig kraft modulation metode kræver den oscillerende kraft, der skal gentagne gange anvendes på samme sted ved hver valgte måling sats i det målte frekvensområde. Men for levende celler sådan procedure er skadelig som gentagne, samme-location kraft anstrengelse tendens til at deformere og endda beskadige cellemembranen. Det blev også foreslået at studere mekaniske egenskaber af levende celle ved at kvantificere den effektive stivhed anvendelse af en magnetisk kraft modulationsteknik på AFM [15]. En sådan fremgangsmåde er imidlertid ikke kun kræver forberedelse ekstra prøve /udstyr (f.eks, anvendelse af en hjemme-bygget aluminium holder med vakuum fedt at montere prøven), men heller ikke kvantificere celle stivhed (dvs. Youngs modul) direkte [15] -Quantification af Youngs modul kræver nøjagtig måling af fordybningen. Da kraften stimuli anvendes, og den tilsvarende fordybning dannet fungere som henholdsvis input og output til cantilever probe-prøve interaktion model, fejl i indrykning måling fører direkte til den i mekaniske egenskaber kvantificeret-uanset probe-prøven interaktion model anvendes . Det er således afgørende nøjagtigt at måle fordybning i mekaniske studier af levende celler.
I denne undersøgelse blev virkningen af anticancer kemiske forbindelser på de dynamiske mekaniske egenskaber af human prostatacancer celle (PC-3) undersøges ved hjælp af en nyudviklet kontrol-baserede nanoindentation måling (CNM) protokol [14]. Otte forskellige lægemidler, herunder Disulfiram (DSF), paclitaxel (Taxol), Tomatine, BAY 11-7082 (BAY), vaproic syre (VPA), 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), celecoxib, og MK-2206 (MK) testes. Skønt undersøgelser har vist anticancer virkninger af disse lægemidler, f.eks proteasomhæmning og apoptose proces med brystcancerceller induceret af DSF-et velkendt lægemiddel til alkoholisme behandling [21], eksperimentelle undersøgelser af disse kemiske forbindelser som anticancerlægemidler er i øjeblikke , og mange spørgsmål forbliver ubesvarede. Derfor studere de dynamiske mekaniske ejendom ændringer i PC-3 celler behandlet med disse otte lægemidler kan give indsigtsfulde svar på anticancer aktiviteter af disse kemiske forbindelser.
CNM-protokollen [14] overvinder grænserne for eksisterende metoder til i-væske indrykning måling af bløde prøver på AFM. Ved CNM-protokollen, er indrykningen på levende celler måles ved at spore
samme
excitation force profil (dvs. den samme cantilever afbøjning) på både levende celler og et hårdt reference, og derefter kvantificeret fra forskydningen forskel af cantilever faste ende på disse to prøver. Den største fordel ved CNM protokollen er, at ved hjælp af en hård reference og mere kritisk, præcis sporing samme kraft profil på begge prøverne, er den dominerende negative virkning af cantilever acceleration helt fjernet uden behov for parameter kalibrering [14, 18 ]. Desuden er den hydrodynamiske kraft virkning væsentligt reduceret, især ved stor kraftpåvirkning satser (fx reduceret med over 50%, når kraften belastning er højere end 100 Hz). I denne undersøgelse blev satsen afhængig Youngs modul på PC-3 celler kvantificeret ved hjælp af CNM-protokollen ved at variere belastningen /losse rate af excitation kraft over tre størrelsesordener fra 0,2 Hz til 100 Hz, med den målte indrykning amplitude over 2 ordrer større end den oscillerende amplitude i [16].
Materialer og metoder Salg
Cellekultur og behandling
PC-3-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC , Rockville, MD, USA) og dyrket i RPMI-1640 dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS, der blev suppleret med penicillin (100 enheder /ml) -streptomycin (100
μ
g /ml) og L-glutamin (300
μ
g /ml). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en CO 5%
2 inkubator og passeret to gange om ugen. For at imødekomme AFM målinger blev PC-3-celler podet med en tæthed på 2,0 x 10
4 celler /ml i 60 mm vævskulturskåle (5 ml /skål) og inkuberet i 24 hpurs. Hvorefter cellerne i hver skål blev derefter behandlet med opløsningsmiddel DMSO (2
μ
l /ml) eller med hver af de otte medikamenter opløst i DMSO i 24 timer før AFM målinger.
