PLoS ONE: Integreret analyse af Copy Number Variation og Genome Wide Expression Profilering i kolorektal cancer væv

Abstrakt

Integrative analyser af flere genomiske datasæt for udvalgte prøver kan give bedre indsigt i de overordnede data og kan øge vores viden om kræft. Formålet med denne undersøgelse var at belyse sammenhængen mellem kopiantal variation (CNV) og genekspression i kolorektal cancer (CRC) prøver og deres tilsvarende ikke-kræft væv. Fireogtres parrede CRC prøver fra de samme patienter blev udsat for CNV profilering ved anvendelse af Illumina HumanOmni1-Quad assay og validering blev udført under anvendelse multiplex ligering probe amplifikationsmetode. Hele genomet ekspression profilering blev udført på 15 parrede prøver fra den samme gruppe af patienter, som brugte Affymetrix Human Gene 1.0 ST array. Væsentlige gener opnået fra begge array-resultater blev derefter overlappet. For at identificere molekylære veje blev dataene mappet til Kegg databasen. Hele genom CNV analyse, at sammenlignet primær tumor og ikke-kræft epitel afslørede gevinster i 1638 gener og tab i 36 gener. Betydelige gevinster meste findes i kromosom 20 ved position 20q12 med en frekvens på 45,31% i tumorprøver. Eksempler på gener, der var forbundet med denne cytoband var

PTPRT

,

EMILIN3

og

CHD6

. blev registreret det højeste antal tab på kromosom 8, position 8p23.2 med 17,19% forekomst i alle tumorprøver. Blandt generne findes på dette cytoband var

CSMD1

DLC1

. Genom-dækkende udtryk profilering viste 709 gener for at være up-reguleret og 699 gener at være nedreguleret i CRC sammenlignet med ikke-kræft prøver. Integration af disse to datasæt identificeret 56 overlappende gener, som blev placeret i kromosomerne 8, 20 og 22. MLPA bekræftede, at CRC prøver havde de højeste gevinster i kromosom 20 i forhold til referenceprøver. Fortolkning af CNV data i forbindelse med transkriptomet via integrative analyser kan give mere indgående kendskab til den genomiske landskab af CRC

Henvisning:. Ali Hassan NZ, Mokhtar NM, Kok Sin T, Mohamed Rose I , SAGAP I, Harun R, et al. (2014) Integreret Analyse af Copy Number Variation og genom-Wide Expression Profilering i kolorektal cancer væv. PLoS ONE 9 (4): e92553. doi: 10,1371 /journal.pone.0092553

Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA

Modtaget: Juli 4, 2013; Accepteret: 24. februar, 2014 Udgivet: 2 April, 2014

Copyright: © 2014 Ali Hassan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Projektet blev finansieret af Ministeriet for Videnskab, Teknologi Innovation (07-05-MGI-GMB016) og videregående Institution Centre of Excellence bevilling fra Ministeriet for Videregående Uddannelser. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er et stort sundhedsproblem, med mere end en million individer diagnosticeret hvert år på verdensplan [1]. Denne kræft er blandt top tre af alle kræfttilfælde, der fører til døden på verdensplan [2]. I Malaysia, det rangerer som den anden mest almindelige kræftform hos begge køn [3].

En form for genetisk ustabilitet, der er observeret i mindst 85% af sporadiske CRC tilfælde er kromosomal ustabilitet (CIN) [4] . Aneuploidi er en konsekvens af CIN, der fører til gevinst eller tab af hele eller dele af kromosomale regioner [5], og det kan forårsage strukturel kompleksitet, der fører til genomisk instabilitet. En almindelig form for strukturelle varianter på grund af CIN er kendt som kopital variationer (CNVs), der defineres som en gevinst eller tab af kopier af DNA-segmenter, der er større end 1 kb i længde sammenlignet med en reference-genom [6]. CNVs kan påvirke genekspression og har været forbundet med sygdom modtagelighed. Det er blevet foreslået, at transkriptionelle ændringer svarer til CNVs og forstyrrelser i gen dosering kan korreleres med ændringer i ekspressionsniveauet [7].

