PLoS ONE: Twisted Epithelial-til-Mesenchymale Transition Fremmer Progression af Surviving Blærekræft T24 Celler med hTERT-dysfunktion

Abstrakt

Baggrund

Humane cancerceller opretholde telomerer at beskytte celler fra degeneration gennem telomerase-aktivitet (TA) eller alternative forlængelse af telomerer (ALT) i forskellige celletyper. Desuden kan cellulær senescens omgås ved Epithelial-til-mesenchymal overgang (EMT) under cancer progression i forskellige faste tumorer. Det har imidlertid ikke blevet belyst karakteristika telomer vedligeholdelse og progression evne efter lang tids kultur i blærekræft T24 celler med hTERT dysfunktion.

Metode /vigtigste resultater

I denne undersøgelse af ved anvendelse af en dominant negativ mutant human telomerase revers transkriptase (hTERT) vektor for at inhibere TA i blærekræft T24 celler observerede vi udseendet af lange fænotype af telomer længde og ALT-associerede PML legeme (APB) komplekset efter 27

th passage, hvilket indikerer forekomsten af ​​ALT-lignende vej hos overlevende T24 /DN868A celler med telomerase-inhibering. I mellemtiden telomerase inhibering resulterede i signifikant EMT som vist ved ændringer i cellemorfologi samtidig med variation af EMT-markører. Konsekvent, viste de overlevende T24 /DN868A celler øget progression evne

in vitro

in vivo

. Derudover fandt vi Twist blev aktiveret at mægle EMT i at overleve T24 /DN868A prøver.

Konklusioner /Betydning

Tilsammen vores resultater viser, at blærekræft T24 celler kan undergå den telomerase-til -ALT-lignende konvertering og fremme kræft progression på fremskredne stadier ved at fremme EMT, hvilket giver nye mulig indsigt i den mekanisme af resistens over for telomerase-hæmmere i kræftbehandlingen

Henvisning:. Xue Y, Li L, Zhang D, Wu K, Chen Y, Zeng J, et al. (2011) Twisted Epithelial-til-Mesenchymale Transition Fremmer Progression af Surviving Blærekræft T24 Celler med hTERT-dysfunktion. PLoS ONE 6 (11): e27748. doi: 10,1371 /journal.pone.0027748

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: Juli 12, 2011; Accepteret: 24 Oktober 2011; Udgivet 15. november, 2011

Copyright: © 2011 Xue et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af programmet for The National Natural Science Foundation of China (NSFC NO. 30.772.163). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

stabiliseringen af ​​telomer er kritisk for den uendelige cellulær proliferation, som er nødvendig for tumordannelse [1]. Mindst to mekanismer er blevet identificeret til at opretholde telomer homeostase i celler

in vivo

samt

in vitro

. Første, de fleste carcinomceller udnytte telomerase, et multi-subunit cellulær ribonukleoprotein enzym (omtalt som et telomerase pathway), at tilføje telomere gentagelser på kromosom ender [2]. Telomerase er sammensat af et RNA-underenhed, telomerase-associeret protein 1, og katalysatoren telomerase revers transkriptase (hTERT), som er en begrænsende komponent i reguleringen af ​​aktiviteten af ​​telomerase [3]. Sekund, sarcomaceller udnytte en telomerase-uafhængig mekanisme betegnes alternativ forlængelse af telomerer (dvs. ALT pathway) for at opretholde kromosom termini [4]. Indtræden af ​​ALT bestemmes ved fremkomsten af ​​lange, heterogene telomer længde, og fremkomsten af ​​ALT-associeret promyelocytisk leukæmi organer (APBs) i ca. 10% af interfase cellekerner [5].