MTT assay
PC-3-celler blev podet ved en densitet på 2,0 x 10
4 celler /ml medium i 96-brønds plader (0,2 ml /brønd) og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med de forskellige anticancermidler i 72 timer. Efter behandling 200
μ
l 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (5 mg /ml i PBS) blev tilsat til hver brønd af pladen og inkuberes i 2 timer. Efter omhyggelig fjernelse af mediet, blev 0,1 ml DMSO tilsat til hver brønd. Absorbansen blev registreret på en mikropladelæser ved 540 nm. Virkningen af forskellige midler mod cancer på cellelevedygtighed blev vurderet som levedygtighed procent sammenlignet med DMSO-behandlede celler
Immunofluorescens
Immunfluorescensfarvning blev anvendt til bestemmelse
β
. – actin i PC-3-celler. Kort fortalt blev PC-3-celler podet med en tæthed på 2,0 x 10
4 celler /ml medium i 60 mm dyrkningsskåle og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med MK eller Celebrex i 24 timer. Derefter blev cellerne fikseret i acetone /methanol (1: 1) i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter inkuberet med
β
actin antistof (sc-47.778, Santa Cruz Biotech Inc, Dallas, TX) natten over ved 4 ° C. Næste cellerne blev vasket og inkuberet med Texas Red konjugeret gede anti-muse-antistof (115-075-003, Jackson ImmunoRsearch Lab Inc, West Grove, PA) i 60 minutter ved stuetemperatur. Immunfluorescensfarvning blev undersøgt under anvendelse af et fluorescensmikroskop (Nikon Eclipse TE200, Nikon Inc.).
Kemikalier Salg
RPMI-1640 vævskulturmedium, penicillin-streptomycin, L-glutamin og føtalt bovint serum (FBS) blev erhvervet fra Gibco (Grand Island, NY). Blandt de otte testede i denne undersøgelse forskellige lægemidler, Disulfiram (DSF), paclitaxel (Taxol), tomatine, BAY 11-7082 (BAY), vaproic syre (VPA), og 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) var erhvervet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), og Celecoxib og MK-2206 (MK) blev leveret af National Cancer Institute Repository.
Kontrol-baserede Elasticitet Målinger
den nyligt -developed CNM protokol [14, 18, 22] blev anvendt til at måle hastigheden-afhængige Youngs modul og frekvensafhængig kompleks modul EA.hy926-celler. Det centrale spørgsmål er at måle fordybning i levende celler præcist, især i høj hastighed og /eller bredbånd nanomekaniske målinger. På baggrund af analysen af de cantilever dynamik under nanoindentation målingen, den CNM-protokollen opnår fordybning i levende celler, Δ
z
(
t
), som forskellen i den forskydning af cantilever base (dvs. den faste ende af cantilever) på cellen,
z
bs
(
t
), og at på en hård referenceprøve (fx en silicium prøve),
z
bh
(
t
) [14], (1)
over indrykning kvantificering kræver, at
samme
excitation force profil (dvs. den samme cantilever afbøjning bane) spores præcist på begge prøverne. Læserne nævnt Ref. [16] for oplysninger om CNM-protokollen.
For at sikre præcision sporing af samme excitation kraft profil på både levende celler og det hårde reference, CNM-protokollen udnytter iterative læring bekæmpelsesmetoder, f.eks modellering -fri inversion-baserede iterativ indlæring kontrol (MIIC) teknik [23]. Konkret anvendes til at drive AFM kontrol input
z
aksen piezo aktuator opnås ved iteration som følger: (2), hvor
jω
‘betegner Fouriertransformation.
d
d
(⋅) er den ønskede cantilever afbøjning,
α
er en konstant, og
u
k Hotel (⋅) og
d
k Hotel (⋅) er den aktuelle indgang spænding til AFM piezo aktuator og cantilever afbøjning i
k
th
iteration hhv. Styringen input
u
k Hotel (
t
) opnås ved at tage Fouriertransformation af input og udgangssignaler og anvende MIIC algoritmen Eq 2, og derefter den inverse Fourier-transformation bagefter. Den MIIC algoritme er også blevet udnyttet til at opnå hurtig bredbånd nanomekaniske måling på polymerer i luften for nylig [24, 25].
