PLoS ONE: Nuklear og Cytoplasmatisk Ophobning af Ep-ICD ofte opdaget i Human epithelial Cancers

Abstrakt

Baggrund

Vi har tidligere vist, at kernekraft og cytoplasmatisk akkumulering af det intracellulære domæne (EP ICD) af epitelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) ledsages af et gensidigt reduktion af dets ekstracellulære domæne (EPEX), forekommer i aggressive skjoldbruskkirtelkræft. Denne undersøgelse blev designet til at bestemme, om tilsvarende ophobning af Ep-ICD er en almindelig begivenhed i andre epitel kræftformer.

Metode og Resultater

Ti epitelial kræft blev immunhistokemisk analyseret med Ep-ICD og EPEX-domæne -specifikke antistoffer. Den subcellulære lokalisering af EPEX og EP-ICD i human colon adenocarcinom cellelinie CX-1 blev observeret ved anvendelse af immunofluorescens. Nuklear og cytoplasmatisk Ep-ICD-ekspression blev øget i bryst- (31 af 38 væv, 82%), prostata (40 af 49 væv, 82%), hoved og hals (37 af 57 væv, 65%) og spiserøret ( 17 af 46 væv, 37%) i forhold til deres tilsvarende normale væv, der viste membran lokalisering af proteinet. Vigtigere, blev Ep-ICD ikke påvist i kernerne i epitelceller i de fleste normale væv. Høj nukleare og cytoplasmiske Ep-ICD akkumulering forekom også i de andre seks epiteliale cancertyper analyserede – lunge, tyktarm, lever, blære, pancreas, og ovarie. En ledsagende reduktion i membranen EPEX-ekspression blev observeret i en delmængde af alle typer kræft. Receiver opererer kurve analyse viste nukleare Ep-ICD fornem brystkræft med 82% følsomhed og 100% specificitet og prostatakræft med 82% sensitivitet og 78% specificitet. blev observeret lignende fund for cytoplasmatisk akkumulering af Ep-ICD i disse kræftformer. Vi leverer kliniske tegn på øget nukleare og cytoplasmatisk Ep-ICD ophobning og en reduktion i membranøs EPEX i disse kræftformer.

Konklusioner

Øget nukleare og cytoplasmatisk Ep-ICD blev observeret i alle epitelial kræft analyseret og adskiller dem fra normale væv med høj følsomhed, specificitet, og AUC. Udvikling af en robust high throughput assay for Ep-ICD vil lette bestemmelsen af ​​dets diagnostiske, prognostiske og terapeutiske relevans i epitelial kræft

Henvisning:. Ralhan R, han HC-H, så AK-C, Tripathi SC , Kumar M, Hasan MR, et al. (2010) Nuklear og Cytoplasmatisk Ophobning af Ep-ICD ofte opdaget i Human epitelcancer. PLoS ONE 5 (11): e14130. doi: 10,1371 /journal.pone.0014130

