PLoS ONE: Systems-Level Modeling of Cancer-fibroblast Interaktion

Abstrakte

Kræftceller interagerer med omgivende stromale fibroblaster under tumorigenese, men de komplekse molekylære regler, der regulerer disse interaktioner stadig dårligt forstået således hindring for udviklingen af ​​terapeutiske strategier til at målrette kræft stroma. Vi har taget en matematisk tilgang til at begynde at definere disse regler ved at udføre den første store kvantitativ analyse af fibroblast effekter på kræft celledeling over mere end fire hundrede heterotypiske cellelinje fodboldmesterskaber. Systemer-niveau modellering af denne komplekse datasæt ved hjælp ental værdi dekomposition afslørede, at normale væv fibroblaster variabelt udtrykke mindst to funktionelt adskilte aktiviteter, en, der afspejler transkriptionelle programmer i forbindelse med aktiverede mesenkymale celler, der fungerer enten sideordnet eller forbi hinanden at modulere kræftcellen proliferation. Disse resultater tyder på, at kvantitative metoder kan vise sig nyttig til at identificere organisatoriske principper, der styrer komplekse heterotypiske celle-celle interaktioner i kræft og andre sammenhænge

Henvisning:. Wadlow RC, Wittner BS, Finley SA, Bergquist H, Upadhyay R, Finn S, et al. (2009) Systemer-Level Modeling of Cancer-fibroblast Interaction. PLoS ONE 4 (9): e6888. doi: 10,1371 /journal.pone.0006888

Redaktør: Dov J. Stekel, University of Nottingham, England

Modtaget: April 1, 2009; Accepteret: 29 juli 2009; Udgivet: 3 September, 2009

Copyright: © 2009 Wadlow et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en HHMI Læge-Scientist Early Career Award (SR) og en Sidney Kimmel Translational Science Award (SR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræftceller interagerer dynamisk med omgivende stromale celler. Blandt de mange relevante celletyper inden for cancer stroma, fibroblaster synes at fungere fremtrædende [1]. Men vi mangler en klar forståelse af, hvordan molekylære og cellulære heterogenitet inden for denne celletype funktionelt bidrager til kræft initiering og progression [2]. I del, dette skyldes de eksperimentelle udfordringer forbundet med at studere multi-cellulære interaktioner. Mens stadig mere sofistikerede dyremodeller bliver brugt til at definere diskrete mekanismer, ved hvilke fibroblaster bidrager til tumorudvikling, er disse modeller ikke velegnet til systematisk opdagelse på tværs af flere genetiske og epigenetiske sammenhænge [3] – [6]. En alternativ eksperimentel fremgangsmåde involverer analyse af samspillet af dissocierede cancerceller og fibroblaster in vitro [7] – [11]. Denne fremgangsmåde har potentialet til at muliggøre systematisk og objektiv molekylær screening for nye stromale mål, der efterfølgende kan valideres i flere fysiologisk relevante systemer.

In vitro fremgangsmåder til at studere cellulære interaktioner er generelt begrænset af valget af specifikke celler, dyrkningsbetingelserne, og assays. Det ideelle system vil undersøge funktionelle interaktioner mellem forskellige primær cancer celle- og fibroblast populationer co-afledt de samme tumorer. Imidlertid primære humane cancerceller er notorisk svære at udbrede langsigtet ex vivo, og primære tumorafledte fibroblaster synes at undergå fænotypiske ændringer i kortfristede kultur [6]. I modsætning hertil er etableret cellelinjer nemt dyrkes, relativt billigt, og let tilgængelige, og dermed repræsenterer en potentielt nyttig og vedvarende ressource til at studere kræft-fibroblast interaktion. Desuden kan dyrkningsbetingelser påvirke cellulær adfærd, men stadig mere komplekse fremgangsmåder, der forsøger at efterligne fysiologisk relevante tilstande, såsom tredimensionale kultur, skalere dårligt [12]. Endelig fibroblaster påvirker mange aspekter af kræft celle adfærd, herunder spredning og overlevelse, angiogenese, invasion, metastase, og resistens, men analyser til at score mere og mere komplekse fænotyper kan være udfordrende at gennemføre i systematiske undersøgelser.