Tusinder af CNV steder er blevet dokumenteret ved hjælp af mikroarray-teknologi. Tidligere undersøgelser af tarmkræft har afsløret gevinster på kromosom 8q, 13 og 20Q og tab på kromosom 8p, 17p og 18q [8], [9], [10], [11], [12]. Disse afvigelser føre til sletning eller amplifikation af tumorsuppressorgener, onkogener eller ikke-kodende RNA’er såsom miRNA, der resulterer i afvigende ekspression af gener, der påvirker kræftrelaterede biologiske processer [13], [14].

et gen, der har en duplikeret allel (en kopi antal 3) har en højere ekspression end vildtype [15]. Omvendt vil et gen, der har en allel udgår (en kopi antal 1) har et lavere niveau af ekspression [15]. Integrativ analyser i CRC viste, at ekspressionsniveauer af visse onkogener og tumorsuppressorgener var relateret til CNV [16]. For eksempel, forstærkning eller gevinst af

MYC

gen ved position 8q24 resultater i overekspression af dette gen i CRC. Desuden sletning eller tab af

APC

gen ved position 5q21 fører til sin dereguleret udtryk i CRC [17]. Lignende mønstre af korrelation er også blevet observeret i bryst- og lungekræft. Ca. 12% af ændringer i genekspression niveauer blev rapporteret at være i konkordans med kopi nummer i brystkræft [18], og cirka 78% gener viste en positiv korrelation mellem CNV og genekspression niveau i en lungekræft undersøgelse [19].

målet med denne undersøgelse var at få indsigt i de molekylære mekanismer i CRC via analyserne af CNV og hele genomet ekspression profilering af en primær tumor og dens tilsvarende ikke-kræft tyktarmsepitel. Vi ønskede også at identificere forholdet mellem CNV profil og transkriptomet i CRC.

Materialer og metoder

Patient rekruttering

Undersøgelsen blev udført med godkendelse fra den etiske komité af Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM 1.5.3.5/244/UMBI-004-2012), og skriftligt informeret samtykke blev taget fra hver af de 64 patienter, som gennemgik kirurgi. Ingen af ​​patienterne havde modtaget kemoterapi eller strålebehandling behandling før operation. Primær tumor og ikke-cancervæv (10 cm væk fra tumoren) blev opnået umiddelbart efter operationen og lynfrosset i flydende nitrogen til opbevaring.

Genomisk DNA og RNA-isolering

Frosne sektionering blev udført på alle prøver under anvendelse en skærende tykkelse på 5 til 7 um. Snittene blev monteret på objektglas og farvet med hematoxylin og eosin (H 80% cancerceller) eller fravær af tumorceller og deres tilsvarende ikke-cancerceller. DNA blev isoleret ved anvendelse af Qiagen DNeasy blod og væv Kit ifølge producentens protokol. Totalt RNA blev ekstraheret fra 15 parrede prøver ved anvendelse af Qiagen Qiamp Mini Plus Kit. Kvaliteten af ​​det isolerede DNA, og RNA blev kvantificeret under anvendelse af en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), og kun prøver med en renhed på 1,8 til 2,1 (A260 /A280) blev udvalgt. Integriteten af ​​de isolerede DNA-prøver blev evalueret på 1,0% agarosegeler, og integriteten af ​​det isolerede RNA blev bestemt ved anvendelse af et Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA). Prøver med et RNA Integritet Number (RIN) på 6,0 og derover blev udvalgt til genekspression profilering.

CNV og genekspression profilering

Alle 64 parrede prøver blev analyseret ved hjælp af Illumina HumanOmni1-Quad Bead chip, som indeholder 1.140.419 enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) loci, baseret på Illumina Infinium II analyseprotokol (Illumina, San Diego, CA, USA). Genekspressionsprofilering blev udført på de 15 parrede prøver ved hjælp af Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST array, som indeholder 36,079 transkripter med 28,869 godt kommenterede gener (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). RNA blev fremstillet under anvendelse af Bifald WT-Amp ST System protokol, inden hybridiseringsprocessen (NuGen Technologies Inc., San Carlos, CA, USA). De arrays blev farves og scannet baseret på GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Mærkning Assay protokol, der blev skitseret af Affymetrix.