Tidligere rapporter har indikeret at telomerase og ALT mekanismen kunne sameksistere i nogle tumorer [4], [6]. Endvidere har en reversibel omdannelse af telomerase-positive for telomerase-negative celler blevet rapporteret i tilfælde af human papillomavirus type 16 E6-udødeliggjort fibroblaster [7]. I betragtning af vigtigheden af ​​telomerase i celle immortalisering og manglende telomerase-ekspression i de fleste normale somatiske celler, telomerase-inhibitorer holdt meget lovende til cancerterapi i fortiden [8]. Men muligheden for aktivering af ALT, som er resistent over for telomerase-inhibitorer komplicerer denne situation [9]. Det er velkendt, at ALT bibringer egenskaber end telomerase om kræft malignitet. I tilfælde af glioblastoma multiforme, ALT korreleret med en bedre patient prognose [10], mens en dårlig prognose blev påvist hos patienter med liposarkom [11]. Årsagen til forskellen i kræft malignitet stadig undvigende.

Udover telomer vedligeholdelse, erhvervelse af en fuldt maligne fænotype omfatter også kravet om metastaser. Epithelial-til-mesenchymal overgang (EMT) spiller en vigtig rolle i progressionen af ​​primære tumorer mod for at metastaser [12]. Nylige observationer tyder på, at EMT og celle degeneration krydses i kræft progression [13]. Flere forskellige transkriptionsfaktorer, som har vist sig at være i stand til at inducere EMT-programmer, såsom Twist og ZEB1, kan også beskytte celler fra degeneration induceret af de

ras

onkogen [14], [15].

i dette arbejde, brugte vi en dominerende negativ mutant af hTERT til konstitutivt inaktivere telomerase-aktivitet (TA) i blærekræft T24 celler. Vores data viser, at lange telomer længde og APBs kompleks uden opregulering af TA kan opstå under længerevarende kultur i blære kræftceller

in vitro

. Påfaldende, blev en krydsning mellem EMT og telomer vedligeholdelse vej observeret samtidig med øget progression evne. Endvidere Twist blev aktiveret til at inducere EMT. Sammenfattende beskriver vi en ny mekanisme i erhvervelsen af ​​invasive funktioner og telomer homeostase efter telomerase hæmning i blærekræft T24 celler, hvilket giver indsigt i resistens efter telomerase hæmning i blærekræft.

Metoder

Etik Statement

Alle eksperimenter på dyr i overensstemmelse med den

retningslinjer for Animal Care

af Xian Jiaotong Universitet og godkendt af Etisk Review Board (ERB) udvalg (The First Affiliated Sygehus af Medical College, Xian Jiaotong Universitet, Kina), og godkendelsen ID etik bord er SCXK2007-0005.

Antistoffer

Antistoffer mod PML, TRF2, N-cad, vimentin , Cytokeratin-18, 19 (CK-18, CK-19), Matrixmetalloproteinaser-2 (MMP-2) og Twist var fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA).

Cell kultur

Den humane blærecancer-cellelinie T24 og osteosarcomcellelinie U

2os blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles Medium (GIBCO, Grand Island, NY) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS , Holly blade, Hangzhou, Kina) ved 37 ° C med 5% CO

2 i en fugtig inkubator.

Etablering af hTERT

DN868A Stabil celler og forbigående Twist transfektion

dominant negativ mutant konstrukt af hTERT (PCI-neo-hTERT

DN868A) blev verificeret ved sekventering før transfektion i dyrkede T24-celler. siRNA til Twist designet og syntetiseret af Invitrogen (Shanghai, Kina). Sekvensen for siTwist var: sense 5′-CACCGGACAAGCUGAGCAAGAUUCACGAAUGAAUCU UGCUCAGCUUGUCC-3 ‘; antisense 5’-AAAAGGACAAGCUGAGCAAGAUUCA UUCGUGAAUCUUGCUCAGCUUGUCC-3 ‘. Transfektion blev udført ved anvendelse LipofectAMINE 2000 (Invitrogen, Inc., Gaithersburg, VA) ifølge producentens protokol. Stabile transfektanter blev selekteret med 300 ug /ml G418 (Merck, Darmstadt, Tyskland).