Atomic force mikroskop
Youngs modul af PC-3 celler blev målt i cellekulturmediet ved anvendelse af en dimension Icon AFM (Bruker, Santa Barbara, CA) udstyret med en fluid celle. En blød cantilever (MLCT’er-C, Bruker, USA) med nominel fjederkonstant 0,01 N /m blev valgt til målingerne. Sonden radius af 28 nm og udliggeren fjederkonstant på 0,012 N /m blev kalibreret henholdsvis af imaging et tip-radius kalibreringsprøve (PA-01, Mikromasch, NanoAndMore USA Corp.) og den termiske tuning processen. En silicium prøve blev valgt som den hårde referenceprøve. Både cellerne og de cantilevere blev termisk ækvilibreret ved ~ 37 ° C i 40-60 minutter forud for alle målinger for at minimere cantilever driver. Alle kontrol- og sensor signaler til /og fra AFM-systemet blev erhvervet gennem et dataopsamlingssystem (NI PCI-6259, National Instruments Corporation, Austin, TX) under Matlab xPC-mål (The MathWorks, Natick, MA) miljø .
en trekant drev spænding med en konstant belastning og losse sats (som ansat i sædvanlig kurve måling force-afstand) blev anvendt på
z
aksen piezo aktuator af AFM-system, og følgende ni belastning satser over tre størrelsesordener blev anvendt: 0,2 Hz, 0,5 Hz, 1 Hz, 5 Hz, 10 Hz, 20 Hz, 50 Hz og 100 Hz. Amplituden af drevet spænding blev holdt den samme for alle de ovennævnte belastning satser, hvilket resulterer i samme cantilever basen forskydning ved 250 nm (som for de ovennævnte belastning satser, dynamikken af hverken
z
aksen piezoelektriske aktuator eller cantilever armaturet mekanisme blev ophidset [18]). For at minimere skaderne cellemembranen, blev trekanten drev ansøgt om kun én periode, hvor den kraft belastning var lavere end 50 Hz og to perioder ved højere belastning satser. Drevet indgange blev anvendt successivt fra lav til høj belastning satser, adskilt af en bolig tid på 3 min mellem hver sats-at tillade cellen at komme sig helt fra de foregående kraft stimuli. For hver ladning sats, excitation udøvede kraft (dvs. cantilever deformation) blev på levende celler måles og betragtes som den ønskede excitation force profil, og MIIC algoritmen blev anvendt i kurven måling kraft-afstand på referenceprøven at sikre præcision sporing af den ønskede kraft profilen (RMS sporing fejl blev holdt under 1,5%).
for at undersøge virkningen af hvert lægemiddel på Youngs modul på PC-3 celler, målingerne blev udført på den tilsvarende kontrol først , derefter på de behandlede celler. For hvert lægemiddel, blev disse målinger gentages på fem forskellige celler til både kontrol og narkotika-behandlede dem.
Rate-afhængige elasticitetsmodul Kvantificering
Ved hver kraft belastning sats, Youngs modul af celle blev kvantificeret under anvendelse af sfæriske Hertz kontakt model sammen med den målte probe-prøve interaktion kraft og indrykning [12], (3) hvor
R
er sonden radius, og
E
ν
er Youngs modul og Poisson forholdet mellem levende celler (
ν
= 0,5 [7, 12]), hhv. Sonden-prøve interaktion kraft kvantificeres som
F
z
=
k
c
d
s
(med cantilever fjederkonstanten (
k
c
)) [12]. Vi bemærker, at andre Hertizan indrykning kontakt model som den koniske model [12] kan anvendes. Det sfæriske kontakt model der vælges som i dette arbejde indrykningsindstillinger dybder genererede ikke var væsentligt større (over 10 gange) end men har tendens til at være sammenlignelig med sonden radius [26, 27].