Indsendelse af microarray data til ArrayExpress database

Den rå og normaliserede microarray data blev indlæst i ArrayExpress databasen: https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress. Den ArrayExpress tiltrædelse er E-MEXP-3980.

Statistisk analyse af CNV profilering

De binære filer (.

IdaT

), der blev produceret af Illumina scanning software (Bead scan Array Reader) blev analyseret under anvendelse af Illumina Genome Studio Genotypebestemmelse Modul-version 3.2.33 (Illumina, San Diego, CA, USA) for at opnå normaliserede genotypedata. Tærsklen for genotype opkald blev fastsat til ≥90%, og den endelige rapport fra det normaliserede genotype data blev overført til en tredjepart program, Partek Genomic Suite-version 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA), til bestemme CNV profiler.

Forbundne CNV analyse blev foretaget ved sammenligning af intensiteten af ​​hver hybridiseringssignal fra en tumorprøve til den for dens matchede ikke-kræft epitel. Den genomiske segmentering algoritme blev anvendt til at påvise CNV gevinster og tab. Følgende strenge parametre blev indstillet til at reducere falsk-positive ændring: hvert segment skal indeholde mindst 10 på hinanden følgende filtrerede probesæt, en p-værdi tærskel på 0,001 i forhold til de tilstødende tilgrænsende regioner og en signal-til-støj tærskel på 0.5. Cut-off værdi for forstærkningen blev fastsat til over 2,3, medens tab blev fastsat til under 1,7. CNV blev kaldt for gevinster eller tab, der fandt sted i mindst 10% (7 prøver) af de samlede prøver. En komplet liste over alle CNV gevinster og tab indgår i tabel S1. De kromosomale placeringer af kopital gevinster og tab på de 22 autosomer er vist ved karyograms (figur 1).

Gevinster er vist med grønt og tab vises i rødt. Længden af ​​den vandrette linje svarer til antallet af prøver, der er involveret ved den respektive cytoband. De fleste af de gevinster blev fundet på den lange arm af kromosom 20, og tab blev primært observeret ved den korte arm af kromosom 8.

Statistisk analyse af genekspression profilering

Affymetrix CEL filer blev importeret til Partek Genomisk Suite 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA) for at udføre genekspression profilering analyse. Rå CEL filer blev behandlet for baggrunden korrektion og fraktil normalisering (median skalering) ved hjælp af robuste multi array gennemsnit (RMA) metode. En principal komponent analyse (PCA) plot blev frembragt som kvalitetskontrollen trin (figur 2A), og batchen virkning blev fjernet som en kilde til variation. En tre-vejs ANOVA blev udført på tværs af alle prøver. Statistisk signifikant udtrykte gener blev identificeret ved hjælp af den blandede model variansanalyse med en falsk opdagelse sats (Benjamini-Hochberg test) justeret p-værdi på ≤0.05 og fold-change værdier på -2 til 2. Hierarkisk klyngedannelse blev genereret at visualisere mønstre udtryksformer i dataene (Figur 2B). Gene ontologi berigelse analyse blev udført ved hjælp af DAVID (Database til anmærkning, Visualisering og Integration Discovery) Bioinformatik værktøjer.

(A) PCA scatter plot af CRC data. Hvert punkt repræsenterer prøve. Point farvet af gruppe status med blå repræsenterer ikke-kræft epitel og rød repræsenterer tumorvæv. (B) Hierarkisk klyngedannelse af mRNA profiler. Prøver angivet langs den vandrette akse og grupperet efter farven bar mellem dendogram og varmen kort. Blå repræsenterer ikke-kræft epitel og rød repræsenterer tumorvæv. Samlet set var der en klar adskillelse mellem ikke-kræft epitel og tumorvæv gruppe, når undersøgt af både PCA (figur 2A) og hierarkisk klyngedannelse (Figur 2B).