telomeraseaktivitet Assay

Telomerase-aktivitet blev målt ved anvendelse af et TRAP-PCR-ELISA assay kit ifølge producentens instruktioner (Roche, Basel, Schweiz). Kort fortalt blev 2 × 10

5-celler suspenderet med lysepuffer, og en tilsvarende mængde af nukleare supernatant blev anvendt som en fælde skabelon til PCR-reaktion. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 25 ° C i 30 minutter, og derefter PCR blev amplificeret i 35 cykler ved 94 ° C i 30 s sekunder og 59 ° C i 60 sekunder. Derefter produkt blev blandet med en hybridiseringsopløsning og inkuberet ved 37 ° C i 1 time, efterfulgt af vask og inkubering i 30 minutter. Den blev derefter chromogenized og blev detekteret absorbansen. Salg

TRF analyse

DNA blev ekstraheret under anvendelse af et DNA-isolering kit (Roche, Basel, Schweiz) og alikvoter (2 ug) fordøjet 2 timer med restriktionsenzymer

RSA

I og

Hinf

I. Fordøjede DNA-fragmenter blev separeret i 0,8% agarosegeler og blottet på positivt ladede nylonmembraner. Telomer restriktionsfragmenter blev åbenbaret gennem hybridisering med DIG-mærket telomer sonde og kemiluminescensdetektion.

Q-FISH for cytogenetisk analyse

Kromosomer fra colcemid anholdelse celler blev forberedt og fulgt en standard Q-FISH teknik [16] ved hjælp af telomer PNA FISH /FITC kit (Dako Cytomation, USA). Kort fortalt blev løsnede celler behandlet med 50 mmol /l KCI og fastgøres ved hjælp af 03:01 methanol /iseddike; derefter objektglas blev fremstillet. Telomer blev detekteret under anvendelse af et FITC-konjugeret peptidnukleinsyre (PNA) probe og modfarvet med DAPI. Digitale billeder blev taget til fange under konfokal mikroskopi på 60 × eller 120 × mål.

Dobbelt Immunofluorescens

Celler blev dyrket på dækglas og fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA). Efter vask med PBS blev cellerne permeabiliseret under anvendelse af 0,1% Triton X-100 opløsning og blokeret med 10% æsel serum. Efter inkubering med de primære antistoffer PML og TRF2, blev de inkuberet med de fluorescensmærkede sekundære antistoffer Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555/568 (Invitrogen). Billeder blev indsamlet under konfokal mikroskopi og behandles ved hjælp af Adobe Photoshop 7.0.

Western blotting

Western blotting blev udført som tidligere [17] beskrevet. Kort beskrevet blev prøverne analyseret ved 12% SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembraner og probet med de primære antistoffer og sekundære antistoffer koblet til peberrodsperoxidase, derefter detekteret af ECL kemiluminescerende påvisningssystem (Amersham, Piscataway, NJ).

invasion og migration assay

invasion og migration evne T24 celler blev bestemt af Transwell assay. For invasionen assayet blev 50 pi Matrigel (Sigma, Inc.) anvendes til 8 um-pore-size polycarbonat-membranfiltre (Corning, Inc., Corning, NY), det nederste kammer af apparatet indeholdende DMEM med 20% FBS . 5 × 10

3 T24, T24 /PCI, og de 32

nd passage af T24 /DN868A (defineret som overlevende T24 /DN868A i følgende undersøgelse) celler blev podet med et serumfrit medium, og derefter inkuberet i 48 timer ved 37 ° C. Efter inkubation blev den invaderede celler fastgjort til den nedre overflade af membranen fastsat ved 4% paraformaldehyd og farvet med Giemsa. Celleantal blev talt i tre tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter (10 ×) pr membran. Migrationen assay blev udført som beskrevet for invasionen assay uden coating af Matrigel.