Resultater og Diskussion
Den kraft (dvs. cantilever afbøjning) tidsprofil ved belastning satser på 0,2 Hz og 50 Hz på TPA behandlet PC-3 celler ved høj dosering (20
μ
M) er vist i figur 1 , som et eksempel-force-time afbildninger af den lave dosering og /eller andre stoffer viste lignende tendens. Kraft-indrykning kurver målt fra den samme behandling på alle ni belastning satser er vist i figur 2 for alle de ni belastning satser (force-indrykning kurver for andre målinger er ikke vist at spare sapce). Youngs modul af kontrollen (dvs. ubehandlede) og lægemidlet behandlet PC-3-celler er sammenlignet i fig 3-5 for de otte testede lægemidler, henholdsvis hvor Youngs modul vs. kraftpåvirkning sats afbildes i logaritmisk skala, og kurven-montering af data til følgende magt loven er også vist, (4), hvor
E
0 er den magt lov konstant elasticitet skaleringsfaktor af celler, og
α
er styrkelov eksponent, der fanger viskositeten af cellemembranen [13, 28]. Desuden
E
0 og
α
af monteret Youngs modul vs. frekvens kurve er også sammenlignet i figur 6 for de otte testede til kontrol narkotika og det behandlede PC-3 celler under både den lave og den høje doser. Vejviser
eksperimentet resultaterne viste, at de viskoelastiske adfærd af PC-3 celler var godt fanget i dette arbejde. Som vist i figur 1 (b), blev sonden acceleration effekt på kraft-indrykning bane udtalt og skulle medregnes i indrykningen kvantificering, og for den samme drevne amplitude, indrykningen genereret faldt monotont med stigningen af den kraft, belastning satser (se figur 2), hvilket afspejler viskoelasticitet karakter cellemembranen [8, 12]. Indrykningen genereret på PC-3 celler varierede fra 80 nm til 230 nm blandt alle de otte testede lægemidler (for alle de testede doser). Da
z
aksen drevet drevet amplitude blev holdt den samme ved 250 nm, sådan en variation af indrykning præcis afspejlede viskoelasticitet af cellerne og narkotika effekter på det, henholdsvis.
den målte Youngs modul vs frekvens relation fulgte, ganske godt, magt lovgivning den bredt observerede universelle viskoelastiske opførsel af levende humane celler [13, 28, 29]. Variationerne af elasticiteten skala faktor
E
0 og magt loven eksponent
α
var små blandt alle kontroller-med standardafvigelsen på 5,8% og 4,2%, henholdsvis ( se figur 6), hhv. Sådan en lille variation af
E
0 og
α
derfor kan serveres som baseline at undersøge virkningerne af de ni testede lægemidler på de mekaniske egenskaber af PC 3-celler. Desuden rækken af magt loven eksponent
α
enig godt med den rapporterede interval (0,1-0,3) for levende celler i litteraturen [29].
Som vist i fig 3-5, alle de lægemiddelbehandlede celler præsenteret en meget højere Youngs modul, og jo højere lægemiddeldosering var, jo større forøgelsen af Youngs modul var. Som Youngs modul ændring i celler er direkte relateret til ombygning af cytoskeletale struktur [4, 5, 10], kan en mulig forklaring af modulus stigning være aggregering af actinfilamenter under lægemiddelvirkninger da det er blevet vist, at aggregering af . actinfilamenter resulterer i en tydelig stigning i den gennemsnitlige Youngs modul på celler [10]
en hurtig sammenligning af figurerne 3-5 afslørede to store tendenser kan eksistere i de otte forsøgslægemidler virkninger på Youngs modul: under effekten af DSF, blev MK, og Taxol, Youngs modul af PC-3 celler øges uden væsentlige ændringer i frekvens-afhængighed, dvs elasticiteten skala faktor
E
0 steget betydeligt (med 55% til 78%), mens strømmen loven eksponent
α
næsten uændret (se ligning 4) -for disse stoffer variationen af
α
var kun omkring 6% til 14%. I henhold effekten af Celebrex, BAY, Totamine, TPA, og VPA, frekvens-afhængighed af den forhøjede Youngs modul ændret betydeligt, dvs.