Vi udførte derfor en kvantitativ og integreret analyse under anvendelse matematisk modellering af cancercelleproliferation i todimensional co-kultur med et stort antal normale fibroblast-cellelinjer. Disse undersøgelser afslørede, at normalt væv fibroblaster variabelt udtrykke mindst to funktionelt forskellige aktiviteter i modulering cancercelleproliferation. Endvidere transskriptionsprofilering af disse forskellige fibroblast populationer viste, at mindst en af ​​disse aktiviteter vil kunne angå molekylære programmer, der er til stede i aktiveret mesenkym. Systemer-niveau modellering kan således være nyttig til at identificere organisatoriske principper, der bredt ligger til grund for interaktioner af kræftceller og fibroblaster og kan derfor oplyse systematiske molekylære studier af kræft-fibroblast interaktion.

Materialer og metoder

cellelinier og plasmid-DNA

Cellelinjer blev fremskaffet fra ATCC (Manassas, VA) eller Coriell Cell Repositories (Camden, NJ). Alle fibroblastlinier blev anvendt til co-kulturer inden for 10 passager efter købet. Cancer og fibroblast-cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum (FCS), L-glutamin (4 mM), penicillin (100 enheder /ml) og streptomycin (100 ug /ml). EGFP mærkning af cancer cellelinjer blev udført ved hjælp af en tredje generation lentiviral vektor-system. 293T-celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 en subkonfluerende 10 cm skål med vektoren pCCLsin.PPT.hPGK (10 ug), i hvilken EGFP var blevet klonet, samt pMDLg /p emballage (7 ug) og VSV-G-kuvert koder pMD.G (5 ug) plasmider. Disse plasmider blev opnået fra Rafaella Sordella på MGH Center for Cancer Research og Luigi Naldini på San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy. Viral supernatant blev opsamlet efter 48 timer, filtreret med et 0,45 mikron sprøjtefilter og opbevaret ved -80 ° C. Cancercellelinjer blev inficeret i subsammenflydende brønde i plader med 24 brønde under anvendelse af 300 pi af virus i 1 ml DMEM dyrkningsmedium med 10% føtalt kalveserum. Denne protokol gav infektion satser på over 80% (bestemt ved visuel vurdering ved hjælp af fluorescens mikroskopi). EGFP-negative celler blev fjernet under anvendelse af en modificeret 5-laser Becton-Dickinson FACSDiVa med standardteknikker som beskrevet tidligere [13].

Kvantitative co-kulturer Salg

2 × 10

4 fibroblaster blev podet i 100 pi i mindst 6 replikatbrønde i hver af to 96-brønds plader og fik lov til at klæbe til en konfluent monolag natten over. Efterfølgende 10

3 EGFP-udtrykkende cancerceller blev podet i yderligere 50 pi ind i fibroblast indeholdende brønde og i tomme brønde (150 pi totalvolumen per brønd). En Spectramax M5-pladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) blev anvendt til at opnå fluorescerende aflæsninger ca. en gang dagligt i 14 dage (excitation 477 nm, emission 515 nm). Tredive mikroliter af friske medier blev tilsat til hver brønd på dag 3, 6, 9 og 12. Brønde indeholdende fibroblaster eller medier alene, alle med 150 pi medier per brønd på dag 0 blev målt parallelt og værdierne trækkes fra co -kultur og monokultur brønde henholdsvis at tage højde for auto-fluorescens. Alle kulturer blev udført i DMEM med 10% FCS

heterotypisk xenografter:.