Integration af kopi nummer variation og genom- bred udtryk analyser

data fra CNV og genom-dækkende udtryk analyser blev analyseret individuelt. For at identificere de betydelige gener, der udstillede CNV og genekspression ændringer, vi overlappede de to datasæt, som præsenteres i Venn-diagram (figur 3A). Det kromosomale placeringer af overlappende gener mellem de to datasæt er vist i et cirkulært kort (figur 3B).

(A) Venn-diagram, der repræsenterer de fælles gener i CNV og genekspression datasæt afslørede 56 overlappende gener. (B) Cirkulær kort, der viser oversigt over CNVs og genekspression data. Kromosomer er vist i farvekodede af den ydre mest ring. Den anden ring viser fordelingen af ​​genekspressionsprofilen. (Rød indikerer opreguleret gener og grøn indikerer ned-regulerede gener). Den indre ring repræsenterer KN ændringer (rød angiver gevinst i KN og grøn betegner tab i KN). Den inderste ring viser fordelingen af ​​de to overlappende datasæt.

Sub-analyse af data fra kopi nummer variation og genom-dækkende udtryk microarray for de 15 parrede sager

Vi analyserede de data, der blev indhentet fra kopi nummer og genom-dækkende udtryk profilering af de 15 parrede prøver ved hjælp af Partek Genomisk Suite 6.6 (Partek Inc., St. Louis, MO, USA). Den genomiske segmentering algoritme blev anvendt med de parametre, der blev nævnt i kopien nummer analysen sektion. Den resulterende regneark indeholdt individuelle markører, der viste de afvigende niveauer af DNA i hver tumor i forhold til dets parrede normale. Expression data blev normaliseret til baseline og forholdene var log2-transformeret før analyse. Begge datasæt blev korreleret ved hjælp af Pearsons lineære korrelation fremgangsmåde og vi genererede et scatter plot til visning af resultaterne (figur 4A og 4B).

Scatter plots af genekspression (y-aksen) korrelere at kopiere nummer (x-akse ) med differentiale ekspression amp; CN ændring i CRC for

ARGLU1

(figur 4A) og

UGGT2 Salg (figur 4B) gener. Hver prik repræsenterer en prøve.

Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA)

For at validere CNV profilering resultater, valgte vi kromosom 20 for MLPA analysen ved hjælp af SALSA MLPA P157 20Q sonde bland ifølge fabrikantens protokol (MRC-Holland, Amsterdam, og Holland). Sonden mix indeholder 34 prober for 26 forskellige gener, der er placeret på 20Q. Fragment analyse af PCR-produkterne blev udført ved anvendelse af GeneScan-500 LIZ Size Standard på Applied Biosystems 3130 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). De fluorescens data blev indsamlet under fragment separation og importeret til Coffalyser.Net software (MRC-Holland, Amsterdam, og Holland) til analyse.

Resultater

demografiske data

af de 64 patienter, 39 (60,94%) var kvinder og 25 (39,06%) var mænd (tabel 1). Flertallet var malajer (48,44%), efterfulgt af Kinesisk (46,88%) og indianere (4,69%). Baseret på Dukes ‘klassifikation, 33 patienter (51,56%) var af Dukes’ B, 27 patienter (42,19%) var af Dukes ‘C og 4 patienter (6,25%) var af Dukes’ A. Den gennemsnitlige alder var 56 ± 13,35 år.

Kopier nummer gevinster blev hyppigt fundet i q arm af kromosom 20

af de 8722 genomiske segmenter i alle prøver, vi indsnævret vores analyse til 2212 CNV regioner, svarede til de autosomer der viste amplifikationer (tabel S1). De CNVs var spredt over kromosom 1 til 22 med den højeste forstærkning findes i kromosom 20, som havde 388 segmenter, der repræsenterede 17,5% af alle gevinster. Det næsthøjeste antal gevinster blev dokumenteret på kromosom 7, med 369 genomiske segmenter, efterfulgt af kromosom 8, med 338 genomiske segmenter. Den længste længde for de CNV gain segmenter var mellem 8q22.1 og 8q22.2 svarende til 4.070.488 bp. I alt 1.638 gener blev amplificeret i alle prøver og 765 af disse var unikt eller ikke-redundante gener. Cytoband 20q12 havde den højeste frekvens af gevinster, der involverer mindst 45,31% af tumor prøver. Otte gener blev identificeret på dette locus og tre af dem, nemlig