E
0 steget med 78% til 260%, mens
α
steg også med 22% til 75% (se figur 6)
DSF, MK og Taxol:. forhøjet Youngs Modulus uden Signifikant Ændring af frekvens-afhængighed
for DSF, MK, og Taxol, forholdene mellem Youngs modul mellem de behandlede PC-3-celler og kontrollen var næsten den samme indlægget alle ni målte frekvenser ved hver dosering behandling (vist som forøgelsen af
E
0, se figur 3). Dette indebærer, at viskositeten af de behandlede celler ikke blev ændret væsentligt i forhold til kontrol- oner som værdien af
α
ændredes ikke væsentligt. Det kan konkluderes, at under behandlingen af DSF, MK og Taxol kan rekonstruktion cellecytoskelettet netværk føre til en generel afstivning af membranen proteinstruktur (fx filament afkortning og fortykkelse), men må ikke forårsage meget ændring af polymerisationsgrad af actin filamenter inde i cellerne-den generelle årsag til viskositet forandringer [30, 31].
Selvom MK, Taxol og DSF kan have forskellige molekylære mål og virkningsmekanismer, den tilsvarende tendens celle Youngs modul ændring kan forklare ligheden af disse tre lægemidler ‘effekter i celle mekanisk adfærd. MK kan inaktivere Ezrin der tjener som linkere mellem plasmamembranen og cytoskelettet [32]. Taxol forstyrrer den normale fordeling af mikrotubuli [33], og DSF hæmmer tubulin polymerisering [34]. Det er rimeligt at postulere, at forstyrre linkere mellem plasmamembranen og cytoskelet, forstyrrer mikrotubuli opdeling og hæmme tubulin polymerisering kan føre til celle afstivning uden ændring af viskositet.
Men Youngs modul stigning på MK og Taxol behandlet, celler var mere signifikant (selv for en lav dosis af 2
μ
M) end for DSF behandlede celler (ved samme dosis). En mulig forklaring kan være den jernchelaterende virkning DSF. Tidligere undersøgelse viste, at DSF lettet intracellulær Cu optagelse [35]. Det konstateredes, at MK og Taxol stærkt hæmmet aktivering af Akt [36, 37], mens DSF havde nogen inhibitorisk virkning på aktivering af dette protein [38]. Inaktivering af Akt kan bidrage til stærkere virkning af MK og Taxol sammenlignet med DSF. Indflydelsen af DSF på jern homeostase kan være en anden mulig forklaring på den svage effekt af DSF (på stigningen i Youngs modul) end MK og Taxol.
Forhøjet Youngs Modulus Ledsaget af Dramatic Frekvens-afhængighed Skift
Påfaldende forskellig fra de tre ovennævnte stoffer, de andre fem lægemidler (Celebrex, BAY, Totamine, TPA, og VPA) tendens til at påvirke ikke kun den elastiske, men også den tyktflydende adfærd PC-3 celler som både elasticiteten skalaen faktor,
E
0 og magt loven eksponent,
α
blev øget væsentligt. Dette fænomen indikerer, at cellecytoskelettet ændring som følge af behandlingen af disse fem stoffer ikke kun består cytoskelet afstivende men også ændre på polymerisationsgrad, der kan indebære en forøget koncentration af actinmonomerer og en omorganisering af actinfilamenter. Endvidere bemærkes det, at standardafvigelsen af Youngs modul af PC-3-celler behandlet med disse fem lægemidler er større end dem, behandles med de tre andre lægemidler (DSF, taxol og MK). Da standardafvigelsen af Youngs modul for al kontrol er stadig meget mindre for alle de otte stoffer, er en mulig forklaring på den større afvigelsen er, at den dynamiske mekaniske opførsel af de celler behandlet af de fem stoffer (Celebrex, BAY, Totamine, TPA, og VPA) var mere aktiv.