Estradiol pellets (0,72 mg, 60-dages frigivelse Innovative Research of America, Sarasota, FL) blev implanteret i kvindelige nøgne mus (Charles River Laboratories) to dage før xenograft injektioner. Mus blev opdelt i 2 grupper: 5 mus blev injiceret med AG09877 fibroblaster og EGFP-udtrykkende T47D-brystcancerceller, og 5 mus blev injiceret med AG04351 fibroblaster og EGFP-udtrykkende T47D celler. Celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i Hanks balancerede saltopløsning ved en koncentration på 4 x 10

6 millioner celler pr 100 mikroliter. Dyr bedøvet med isofluran blev injiceret med 4 x 10

6 fibroblaster og 4 × 10

5 cancerceller i subkutant væv hen over brystfedtpuden. EGFP signal blev afbildet og kvantificeret under anvendelse af en bonsai fluorescensoptiske billedbehandlingssystem umiddelbart efter injektion, dagligt i fire dage, og derefter hver 2-3 dage. Musene blev behandlet i overensstemmelse med MGH Institutional Animal Care og brug Udvalg bestemmelser og ofret 43 dage efter injektion. Tumorvæv blev reseceret og lynfrosset. Frosne sektioner blev farvet med hematoxylin og eosin eller med anti-cytokeratin (CAM 5.2, Becton-Dickinson).

Databehandling

For at kvantificere effekten af ​​fibroblaster på væksten af ​​kræftceller, vi defineret kurven mono-kultur, at være forskellen på dag

t

mellem den gennemsnitlige fluorescens måling for brøndene med kræftceller, men ingen fibroblaster og den gennemsnitlige fluorescens måling for brøndene med medierne alene. Vi definerede kurven co-kultur, at være forskellen på dag

t

mellem den gennemsnitlige fluorescensmåling for brøndene med cancerceller og fibroblaster og den gennemsnitlige fluorescensmåling for brøndene med fibroblaster alene. Vi fjernede konstant signal ved at subtrahere den mindre dag 0 værdi. Konkret har vi lader og lad. Co-kultur forhold blev defineret som forholdet mellem arealet under disse to kurver. Konkret hvor

M

er arealet under kurven, lader vi være de dage, som vi har målinger og interpoleret lineært mellem måletidspunkter. Ved trapez-reglen,

Vi definerede

C

ligeledes at være det område under kurven. Vi definerede derefter co-kultur ratio,

E

ved

For at beregne konfidensintervaller (CIS) for

E

, vi brugte en forening af tre bootstrap BC

en to-sidet 95% CIs, hver beregnet ud fra 10.000 bootstrap prøver [14]. Bootstrap prøver dannes ved først at vælge med udskiftning af de to replikat plader med 96 brønde, og ved derefter vælge med udskiftning brønde af hver type (dvs. medie-kun, fibroblast, mono-kultur, co-kultur) fra de valgte plader. Den co-kultur-forholdet blev betragtet som signifikant, hvis 95% CI for

E

var helt over eller under et.

Matematisk modellering

Vi hypotese, at et lille antal funktionelt distinkte interaktion typer ligger til grund for mange datapunkter i matrixen af ​​co-kultur-forhold. Vi mistanke om, at hvis vi kunne bestemme et optimalt antal,

N

, enklere matricer med til at tilnærme co-kultur-forholdet matrix, så er optimale

N

ville give os en idé om antal funktionelt distinkte interaktion typer arbejdsulykker og matricerne, der omfatter tilnærmelse kan give os et indblik i karakteren af ​​de interaktioner.

en række forskellige metoder er til for at nedbryde en matematisk matrix til en sum af enklere matricer, er i en vis forstand retvinklede eller uafhængigt af hinanden [15]. Modeller baseret på ental værdi dekomposition (SVD) eller principal komponent analyse (PCA) er blevet mest udbredte på tværs af en bred vifte af biologiske, kemiske og fysiske videnskaber [16]. Eksempler omfatter udfoldning af anatomiske eller patofysiologisk oplysninger fra dynamisk kontrast-forstærket MRI og analyse af tredimensionelle kvantitative struktur-aktivitets relationer til at forudsige aktiviteten af ​​lægemiddelkandidater [17] – [19]. Vi valgte SVD for vores analyse i PCA siden PCA første centre dataene ved at fratrække række eller kolonne midler. Imidlertid blev nul værdien af ​​vores matrix sat til at være lig en AUC-forhold på 1, der betyder fraværet af en effekt af co-kultur på kræft celleproliferation. Således at flytte nul værdi ved at fratrække midler ville have ofret dens iboende betydning.

nedbrydningsprodukter metoder er ofte kombineret med cross-validering strategier til at skelne meningsfulde komponenter fra statistisk støj [20]. Den krydsvalidering strategi, vi valgte at bruge beskæftiger EM-algoritmen til vurdering af manglende data [21] som beskrevet nedenfor.