Adhæsion assay

Matrigel var fortyndet med serumfrit DMEM ved 1:20, og coatet på bunden af 96-brønds plade. 1 × 10

4-celler var høsten og podet i 96-brønds plade med serum-frit medium og fik lov til at knytte til Matrigel. Efter 6 timer blev medium med ikke-bundne celler fjernet og MTT blev tilsat. 4 timers inkubation senere, DMSO blev tilsat for at opløseliggøre formazankrystallerne og absorbansen (OD) ved 590 nm blev målt.

blød agar-kolonidannelse Assay

kolonidannelse assayet blev udført som tidligere beskrevet [18]. Kort fortalt blev i alt 500 celler suspenderet i 2 ml DMEM indeholdende 0,3% lavtsmeltende agar og overliggende 2 ml basislaget bestod af 2 x DMEM og 1,2% agar (01:01 blandet) i seks-brønds plader. Efter inkubering ved 37 ° C med 5% CO

2 i en befugtet inkubator i 14 d, kolonier mere end 50 celler blev talt.

Tumorigenicitet Assay

i Vivo

Fire til seks uger gamle nøgen athymiske BALB /C mus (Shanghai Experimental Animal center, Shanghai, Kina) blev anvendt til tumorigenicitet analysen. Celler blev høstet, vasket og resuspenderet i serum-frit DMEM i en koncentration på 1 × 10

7 celler /ml og 1 x 10

6 celler blev injiceret subkutant. Musene blev aflivet efter 8 uger for at måle tumorens vægt. Immunhistokemisk farvning blev udført som tidligere beskrevet [19].

Statistical Analysis

Alle data analyser blev udført af softwaren SPSS 13.0 for Windows.

P

. 0,05 blev betragtet som tærskelværdien for statistisk signifikans

Resultater

Telomerase-aktivitet i T24 celle-klon udtrykker dominant-negative (DN) hTERT

for at konstitutivt inaktivere hTERT blev den menneskelige blærekræft cellelinje T24 med høj TA transficeret med et plasmid, som koder DN-hTERT eller tom vektor PCI, og individuelle celle kloner blev isoleret ved G418 screening for 7 uger. TRAP-PCR-ELISA-analyse viste, at i T24 /DN868A celler på 3

rd passage blev TA kraftigt reduceret i forhold til forældrenes celler (fig. 1). Tre kloner med nedsat TA blev screenet og betegnet som T24 /DN868A (M1~3). De tomme vektor-transficerede kontrolceller blev betegnet T24 /PCI.

Telomerase-aktivitet (TA) i T24-celler transficeret med forskellige konstruktioner blev bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder (*

P

b) T24; c) T24 /PCI; d~f) T24 /DN868A subkloner af 8

th, 24

th, og 27

th passager, henholdsvis; g og h) T24 /DN868A subkloner af 29

th og 32

nd passage henholdsvis (120 ×). C. TA af celler på hvert tidspunkt når blev gjort analyse telomer længde. Histogrammer er repræsentative for TA i T24 /DN868A versus parental cellelinje.

Desuden har vi farves de metafasiske kromosomer i T24 /DN868A celler med et telomert PNA probe, og sammenlignede dem med dem, forældre- eller kontrol celler på samme passage. Den osteosarcomcellelinie U

2os blev anvendt som en ALT-positiv kontrol (fig. 2B a) [20]. Fig. 2B viser Q-FISH-analyse af en af ​​klonerne. De meget intense grønne signaler ved udgangen af ​​kromosom svarede til de lange telomerer. En påviselige telomer FISH signal kunne ses på næsten hvert kromosom ende og i de fleste kerner i en anden passage af forældrenes T24 celler eller kontrol celler T24 /PCI; Endvidere er intensiteten af ​​disse signaler i begge to celler var konsistent (fig. 2B b~c). Efter telomerase inhibering, selv om intensiteten af ​​det grønne signal ved hver ende af kromosom eller i kerner stemte overens med den tidligere passage af T24 /DN868A, telomeren signaler faldt gradvist med hver runde af celledeling indtil 27