Det var kendt, Celebrex, TPA og valproinsyre induceret celledifferentiering [39-41]. Som undersøgelser viste, at celledifferentiering fører til en stigning af celle stivhed [26], stigning i stivhed og viskositet PC-3-celler behandlet med Celebrex, kan TPA og valproinsyre være relateret til differentiering af cellerne. Selvom BAY11-7082 og Tomatine ikke er blevet vist at inducere differentiering i epitelceller, disse lægemidler hæmmer aktivering af NF-
κ
B [42], og inhibering af NF-
κ
B i nogle celler resulterede i en mere differentieret fænotype [43]. Således kan virkningen af BAY11-7082 og Tomatine på stivhed og viskositet af PC-3 celler vedrører deres hæmmende virkning på aktivering af NF-
κ
B.
Blandt måleresultaterne, ændringen af Youngs modul var størst på Celebrex behandlede celler. Da Celebrex medfører tab af filopodia og lamellipodia i celler, og ændringer i actin netværk [44], disse aktiviteter ud over sine differentieringsinducerende virkninger kan resultere i en stærkere effekt på øget stivhed og viskositet PC-3 i forhold til de fire andre lægemidler.
Vi yderligere udførte MTT test for at undersøge sammenhængen mellem ændringerne i mekaniske egenskaber og hæmning af cellevækst. Som vist ved cellelevedygtighed testresultater fra MTT-assayet i figur 6, behandling af PC-3-celler med de otte anticancerlægemidler faldt antallet af levedygtige celler, især ved høj dosis, dvs. effekten var dosisafhængig. En sådan virkning af lægemidlerne (på faldende cellelevedygtighed) korrelerede godt med deres virkning på at ændre celle mekaniske egenskaber åbenbaret i de ovennævnte AFM tests, for alle otte forskellige stoffer undersøges. Selv om de ovennævnte AFM undersøgelser klart afslørede to distinkte mønstre blandt de otte forskellige stoffer i at ændre de mekaniske egenskaber af PC-3 celler (DSF, MK og Taxol som én gruppe, og Celebrex, Bay, Tomatine, TPA og Vaproic syre som de andre gruppe), MTT-analysen har undladt at vise nogen tydelig forskel i ændringer levedygtighed celle mellem disse to grupper. Dette resultat tyder på, at de foreslåede AFM undersøgelser kunne have afsløret nye sider af biologisk respons af kræftceller til anticancer medicinsk behandling, derved giver mere information end den konventionelle MTT assay i svarene fra PC-3 celler til anticancer narkotika behandling. En mulig forklaring er, at ændringerne i cytoskelettet og cellemembran kan korrelere med evnen af cancerceller til at metastasere. Fremtidige studier med passende kræftcelle metastase model kan bidrage til at udforske sammenhængen mellem ændringer i mekaniske egenskaber og metastatisk evne af kræftceller.
For yderligere at undersøge mekanismerne bag de to mønstre afsløret af AFM undersøgelser, immunfluorescensfarvning af
β
actin blev udført for at søge indsigt til de forskellige reaktioner i PC-3 celler til medicinsk behandling. MK og Celebrex blev udvalgt til at repræsentere den første og den anden gruppe af de otte lægemidler (som afsløret af AFM studier), hhv. De fluorescensimagografi opnåede resultater er vist i fig 7. Morfologien af
β
actin immunfluorescensfarvning var ens i celler behandlet med MK og dem behandlet med Celebrex. Dette resultat antyder, at de forskellige reaktioner i PC-3-celler til de to grupper af lægemidler kan omfatte mere komplekse mekanismer ud over modifikation af cellen actin. Yderligere undersøgelser af modifikation af andre cytoskeleton komponenter er nødvendige for at bestemme mekanismerne bag de to forskellige typer af svar på de to grupper af lægemidler testet.
Betydningen af de ovennævnte undersøgelser understreges af betydningen af identificere nye mål for inhibering af væksten og inducere apoptose i cancerceller, som er blevet en vigtig indsats i udviklingen af nye generation af lægemidler mod cancer. Fysiske egenskaber af kræftceller, såsom elasticitet og viskositet, der er forbundet med ændring af cytoskeleton og plasmamembranen kan repræsentere en enestående klasse af nye mål for udvikling af lægemidler mod cancer.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.