Lad

R

være matrix af forskelle mellem co-kultur forholdet matrix og en, således at positive værdier af

R

svarer til co-kulturer, der stimuleret kræft celledeling og negative værdier af

R

svarer til co-kulturer, der hæmmede kræft celleproliferation. Vi ønsker at bestemme en optimal

N

for

R

. For at gøre dette, bruger vi modeller kompleksitet som øger med

N

at forudsige værdien af ​​hvert element af

R

fra alle de øvrige elementer i

R

og anser som optimal

N

, som disse forudsigelser er maksimalt nøjagtige.

Specifikt for enhver matrix

S

lad betegne det element af

S

i

i

th række og

j

th kolonne lad betegne

S

med det element af

S

i

i

th række og

j

th kolonne mangler og lad være med det manglende element udfyldes af

x

. Lade være en tilnærmelse af

S

fået ved at tilføje den bedste

N

matricer af ental værdi nedbrydning af

S

(dvs. dem, der svarer til det

N

største singulære værdier). I tilfælde af manglende data vi definerer ved EM algoritme til beregning af manglende data som følger. Letand lad

Det er vores erfaring, dette EM algoritme har altid konvergeret som

k

stiger, så vi kan lade

Letand lad være medianen af ​​de over alle de

jeg

og

j

.

N

for som er minimal anses for at være den optimale

N

for

R

.

Genekspression profilering

Konfluente plader af fibroblaster (replikerende betingelserne for co-kultur) eller cancerceller i log-vækstfase blev trypsinbehandlet, centrifugeret til pellets, og lynfryses i flydende nitrogen. RNA blev isoleret med Qiagen RNeasy kits og profilerede hjælp Affymetrix HG-U133 Plus 2,0 mikroarrays med standard protokoller [22].

Resultater og Diskussion

Vi først systematisk samdyrket tolv human, melanom og lungekræft cellelinier med seksogtredive-transformerede, human fibroblast cellelinjer afledt af normal hud og lunge (se tabel S1 og tabel S2 for detaljer). Hver cancercellelinie blev tagget med EGFP under anvendelse lentiviral transduktion for at aktivere den sammensatte kvantificering af cancercelleproliferation og overlevelse over fjorten dage under anvendelse af en simpel pladelæser-baseret assay system. For hver cellelinie parring (n = 432), som vi undersøgt i flere gentagelser end uafhængige forsøg, beregnet vi forholdet mellem arealet under EGFP kurven for cancerceller dyrket i co-kultur divideret med arealet under kurven for cancerceller dyrket alene (figur 1A). Vi fandt, at treoghalvtreds af 432 cellelinje parringer (12%) var væksten-stimulerende i absolutte tal, defineret ved en 95% konfidensinterval med en nedre grænse større end 1 (figur 1B). I modsætning hertil 176 (41%) var vækstinhiberende og 203 (47%) var null. Disse data viser, at kun et mindretal af heterotypisk cellelinje parringer udbytte øget kræft cellevækst.

A) Heat kort repræsentation af eksperimentelt bestemte co-kultur nøgletal for 432 cancer-fibroblast cellelinje interaktioner. Rød refererer til vækst-stimulerende interaktioner og blå til vækst-undertrykkende interaktioner. B) Interaktioner resulterer i statistisk signifikant vækst stimulering af kræftceller (dvs. den nedre grænse af 95% CI for co-kultur forholdet er 1) er vist med rødt, og interaktioner resulterer i statistisk signifikant væksthæmning af kræftceller ( dvs den øvre grænse af 95% CI for co-kultur forholdet er 1) er vist med blåt. Cirklen angiver samspillet mellem T47D og AG04351, og pladsen viser interaktionen mellem T47D og AG09877.