PTPRT

,

CHD6

EMILIN3

, er blevet beskrevet tidligere i kolorektal cancer. Figur 1 viser fordelingen af ​​disse gener på kromosom 20, med gevinster vist i grøn. Nærmere oplysninger om de 10 væsentlige gener ifølge RefSeq databasen er angivet i tabel 2.

Kopier nummer tab blev primært fundet i p arm af kromosom 8

En sletning eller tab kopi talværdi mindre end 1,7 blev observeret i hele kromosom 1 til 22 autosomer, med den opdages på kromosom 8 flertal som havde 225 CNV ramt segmenter. Den specifikke region for de tab, blev observeret ved position 8p23.3 med 17,9% forekomst i alle tumorprøver. Den næsthøjeste frekvens af underskud blev påvist i kromosom 17, med 213 genomiske segmenter, efterfulgt af kromosom 19, med 184 genomiske segmenter. Den længste tab af et genomisk segment var på 8p23.1 til 8p22, som bestod af 3.093.282 bp. Vi identificerede kun 14 unikke eller ikke-redundante gener (tabel 3). Analyse af de enkelte gener i kromosom 8 viste, at kun 5 af generne tidligere blev rapporteret at være relateret til CRC; disse gener var

CSMD1

,

DLC1

,

TUSC3

,

SGCZ

og

LONRF1

. Fordelingen af ​​tabene, vist med rødt, kan observeres i karyotype diagram som vist i figur 1.

Analyse af genekspression profilering

Analyse afslørede signifikante forskelle i genekspression mellem den primære tumor og ikke-kræft epiteliale prøver. Klassifikation af PCA viste en klar adskillelse af to markante grupper efter den vævstype (figur 2A). I alt 1408 gener blev differentielt udtrykt af mindst to gange med statistisk signifikans (p 0,05). Imidlertid er et enkelt gen er repræsenteret ved flere probe sæt kaldet “søskende sonder ‘i Affymetrix GeneChip. Derfor blev alle overflødige probesæt filtreret, hvilket efterlod 1191 unikke gener til yderligere analyse. Af disse blev 584 gener fundet at være opreguleret mens en anden 607 gener viste sig at være nedreguleret. De fleste af de opregulerede gener blev fundet i kromosomer 7 (n = 48, 8,22%), 2 (n = 44, 7,53%) og 12 (n = 42, 7,19%). Down-regulerede gener blev fortrinsvis placeret på kromosom 1 (n = 73, 12%), 2 (n = 44, 7,25%), 3 og 4 (n = 43, 7,08%). Blandt de op-regulerede gener var

MYC

,

CD44

,

ABC22

,

TIMP1

, og

BIRC5

, mens down-regulerede gener inkluderet

FAS

,

KLF4

,

UGTIA1

og

CA2

. En komplet liste over de differentielt udtrykte gener og deres tilsvarende fold-ændringer i udtryk og p-værdier er angivet i tabel S2. Hierarkisk klyngedannelse blev genereret og visualiseret via et zonekort, hvor to markante ekspressionsmønstre kan observeres (figur 2B). Den funktionelle karakterisering af de betydelige gener blev udført under anvendelse af GO analyse, og de blev fundet at være fordelt gennem de fem klasser, som omfattede cellecyklus, celledeling, kromosom segregering, nukleosid bindende og ATP-binding (p 0,05).

Effekt af CNV på ekspressionen af ​​kolorektal cancer-relaterede gener

Integration af de to profilering datasæt viste 56 overlappende gener (figur 3A og 3B), og en fuldstændig liste over disse overlappende gener er præsenteret i tabel S3. blev observeret i alt 1.135 gener med kun genekspression ændringer og 723 gener med CNV ændringer, men ingen ændringer i transkriptniveauer. Integration af CNV og genekspression analyser viste en positiv sammenhæng i 48 gener (85,7%) og en negativ sammenhæng i de resterende 8 gener (14,3%) (tabel 4).