th passage , på hvilket tidspunkt, den samlede intensitet af det fluorescerende signal var lavest (fig. 2B d~f). Efter denne passage blev signaler med forskellig intensitet repræsenterer heterogene telomerlængde ses i slutningen af ​​nogle kromosomer i T24 /DN868A celler (Fig. 2B g~h). For de andre to testede T24 /DN868A kloner, der udtrykker DN hTERT, viste både stærk telomerase inhibering, men kun én (T24 /DN868A-M3) vises længde udsving telomer som fig. 2A og B, mens den anden (T24 /DN868A-M2) gik til celledød og tab af kulturen ved 16

th passage.

For at analysere beskaffenheden af ​​telomer forlængelses begivenheder, undersøgte vi TA på hvert tidspunkt når Q-FISH blev gjort i disse to levedygtige cellekloner. Hæmning af TA ved DN hTERT var robust og træk (op til 32

nd passage), og blev observeret den samme lave niveau af TA hinanden i T24 /DN868A celler (Fig. 2C). Det er derfor usandsynligt, at den resterende telomerase er årsag til den observerede telomer forlængelse.

APBs status i T24 celle-klon udtrykker DN hTERT

APBs kompleks er en delmængde af promyelocytleukæmi (PML) organer indeholdende telomere DNA og telomer-bindende proteiner, såsom TRF1 og TRF2. APBs kan spille en integrerende rolle i ALT mekanismen, og findes ikke i dødelige eller telomerase-positive celler [21]. Derfor detekteres vi tilstedeværelsen af ​​APBs ved co-lokalisering af PML med TRF2 i forskellige T24-celler ved forskellige passager i forhold til osteosarcomcellelinie U

2os. Som vist i fig. 3, kunne ikke påvises co-lokalisering af PML med TRF2 i forældrenes T24, T24 /PCI celler, eller tidligere passager i T24 /DN868A celler. Men i 29

th passage af T24 /DN868A celler, de gule funkler repræsenterer APBs var klart observeret hos nogle T24 /DN868A celler. Endvidere blev en stigning i det samlede antal APBs observeret i 32

nd passage af T24 /DN868A celler. Disse resultater indikerer kraftigt tilstedeværelsen af ​​en ALT-lignende mekanisme af telomer stabilisering i subklon af T24 /DN868A celler fra 29

th passage. For at skelne den sene passage af T24 /DN868A celler med karakteristika af ALT-lignende fra tidligere passage, alle T24 /DN868A celler efter den 29

th passage blev kaldt som overlevende T24 /DN868A celler. En af hver overlevende celleklon på 32

nd passage blev tilfældigt anvendt til følgende undersøgelse.

Dobbelt immunfluorescensanalyse for APBs i hTERT-inaktiveret T24 på forskellige passager. Røde pletter repræsenterer PML, grønne pletter repræsenterer TRF2, og gule funkler angiver colocalizaiton af PML med TRF2. APBs var fraværende i T24, T24 /PCI, og tidligere passage af T24 /DN868A celler, men til stede i T24 /DN868A celler ved 29

th og 32

nd passage (60 ×).

Induktion af EMT i T24-celler med telomerase inhibering

T24 er en E-cadherin deficient cellelinie, som endnu udviser en epitelial morfologi [22]. Under langvarig kultur, fandt vi, at T24-celler med telomerase inhibering gradvist udviste en spindel-formet, mere langstrakt morfologi og løse intercellulære junctions fra 25

th passage mens T24 eller T24 /PCI-celler var stadig polyhedralt og voksede i en tæt tilsluttet måde, der foreslog, at cellerne kan have været underkastet EMT (fig. 4A). For at teste dette, detaljeret molekylær karakterisering af EMT markører af T24, T24 /PCI, og anderledes passage af T24 /DN868A celler (herunder 25

th, 27

th, og 32

nd passage) blev opdaget af Western-blot. Faktisk observerede vi tabet af epiteliale markører herunder CK18 og CK19 og forøgede niveauer af mesenchymale markører og invasion-relaterede proteiner, såsom N-cadherin, vimentin, og MMP-2 i T24 /DN868A celler fra 25

th passage (Fig . 4B).