For at undersøge relevansen af ​​disse co-kulturer i vivo, vi næste fokuseret på to specifikke kræft- fibroblast parringer, der udviste modstående proliferative virkninger in vitro. Konkret AG09877 stimuleret T47D spredning, mens AG04351 var væksthæmmende for denne samme kræft cellelinje. Co-injektion af T47D-celler og AG09877 fibroblaster subkutant i nøgne mus førte til dannelsen af ​​små tumorer over en uge (figur 2A og 2B). I modsætning hertil xenografting af disse cancerceller med AG04351 fibroblaster ikke føre til tumordannelse. Disse resultater bekræftede at modstridende virkninger af forskellige fibroblast populationer på cancercellevækst in vitro også kunne observeres in vivo. T47D alene er svagt tumorigen (data ikke vist) [23], [24], og den kendsgerning, at de fleste inducerede tumorer permanent regression efter den første uge foreslog, at væksten-stimulerende virkning af AG09877 fibroblaster var generelt utilstrækkelig til at opretholde den langvarige vækst af denne cellelinie in vivo. Især dog et dyr faktisk udviklet en vedvarende tumor i løbet af seks uger. Patologisk undersøgelse af dette enkelte tumor afslørede EGFP-positive cancerceller indlejret i en betydelig desmoplastiske stromal komponent (figur 2C). Mens kun et enkelt forsøg, denne provokerende resultat antydede, at vækst-stimulerende fibroblaster identificeret in vitro kan være i stand til at udøve både forbigående og mere vedvarende tumorfremkaldende virkninger på tilstødende kræftceller in vivo.

A) EGFP signal fra injektioner af EGFP-udtrykkende T47D celler med AG09877 fibroblaster (5 mus, blå kurve) eller AG04351 fibroblaster (4 mus, rød kurve). Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse på middelværdien. B) Repræsentative billeder af mus xenotransplanteret med hver blanding taget 3 dage efter injektion, med hvide pile peger på injektionssteder. C) mikrofotografier af en T47D-AG09877 tumor. Fra venstre mod højre:. Hæmatoxylin og eosin farvning, GFP-fluorescens, og immunhistokemi for cytokeratin

Vi næste havde til formål at identificere organisatoriske principper ligger til grund for matrix af co-kulturer, der kan give indsigt i de biologiske determinanter for cancer-fibroblast interaktion. Systematisk genskabe den cellulære interaktion matrix ved hjælp heterotypiske xenografter kunne have tilbudt yderligere indsigt i den fysiologiske relevans af de enkelte bindinger, men var ikke muligt for 432 forskellige interaktioner. Vi brugte derfor et system-tilgang til at karakterisere og vores model in vitro-data. Til at begynde med, overfladisk inspektion af dataene i figur 1 viste, at cancercellelinier kan grupperes i dem, der var overvejende inhiberet (n = 3), stort set inhiberede (n = 6), eller stærkt stimuleret (n = 3) af fibroblaster , hvilket antyder, at væksten reaktion af en cancer cellelinje i et givet stromal co-kultur blev forprogrammeret og uafhængig af den parrede fibroblast linie (f.eks figur 3A). Det er dog kun SKBR3 viste ensartede reaktioner på tværs af alle fibroblast linjer, implicerer flere fibroblast-specifikke bidrag til kræft celleproliferation. I flere tilfælde var tilstrækkeligt til at tilsidesætte den generelle disposition af cancercellelinie, hvilket fører til en vækststimulerende interaktion med et ellers vækst-inhiberede cancercellelinie eller omvendt (for eksempel figur 3B) denne fibroblast bidrag. Således væksten respons for kræft cellelinjer til stromale co-kultur syntes at skyldes en kombination af en dominerende kræftcelle-bestemt bidrag og en mindre, men ofte kritisk vigtige fibroblast effekt.