For yderligere at forstå yderligere biologiske funktion af disse gener, blev de 56 gener underkastes funktionel annotation og klassificering analyse under anvendelse DAVID v6.7. Vi fandt generne at være relateret til biologiske processer og cellulære komponenter.

Disse gener blev yderligere kortlagt til den Kegg pathway databasen for at afgøre eventuelle vekselvirkninger med kandidat onkogener eller tumorsuppressorgener, som blev identificeret ved CNV og ekspressionen array. Analysen viste, at cellecyklus var den mest markant beriget vej og

Cdc25B

,

PCNA-

og

p107 /RBL1

var nøglen, involverede gener (figur 5).

Cell cyklus blev fundet at være den mest betydningsfulde beriget pathway (p 0,05). Gener involveret (

Cdc25B, PCNA og p107 /RBL1

) vist i rød farve rubrik anføres de gener til at have gevinst i KN og øget udtryk.

Korrelation af CNV med gen udtryk for kolorektal cancer-relaterede gener på en delmængde af 15 parrede prøver

for at bestemme forholdet mellem DNA-kopi nummer og genekspression, vi anvendte Pearsons lineære korrelation model (figur 4A 4B). Korrelationsværdierne fandtes mellem -0,85 til 0,89. Ved hjælp af en cut-off af p 0,05, viste 2159 gener signifikante korrelationer mellem kopital og genekspression. I alt 914 udskrifter fra 616 gener viste en god korrelation (r 0,6) mellem antal kopier og genekspression. De top fem-korrelerede gener var

ARGLU1

,

UGGT2

,

CES2

,

FUT10

PAOX

. En komplet liste over de korrelerede gener med deres Pearsons korrelation og p-værdier, kan ses i tabel S4.

Validering af CNV profilering ved hjælp MLPA

Vi udførte MLPA analysen og målrettet 26 gener i 150 prøver (50 normale væv og 100 tumorer) at validere CNV profilering data. Vi valgte prober som dækkede q arm af kromosom 20, og resultaterne blev betragtet som acceptabel, hvis top kontrollen faldt inden for området fra 0,8 til 1,2. En sletning blev scoret, hvis middelværdien dosering af testen med de interne kontrolsystemer toppene var mindre end 0,7, og dobbeltarbejde blev scoret hvis middelværdien dosis var 1,3 eller større. En normal referenceprøve viste ingen kopital ændringer i nogen af ​​generne, og MLPA analyse viste, at kopiantal forstærkning er blevet fundet i alle seksogtyve testede gener. Tabel 5 sammenfatter MLPA analyse med middelværdierne for hvert gen.

Diskussion

Vi udførte en integreret analyse ved hjælp af flere datasæt i kolorektale væv til at identificere de differentielt udtrykte gener med ændringer i genomiske segmenter. Vi analyserede CNVs og genekspression profilering i 64 parret og 15 parrede CRC væv hhv. Brugen af ​​tilstødende ikke-kræft væv fra det samme individ reducerede de variationer, der blev forårsaget af inter-individuel heterogenitet.

Den foreliggende undersøgelse identificerede en række fokale genomiske gevinster og tab i CRC, der viste nogle af overensstemmelse med resultaterne fra tidligere undersøgelser [20], [21], [22]. Individuel analyse af CNV datasættet afsløret betydelige gevinster i kromosomet 20q, der var også meget i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser [23], [24]. Lignende gevinster var også blevet observeret i brystkræft og primær gastrisk kræft [25]. Cytoband 20q12 viste den højeste frekvens af gevinster, som strakte sig fra 39.239.931 til 41.684.451 bp med inddragelse af otte gener, herunder

PTPRT

,

CHD6

,

EMILIN3

,

LPIN3

,

PLCG1

,

TOP1

,

ZHX3

og

MAFB

. Af de otte gener,

TOP1

,

PLCG1

og

PTPRT

var relateret til CRC.