A. cellemorfologi af T24, T24 /PCI og T24 /DN868A celler blev observeret under et fase-kontrast mikroskopi (20 ×). Cellemorfologi ændret fra polygonal, epithelial struktur (øverst) til spindel-lignende, mesenkymale struktur (ned). B. Western blot-analyse af N-Cadherin, vimentin, MMP-2, CK18 og CK19 niveauer i T24, T24 /PCI, og forskellige passage af T24 /DN868A celler. GAPDH blev anvendt som en belastning kontrol.

Nedsat friktion, øget migration, invasion, og kolonidannelse af overlevende T24 /DN868A celler

in vitro

For at undersøge den potentielle inddragelse af telomer vedligeholdelse og EMT i tumor udvikling, vi brugte overlevende T24 /DN868A celler som en model til at undersøge deres cellulære adfærd efter denne konvertering. Transwell assay Resultaterne viste, at både migration og invasive potentiale af overlevende T24 /DN868A celler betydeligt blev steget i forhold til forældre eller kontrol-celler (Fig. 5A).

A. Transwell assay for celle invasion og potentiel migration blev udført. B. Adhæsion assay for klæbende evne blev bestemt. C. blød agar-kolonidannelse assayet blev udført. (*

P

0,05, sammenlignet med kontrolceller).

adhæsion assay Matrigel blev anvendt til at belægge 96-brønds plade til at efterligne den ekstracellulære matrix (ECM) . O.D. værdi på vegne af selvklæbende celler viste, at den klæbende kapacitet af overlevende T24 /DN868A celle til Matrigel markant blev reduceret (fig. 5B).

Vi nærmere virkningen af ​​denne konvertering på clonogenicity af T24 celler. Som forventet blød agar-assay viste, at overlevende T24 /DN868A celler tydeligt dannet flere og større kolonier end den parentale T24 og styre T24 /PCI-celler (fig. 5C).

Øget tumorigenese af overlevende T24 /DN868A celler

in vivo

det er tidligere blevet vist, at ALT vej ikke erstatte telomerase i processen med tumorigenese

in vivo

[23]; derfor, vi etablerede tumoren xenograft ved subkutan injektion af 1 x 10

6 T24, T24 /PCI, eller overlevende T24 /DN868A celler i 6-8 uger gamle nøgne mus (n = 4 mus pr gruppe). De tumorprøver blev yderligere analyseret ved H 0,001 sammenlignet med T24 og T24 /PCI celler). B. Repræsentative tumorer isoleret fra T24, T24 /PCI, og overlevende T24 /DN868A-injicerede nøgne mus. C. HE og immunhistokemisk farvning af EMT markører i tumorer afledt af T24, T24 /PCI, og overlevende T24 /DN868A celler, henholdsvis (40 ×).

Histologisk farvning viste, at tumorer stammer fra overlevende T24 /DN868A celler blev snorlignende og mere aggressiv mens tumorer afledt af T24 eller T24 /PCI-celler blev afrundet og mindre ondartet (fig. 6C). For yderligere at bekræfte, at overlevende T24 /DN868A celler undergik EMT

in vivo

, blev immunhistokemisk undersøgelse udført i tumor prøver fra nøgne mus. Som resultat forøgede niveauer af N-cadherin og vimentin i kernen og cytoplasmaet samt reducerede niveauer af CK18 og CK19 mellem celle grænseflader blev observeret i væv hidrørende fra overlevende T24 /DN868A celler (Fig. 6C).