A) Væksten respons for kræft cellelinier (cirkler) til fibroblaster (aflange former) bestemmes overvejende af den forprogrammerede evne kræftceller til at formere sig som respons på generiske fibroblast signaler (sorte pile) deles i fælles på tværs af alle fibroblast linjer. Nogle kræft cellelinjer (grøn) er vækst stimuleres, mens andre (gul) reagerer ikke eller vækst-hæmmet. B) Yderligere signaler produceret af delmængder af fibroblaster (røde pile) tilføje kompleksitet ved enten yderligere at stimulere cancer celleproliferation (øverste venstre panel) eller kompensere for den manglende reaktion på generiske signaler (nederste venstre panel). Selvom alle signaler i denne skematiske defineres som vækst-stimulerende, kan de også være væksthæmmende dermed tilføjer yderligere kompleksitet.

Selvom figur 3B skematisk repræsenterer et påholdende to signal model, det samlede antal interaktion typer kunne ikke let udledes ved kvalitativ inspektion af vores datasæt. Vi brugte derfor matematisk modellering baseret på ental værdi dekomposition at spørge, om det komplekse mønster af vækst stimulering og hæmning vi observeret på tværs af denne datasæt skyldes en lille, begrænset antal interaktion typer mellem kræftceller og fibroblaster. Nedbrydes matrix af co-kultur nøgletal i en sum af

N

komponent matricer, vi brugte en leave-one-out krydsvalidering strategi til at definere den optimale værdi for

N Hotel (Figur 4 , se materialer og metoder til detaljer af modellen). Vi fandt, at den mediane krydsvalidering fejl nåede lavpunktet med

N

= 3, hvilket antyder, at nettet co-kultur-forholdet for hver cellelinie parring resulterede fra summen af ​​interaktion værdier repræsenteret ved tre forskellige komponenter matricer. Matrix A, som tegnede sig for hovedparten af ​​fejl reduktion i modellen, afspejlede den varierende reaktionsevne forskellige cancercellelinier til generiske stromale signaler produceret af fibroblaster (figur 5A). For eksempel 9 af 12 cancercellelinier generelt reageret på fibroblaster med langsommere vækst, som eksemplificeret ved SKBR3 og MCF7, mens tre cancercellelinier var typisk vækst-stimuleret, hvilket fremgår af BT-474 og SK-MEL-2.

Median leave-one-out krydsvalidering fejl, når matrix af co-kultur nøgletal tilnærmes med summen af ​​N komponent matricer.

A) -C) nedbrydning af co -kultur matrix til 3-komponent matricer. Når gældende, cancer og fibroblast-cellelinjer er opdelt i to grupper (X, grøn, og Y, lilla), således at interaktioner inden for samme gruppe gøre væksten-stimulerende (dvs. positiv) bidrag til den estimerede co-kultur-forholdet og interaktioner mellem modsatte grupper gør vækst-hæmmende (dvs. negativ) bidrag til den anslåede co-kultur-forholdet. P-værdier refererer til væv oprindelsesland adskillelse mellem X og Y-grupper. Cirkler indikerer interaktionen mellem T47D og AG04351, og kvadrater indikerer interaktionen mellem T47D og AG09877. Rød refererer til vækst-stimulerende interaktioner og blå til vækst-undertrykkende interaktioner, med intensitet, der svarer til styrken af ​​effekten og skaleres uafhængigt inden for hver matrix.