topoisomerase 1 (

TOP1

) er et onkogen, som katalyserer afviklingen af ​​DNA og skaber enkeltstrengede molekyler, som er nødvendige i talrige biologiske processer, såsom DNA-replikation, transkription og DNA-reparation [26]. En undersøgelse af

TOP1

hjælp vifte CGH fundet gevinster i sin kopi nummer i CRC prøver [9]. Et øget antal kopier af

TOP1

blev også påvist i fase III CRC patienter med et gennemsnit på fire gen kopier for hver celle ved hjælp af en fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) metode [27], [28].

andet gen, der var relateret til CRC identificeret i denne undersøgelse var phospholipase C-y-1 (

PLCG1

), som er et signalmolekyle og er et tilstødende gen af ​​

TOP1

.

PLCG1

aktiveres som reaktion på vækst faktor stimulation og er involveret i reguleringen af ​​en række cellulære funktioner, såsom celle migration, invasion og metastase [29], [30], [31].

proteintyrosinphosphatase receptor-T (

PTPRT

) ligger inden for den forstærkede region 20q12 mellem 39.344.635-41.684.451 bp. Det er et tumorsuppressorgen og er blevet vist at spille integrerede roller i celleadhæsion og intracellulær signalering [32]. Gevinst på kopi nummer involverer

PTPRT

gen er blevet identificeret i en tidligere undersøgelse om æggestokkene klar celle karcinom ved hjælp vifte CGH [33]. Gevinsten i kopi antal af dette gen kan være et resultat af den “passager gen” effekt, fordi vi ikke kunne opdage eventuelle ændringer i genekspression.

Andre betydeligt forstærkede cytobands i q arm af kromosom 20 kodet veletablerede onkogener, der var forbundet med CRC, og disse omfattede 20q11.21 (

BCL2L1

), 20q13.2-20q13.31 (

AURKA

), 20q11.23 (

SRC

CTNNBL1

), 20q11.21-20q11.22 (

DNMT3B

) og 20q11.22 (

DYNLRB1

). Disse fund tyder på det vigtige inddragelse af flere kandidatgener inden den lange arm af kromosom 20 i cancerudvikling og progression. Den MLPA synes at være en pålidelig og effektiv metode til at evaluere DNA-kopi nummer ændrer fordi størstedelen af ​​disse testede gener afslørede overensstemmelse med de i microarray resultater.

Kopiér nummer tab blev fortrinsvis findes på p arm af kromosom 8. højeste tab blev fundet ved cytoband 8p23.2 4.008.230 til 4.027.339 bp. Blandt de gener, der bor på dette område er CUB og Sushi flere domæner 1-genet (

CSMD1

), som er et tumorsuppressorgen, som koder for flere domæne supplerer lovgivningsmæssige og vedhæftning protein. Focal kopital tab af

CSMD1

genet er blevet observeret i CRC [34], brystcancer [35] og gastrisk cancer [36], og nedsat niveau af

CSMD1

ekspression blev rapporteret til være signifikant associeret med high-tumor kvalitet og reduceret samlet overlevelse i en brystkræft undersøgelse [37]. En anden region, der blev bemærket at udstille kopi nummer tab, der blev identificeret i denne undersøgelse blev cytoband 8p23.1-p22, der omfattede en region, der er omfattet 12.601.480-15.694.761 bp. Et gen, der er placeret i denne region er deleteret i leverkræft 1 (

DLC1

), som blev rapporteret at være et tumorsuppressorgen og har vist sig at undergå kopital tab i flere kræftformer, såsom hepatocellulært karcinom og brystkræft [38], [39].

Vi gjorde en sub-analyse af 15 parrede prøver af CRC til at vurdere forholdet mellem kopi nummer ændringer og genekspression. Gener involveret i CRC, såsom

MYC

(v-myc aviær myelocytomatosis viral onkogen homolog) [40]

CCNB1

(cyklin B1) [41] og

PLK1

( polo-like kinase 1) [42], var opreguleret og samstemmende amplificeret i kopiantal i vores undersøgelse. Syv gener viste sig at blive nedreguleret med tab i kopi nummer, men kun to gener,

MUC17

(mucin 7) [43] og

CES

(carboxylesterase 2) [44] har været vist sig at være relateret til CRC.