Twist blev aktiveret at mægle EMT i overlevende T24 /DN868A celler

Næste spekulerede vi den molekylære mekanisme, hvormed T24 /DN868A konvertering kunne modulere EMT. Vi undersøgte mange transkriptionsfaktorer såsom Slug, Twist, sneglen, Smad4 og ZEB1 ved RT-PCR. Primersekvenserne for RT-PCR er vist i tabel S1. Som følge heraf blev kun Slug og Twist forbedret i overlevende T24 /DN868A celler, mens de øvrige transkriptionsfaktorer ikke viste naturligvis ændre (fig. S1). Da Twist indebærer i fremme af EMT [24], og er i stand til at overvinde onkogen-induceret ældning i en række humane celler [25], vi fokuseret på sin ændring i overlevende T24 /DN868A celler. Som et resultat blev Twist dramatisk opreguleret i disse celler ved begge mRNA og protein niveauer (fig. 7A og fig. S2). Endvidere immunhistokemisk farvning af vævsprøver udviste en høj procentdel af Twist farvning i overlevende T24 /DN868A celler. Ud over brunlige prikker repræsenterer Twist i kernen af ​​et flertal af celler, et antal celler viste også både cytoplasmatisk og nukleær farvning (fig. 7B). For yderligere at undersøge betydningen af ​​Twist i denne EMT proces, vi bankede ned Twist med siRNA. Især, ned-modulation Twist medførte nedsat evne til migration og invasion i overlevende T24 /DN868A celler (Fig. 7C og 7D). Imens disse variationer var samtidig med elevation af CK18, CK19, og undertrykkelsen af ​​N-cadherin, vimentin, og MMP-2 i overlevende T24 /DN868A celler (Fig. 7E).

A. RT-PCR og Western blot analyse af Twist-ekspression i T24, T24 /PCI, og overlevende T24 /DN868A celler. B. Påvisning af Twist-ekspression ved immunohistokemisk farvning i nøgne mus tumorprøver. C og D. Overlevende T24 /DN868A celler blev behandlet med siRNA specifikke for Twist, og analyseret for invasion og migration evne. E. Western blot analyse af EMT-associerede proteiner.

Diskussion

Under ondartet progression af kræftceller, vedligeholdelse af telomer længde er en afgørende forudsætning for deres immortalisering [26], hvilket opnås ved telomeraseaktivitet (TA) og alternativ forlængelse af telomerer (ALT) [27]. Hæmning af TA betragtes som et potentielt mål for kræftbehandling; imidlertid er situationen kompliceret af tilstedeværelsen af ​​ALT mekanisme. Nuværende forståelse af telomer længde kinetik i fravær af TA og efterfølgende indgreb af ALT vej er primært baseret på forkerte reparation-mangel humane colon cancerceller og larynx cancer cellelinje Hep-2 [28], [29]. I dette arbejde blev DN hTERT bruges til funktionelt hæmme TA i blærekræft T24, 5637, og 253J cellelinjer, og sekventeret ændring af telomer længde blev bestemt. Desværre, efter transfektion, de fleste af disse blære cancercellelinier gik til døden, og ingen enkelt celle klon kunne dyrkes og passeret bortset T24-celler. Vore data viser, at selv om proliferationshastighed af T24-celler med telomerase-inhibering var forsinket og telomer længde blev forkortet i tidligere passage blev træk forbundet med ALT-lignende pathway observeret under langtidsdyrkning. Det er også værd at bemærke, at det samlede niveau for PML og MRN-komplekset steget naturligvis, da flere foci af MRE11, RAD50 og NBS1 blev observeret i kernen i at overleve T24 /DN868A celler (Fig. S3). Mens hæmme telomerase resulterede i enten celledød eller genopblussen af ​​TA som tidligere rapporteret [30], [31], vores nuværende undersøgelse afslører ingen indlysende opregulering af telomerase på hver passage baseret på Q-FISH og TRF assay, tyder på, at det er usandsynligt, at de resterende telomerase er hovedårsagen til den observerede telomer forlængelse i T24 /DN868A celler. I stedet vores data, at ALT-lignende mekanisme kan være den alternative måde, hvorpå blære cancerceller flygte fra telomerase inhibering. Salg