I modsætning hertil matrix B og matrix C afspejlet særskilt fibroblast aktiviteter, der korrelerede signifikant kun ufuldkomment med en given fibroblast væv af oprindelse (p = 6 × 10

-5 og p = 0,0072 for matricer B og C.) (figurerne 5B og 5C). I løbet af hver matrix blev fibroblasterne underopdelt i to grupper, der kommunikerede med distinkte undergrupper af cancercellelinjer at fremme cancercelleproliferation (grøn vs. lilla i figur 5). Mens størstedelen af ​​cancercellelinier interageret samvirkende med “hud-lignende” fibroblaster i matricen B, et andet flertal begunstiget de “lunge-lignende” fibroblaster i matrix C. Derfor kunne vi identificere flere eksempler, hvor samme fibroblast -cancer parring resulterede i positive effekter på kræft celledeling i en matrix og negative effekter i andre (f.eks T47D-AG07139), hvilket tyder på, at fibroblaster kunne interagere med kræftceller i mindst to funktionelt forskellige måder.

på trods af det faktum, at størstedelen af ​​fejl reduktion i modellen blev indskudt af matricen A, i nogle tilfælde virkningen størrelse i matricer B og C i kombination var tilstrækkelig til at tilsidesætte denne i matrix A. faktisk nærmere analyse afslørede, at nettoeffekten af forskellige fibroblaster om kræft celledeling kunne kun bestemmes nøjagtigt ved at betragte de

kvantitative

bidrag af effekter fra alle tre matricer. Dette illustreres af interaktioner mellem brystkræft cellelinien T47D og de to skin fibroblast cellelinjer AG09877 og AG04351 (betegnet i figur 1A og figur 5A-C ved kvadrater og cirkler, henholdsvis). Matrix A (figur 5A) afslørede, at T47D generelt var disponeret for væksthæmning af alle fibroblast cellelinjer. En plausibel biologisk forklaring på dette kunne være udtryk for en celleoverfladereceptor for nogle cytostatisk faktor, der udskilles af alle fibroblaster. Men matrix B (figur 5B) indikerede, at de fleste hud fibroblast cellelinjer havde en vækst stimulerende aktivitet for T47D, med et par bemærkelsesværdige undtagelser, herunder AG04351. I teorien kan denne aktivitet skyldes ekspressionen af ​​de fleste hudfibroblaster af et specifikt mitogen vækstfaktor. I modsætning hertil matrix C (figur 5C) indikerede, at de fleste hud fibroblast cellelinjer havde også en anden distinkt vækstinhiberende aktivitet for T47D, med den vigtige undtagelse af AG09877 og flere andre. Denne aktivitet kunne plausibelt tilskrives sekretion af de fleste hudfibroblaster af en bestemt vækstinhiberende cytokin. Således AG09877, ved at udtrykke vækst-stimulerende aktivitet og mangler væksthæmmende aktivitet, lavet to funktionelt adskilte vækst-stimulerende bidrag til T47D vækst, der var tilstrækkelig i kombination for at tilsidesætte den generelle disposition af T47D at fibroblast-medieret vækst undertrykkelse. I modsætning hertil kun AG04351 gjort vækst undertrykkende bidrag med hensyn til både fibroblast aktiviteter.

For at få indsigt i den molekylære identitet af disse fibroblast aktiviteter, isoleret vi RNA fra 36 fibroblast cellelinje monokulturer og udførte microarray-baserede genekspression profilering hjælp Affymetrix genchips. Vi først identificeret gener, som blev differentielt udtrykte mellem hud og lungefibroblaster, mellem X og Y i matricen B, og mellem X og Y i matrix C. Vi anvendte derefter gensæt berigelse analyse (GSEA) [25] til at identificere gensæt beriget inden for hver sammenligning. Ved hjælp af en falsk opdagelse sats (FDR) tærskel på 0,25, vi identificeret ni gensæt beriget med huden vs. lungefibroblast skelnen, herunder to, der karakteriserer epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) fænotype (tabel 1) [26]. Selvom forbundet med højere FDRs blev begge sæt også beriget med B

x (hud-lignende) vs. B

y (lunge-lignende) skelnen. I modsætning hertil blev der ikke gensæt markeret i C

x (hud-lignende) mod C

y (lunge-lignende) skelnen, hvilket antyder, at denne fibroblast aktivitet enten kan afspejle transkriptionelle forskelle kun induceret i forbindelse med co-kultur eller ikke-transkriptionelle forskelle, der ikke kunne let detekteres ved hjælp af microarray-baserede transkriptionel profilering.