Integreret analyse ved hjælp af et Venn-diagram viste, at 85,7% af gener haft en positiv association. Når mappet til Kegg sti, blev cellecyklus identificeret som den mest markant beriget vej (p 0,05). Cellecyklussen er en kritisk regulator af celleproliferation, og vækst og celledeling efter DNA beskadigelse. Cellecyklus pathway er primært drevet af cyklin-afhængige kinase (CDK’er) familie og deres regulerende underenheder, cyclinerne. Cellecyklussen har fire faser og de to store checkpoints ved G1-S og G2-M overgange at opretholde den korrekte rækkefølge af begivenheder [45]. Tabet af cellecyklus checkpoint kontrollen fremmer genetisk ustabilitet, hvilket fører til ukontrolleret celleproliferation og kunne fremme udviklingen af ​​kræft [46].

celledelingscyklussen 25B (

Cdc25B

) er et medlem af celledelingscyklussen (CDC) phosphatase familie, der fungerer som aktivatorer af CDK’er og cyclin-komplekser til at regulere fremadskriden af ​​cellecyklus [47].

Cdc25B

er ansvarlig for den indledende dephosphoryleringen og aktivering af CDK’er, dermed indlede sekvens af begivenheder, der fører til indtræden i mitose [48], [49]. Over-ekspression af

Cdc25B

er blevet observeret hos 43% af CRC patienter og er korreleret med dårlig prognose [50]. Øget

Cdc25B

niveau er tilstrækkeligt til at forringe DNA skade checkpoints, hvilket igen, øger spontan mutagenese og forstyrrer trådte i mitose [51], [52], [53].

prolifererende celle nuklear antigen (

PCNA

) blev rapporteret at være essentiel for DNA-replikation, DNA-reparation og cellecyklus regulering [54]. Retinoblastom-lignende 1 (

p107 /RBL1

) er medlem af retinoblastomgenet familie (RB), og generne i denne familie er blevet identificeret som tumorsuppressorer. RBL1 og andre RB proteiner samarbejder til at regulere cellecyklusprogression via G1-fasen af ​​cellecyklussen [55]. Men den mekanisme for PCNA og RBL1 involvering i cellecyklus vej af CRC er stadig uklart og kræver yderligere udforskning.

Vi har også fundet gener med negative associationer mellem kopi nummer og genekspressionsniveauer. Generne omfatter

BCAS1

,

EDN3

,

FABP4

,

MATN2

,

SDCBP2

,

SPTLC3

,

TRPA1

WFDC2

. Dette paradoks af en negativ sammenhæng mellem kopi nummer status og genekspression er også blevet observeret i en tidligere undersøgelse om CRC [56], og kan tilskrives de mange mekanismer, der er ansvarlige for normal og unormal kontrol af genekspression, herunder dem, der vedrører mutation, promoter methylering og miRNA udtryk [57]. For at forstå dette fænomen, en tilgang med dyb sekventering teknologi vil mest sandsynligt nok give et svar på disse uventede resultater.

Som konklusion, ved at integrere datasæt fra to forskellige profilering undersøgelser, vi med succes identificeret 56 overlappende gener med ændringer i antal kopier og genekspression. Cellecyklussen blev identificeret som den centrale signalvejen fra dette integrerede analyse. er imidlertid fremtidige undersøgelser er nødvendige for at fastslå virkningen af ​​disse gener på udfaldet af sygdommen.

Støtte Information

Tabel S1. .

Fuld oplysninger på eksemplar nummer variation profil af 64 patienter med tarmkræft

doi: 10,1371 /journal.pone.0092553.s001

(XLSX)

tabel S2. .

Alle oplysninger om genekspression profil 15 kolorektal kræftpatienter

doi: 10,1371 /journal.pone.0092553.s002

(XLSX)

tabel S3.