Aktivering af ALT resultater fra sæt af genetiske ændringer, der er tumor-typespecifik, og mange faktorer bidrage til udvælgelsen af ​​denne mekanisme til telomer vedligeholdelse. T24 celler udtrykker en mutant tumor suppressor protein p53 og et meget lavt niveau af MSH6 [32], [33], der betragtes som medvirkende faktorer til ALT aktivering [34], [35]. Dette kan til dels forklare, hvorfor blandt mange blærekræft cellelinjer, kun T24 undslap fra cellen krisen scenen og fortsatte med at være i live.

Selvom ALT i tumorer ikke er blevet omfattende undersøgt, er det nu ved at blive klart, at celler epitelial oprindelse opretholde deres telomerer via telomerase vej, mens ALT er oftere til stede i tumorer af mesenchymal [5] oprindelse. EMT er en proces, hvor epitelceller mister deres epitel fænotype og erhverve nye karakteristiske træk ved mesenkym [36]. Interessant nok kan celleældning bypasses under aktiveringen af ​​EMT, der typisk ledsager tumorprogression [15]. I kataraktøse canine linse epitelceller, processen med EMT involverer også TERT [37]. I denne undersøgelse har vi bemærket, at morfologien af ​​hTERT-inaktiveret T24 celler viste en gradvis mesenchymal ændring fra 25

th passage under den konsekvente kultur som påvist ved spindel form og tab af intercellulære junctions. Reduceret epitel markører og øget mesenkymale markører blev vist i både overlevende T24 /DN868A celler før på sæt af ALT-lignende egenskaber, og tumorprøver afledt overlevende celler, tyder på, at EMT blev aktiveret til at omgå celle ældning som set i andre publikationer (13 , 15). Baseret på den andet tidspunkt af APBs udseende og EMT dannelse, meget sandsynligt, kan de veje, der fører til disse ændringer være anderledes.

Telomerase og ALT menes at være funktionelt uretfærdige i at spørge tumor progression, men det forbliver selvmodsigende som pathway er mere aggressiv. Nogle undersøgelser tyder på, at ALT pathway, i det mindste i nogle cellelinjer, ikke funktionelt erstatte telomerase med hensyn til tumorigenicitet og metastatiske læsioner [38]. I nærværende undersøgelse har vi undersøgt progression evne overlevende T24 /DN868A celler. Sammenlignet med de forældrekontrol T24 eller kontrol celler, motilitet, invasion og klon dannelse evne

in vitro

tumorgenicitet

in vivo

af overlevende T24 /DN868A celler blev væsentligt forbedret, mens klæbende evne overlevende T24 /DN868A celler

in vitro

blev hæmmet, hvilket giver stærk støtte, at denne fuldt maligne fænotype blev udløst i at overleve T24 /DN868A celler med EMT.

Den grundlæggende helix-loop-helix ( bHLH) transskription faktor Twist er en sufflør af EMT [39], og dets overekspression er signifikant korreleret med scenen og kvalitet af menneskelig blære tumor [40]. I forbindelse med carcinogenese, kan Twist samtidigt undertrykke ældning respons og inducerer EMT [41]. I nærværende undersøgelse fandt vi, at Twist er overudtrykt i overlevende T24 /DN868A celler fra 24

th passage, og yderligere aggregeret dyre- blære tumorvæv. Konsekvent, udtømning af Twist reducerer progressionen evne overlevende T24 /DN868A og inducerer mesenchymal-til-epitel (MET) -lignende forandring. Derfor aktivering af EMT under telomerase hæmning kræver samarbejde af Twist-signalvejen i blærekræft.

Samlet set vores data viser, at træk forbundet med ALT-lignende mekanisme og EMT kunne induceres efter telomerase hæmning i