EMT beskriver et koordineret program af cellulære fænotyper i stigende grad som afgørende for metastaser af carcinoma celler. Disse fænotyper omfatte tab af epitelcelle polaritet, forøget cellulær migration og invasion i omgivende væv [27]. Desuden seneste undersøgelser viser, at EMT-programmer også regulere mesenkymale cellefunktioner herunder angiogenese [28]. Endvidere transkriptionsfaktoren Sneglen, en master regulator af EMT, udtrykkes i aktiverede fibroblaster i helende sår og ved tumor-stromale grænseflade [29]. Vore data således foreslået, at EMT programmer fortrinsvis udtrykkes af mange hudfibroblaster, måske tjener som den molekylære basis for et af fibroblast aktiviteter (Type B) beskrevet af vores kvantitativ model.

En nærmere undersøgelse af de to EMT-genet sæt afslører, at mange af de gener, der driver berigelse i hudfibroblaster (dvs. de centrale beriget gener) er celleoverfladen og udskilte molekyler, der har været impliceret i stromale bidrag til tumorprogression (figur 6). For eksempel matrixmetalloproteinaser og cathepsiner herunder MMP-2, MMP-12, og cathepsin Z er opreguleret i tumor stroma og fremme cancercelleproliferation, migration og invasion ved nedbrydning basalmembraner og udsætter kryptiske vandrende og vækstsignaler [30] . Tenascin C er en matricellular protein, der stimulerer cancercelleproliferation og angiogenese [31]. N-cadherin (CDH2) udtrykkes i filopodia af myofibroblaster der migrerer mod maligne cancerceller i en transformerende vækstfaktor beta-afhængig måde [32]. SPARC (udskilte protein sure og rig på cystein) er en anden stromal matrix protein, der øger cancercelleinvasion og som er blevet omvendt korreleret med overlevelse hos patienter med pancreascancer [33], [34]. Stromal PDGFRB regulerer interstitielle væske pres og narkotika optagelse inden tumorer [35]. Således de samme gener, der regulerer EMT i epitelcancerceller også regulere funktionelle bidrag til malign progression fra tumorstroma. Beriget ekspression af disse gener i hudfibroblaster antyder vævsspecifik forprogrammering af mesenkymale populationer for tumor stromale funktionalitet.

Heat kort (højre) og berigelse plot (venstre) for EMT gensæt fra GSEA analyse af huden vs. lungefibroblaster [26].

fibroblaster syntes derfor at vise mindst to forskellige virkninger på proliferative reaktion af kræftceller i co-kultur. Vigtigere er det, en

kvantitativ balance

mellem disse to fibroblast aktiviteter og den generelle reaktionsevne cancerceller til fibroblast signaler i høj grad bestemt co-kultur-forholdet for en bestemt cellelinje parring. Disse uafhængige fibroblast effekter kan tilsyneladende eksistere inden for de enkelte fibroblast befolkninger, fungerer enten kooperativt eller forbi hinanden med hensyn til kræft cellevækst. Interessant nok vores analyse tyder på, at begge aktiviteter adskille fibroblaster i høj grad ifølge væv af oprindelse. Endvidere microarray profilering indikerede, at en af ​​disse aktiviteter kan afspejle differentiel ekspression af et koordineret transkriptionel program i forbindelse med aktiverede mesenkymale celler. Yderligere arbejde vil være forpligtet til fuldt ud at karakterisere den molekylære basis for hver fibroblast aktivitet og vurdere relevansen af ​​vores resultater til kræft-fibroblast interaktion i reelle tumorer.

Dette arbejde blev begrænset af arten af ​​de cellepopulationer undersøgt , for så vidt som etablerede cancercellelinier og normale væv fibroblaster kan ikke fuldstændigt phenocopy disse cellepopulationer, der findes i en udviklende human tumor. Yderligere undersøgelser med større eller mere varierede fibroblast paneler kan også identificere nye og forskellige mønstre af aktivitet. Desuden er disse eksperimenter omfattede kun 12 cancercellelinier.