Redaktør: Marc Vooijs, University Medical Center Maastricht, Holland

Modtaget: Juni 20, 2010; Accepteret: 24 oktober 2010; Udgivet: November 30, 2010

Copyright: © 2010 Ralhan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Mount Sinai Foundation of Toronto, Da Vinci Gala Fundraiser, Alex og Simona Shnaider Chair i kræft i skjoldbruskkirtlen, Mount Sinai Hospital Institut for Medicin Research Fund, Alex og Simona Shnaider Laboratory i Molecular Oncology, og Temmy Latner Dynacare Family Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) er et 40 kDa transmembran-glycoprotein, der tjener vigtige roller i celleadhæsion, celleproliferation, differentiering, migrering, cellecyklusregulering og er impliceret i cancer og stamcelle signalering [1]. EpCAM er et af de mest undersøgte proteiner i humane cancere, ofte overudtrykkes i humane maligniteter, lokaliseret på plasmamembranen af ​​tumorceller og omend ved lavere niveauer i det normale epitel [2], [3], [4], [5 ], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Alle disse undersøgelser anvendte antistoffer rettet mod det ekstracellulære domæne af EpCAM (EPEX) [13]. Disse talrige rapporter på celleoverfladen udtryk for EpCAM i humane kræftformer har antydet, at det kunne være en ideel kandidat til anvendelse som en epitelial kræft markør og et terapeutisk target [18], [19], [20], [21]. Paradoksalt nok har de fleste kliniske forsøg med murine monoklonale antistoffer nemlig edrecolomab i kolorektal cancer, eller humaniseret antistof, adecatumumab, i brystkræft vist begrænset effekt [14], [22]. En forståelse af disse begrænsninger er en udfordring for onkologer og er af stor betydning for den fremtidige udvikling af mere effektive anti-EpCAM strategier. I denne sammenhæng Gires og Baeuerle [23] drøftede behovet for at måle EpCAM ekspressionsniveauerne i tumorceller og deres indvirkning på resultatet af et klinisk forsøg. Men ingen af ​​de tidligere forsøg har analyseret EpCAM udtryk i tumorvæv, prospektivt eller retrospektivt. Hvorvidt nylig rapporteret reguleret intramembrane proteolyse (RIP) medieret tab af EpCAM fra tumor celleoverfladen kan være en af ​​årsagerne til den begrænsede effekt af EpCAM-baserede behandlinger mod kræft stadig at blive etableret [24]. Spaltningen af ​​EpCAM ektodomænet, EPEX, af proteasen tumornekrosefaktor α-omdannende enzym (TACE) og dens frigørelse har vist sig at frigive sit intracellulære domæne (Ep-ICD), som derefter translokerer til kernen resulterer i aktivering af onkogen signalering [ ,,,0],24]. Foreningen af ​​Ep-ICD med FHL2 og Wnt pathway komponenter p-catenin og Lef-1 danner en nuklear kompleks, der binder DNA ved Lef-1 konsensus sites og inducerer gentranskription, hvilket fører til øget celledeling [24]. Den kliniske betydning af Ep-ICD i humane kræftformer skal bestemmes i lyset af de mange funktioner EpCAM som et onkogent signal transducer, celleadhæsionsmolekyle og kræft stamceller markør [24], [25], [26], [27 ].

nuklear lokalisering af Ep-ICD blev først rapporteret i en undersøgelse af 26 tilfælde af human tyktarmskræft, men ikke i normal colon epitel [24]. Efterfølgende rapporterede vi nukleare og cytoplasmatisk akkumulering af Ep-ICD i forskellige undertyper af skjoldbruskkirtelkræft, der blev forbundet med en gensidig reduktion i membranøs EPEX, og også observeret en korrelation af nuklear Ep-ICD akkumulering med tumor aggressivitet og dårlig sygdom prognose [28] . Den brede heterogenitet i solide tumorer warrants undersøgelse for at afgøre, om nukleare og cytoplasmatisk Ep-ICD udtryk også kan forekomme i andre menneskelige kræftformer. I den aktuelle undersøgelse, har den subcellulære kompartment akkumulering af Ep-ICD blevet behandlet i en bred vifte af epiteliale cancere, nemlig, bryst, prostata, hoved og hals, spiserør, ovarie, pancreas, kolon og rektum, lunge, urinblære, lever carcinomer ved immunhistokemi (IHC) (anvendelse af et specifikt antistof rettet mod det Ep-ICD-domænet af EpCAM). Nuklear og cytoplasmatisk Ep-ICD er også blevet kvantitativt påvist i CX-1 tyktarmscancerceller hjælp immunofluorescens. Med undtagelse af en tidligere rapport i tyktarmskræft og vores studie i kræft i skjoldbruskkirtlen [24], [28], det nye ved denne rapport er demonstration af den udbredte forekomst af øget nukleare og cytoplasmatisk akkumulering af Ep-ICD i samarbejde med variabel membran EPEX udtryk i et bredt spektrum af epitelial kræft.

Metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev foretaget i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Undersøgelsen blev godkendt af Mount Sinai Hospital Research Ethics Board, Toronto, Canada. De arkiverede paraffin væv blokke af en hoved- og halscancer undersøgelse godkendt af Human etiske komité af All India Institute of Medical Sciences, New Delhi, Indien, med forudgående samtykke fra de patienter blev anvendt i denne undersøgelse.

Patienter og vævsprøver

for IHC-analyse, arkiveret væv blokke af hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCCs) og normale væv samt esophageal planocellulært karcinom (ESCCs) blev hentet fra tumor banken, gennemgået af patolog og bruges til at skære vævssnit for immunfarvning med Ep-ICD og EPEX antistoffer som beskrevet nedenfor. De kliniske og patologiske data optaget omfattede klinisk tumor stadie, stedet læsioner, histopatologiske differentiering, alder og køn i en pre-designet Performa som beskrevet af os tidligere [29]. Tissue-microarrays (TMA) af brystkræft og tilstødende normalt brystvæv (IMH-371), prostatacancer og tilstødende normale prostatavæv (IMH-303), lungecancer (IMT-305), colon og rektal cancer (IMH-306) , fælles epitelial kræft bestående af lever, urinblære, æggestokke, bugspytkirtel, bryst og prostata (IMH-327) blev indkøbt fra IMGENEX Corp (San Diego, CA). Enogtyve væv blokke af benign prostatahyperplasi (BPH) blev hentet fra vævet bank i Mount Sinai Hospital, gennemgået af patologen og bruges til at skære vævssnit til immunfarvning med Ep-ICD og EPEX-antistoffer.

Antistoffer og cellelinie

Anti-human Ep-ICD kanin-monoklonalt antistof blev opnået fra Epitomics Inc. (Burlingame, CA). Anti-humant EPEX monoklonalt muse-antistof (MOC-31) blev opnået fra ABD Serotec (Raleigh, NC). Den α-Ep-ICD-antistof 1144 genkender det cytoplasmatiske domæne af humant EpCAM og er blevet anvendt i vores nylige undersøgelse om Ep-ICD i thyreoideacancer [28]. MOC-31 genkender det ekstracellulære domæne af EpCAM. Begge antistoffer er blevet anvendt i vores undersøgelse for nylig i kræft i skjoldbruskkirtlen [28].

Den humane colon adenocarcinom cellelinie CX-1 blev dyrket i RPMI-1640-medier indeholdende 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin , 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% ikke-essentielle aminosyrer. STR profil af cellelinjen blev fundet at være i overensstemmelse med den kendte profil af CX-1 i databaserne i den tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland).

klinisk-patologisk kendetegn patienter

Fifty-syv HNSCC patienter i alderen fra 29 til 75 år blev indskrevet i denne undersøgelse. Deres diagnoser var baseret på klinisk undersøgelse og histopatologisk analyse af vævsprøver. Tumorerne blev histologisk gradueret såvel differentieret pladecellecarcinom (WDSCC), moderat differentieret pladecellecarcinom (MDSCC) eller dårligt differentieret pladecellecarcinom (PDSCC). Tyve væv taget fra et fjernt sted, HNSCCs (med histologisk bekræftet normal epitel benævnt her som hoved og hals normale væv) blev også vurderet for Ep-ICD og EPEX udtryk.

Fyrre-seks ESCC patienter blev indskrevet i denne undersøgelse. Deres diagnoser var baseret på klinisk undersøgelse og histopatologisk analyse af vævsprøver. Tumorerne blev histologisk gradueret samt, moderat eller dårligt differentierede SCC’er. Tyve væv taget fra et fjernt sted for ESCCs (med histologisk bekræftet normal epitel her benævnt esophageal normale væv) blev også bedømt for Ep-ICD-proteinekspression. Tilsvarende fyrre væv taget fra et fjernt sted for ESCCs (med histologisk bekræftet normal epitel her benævnt esophageal normale væv) blev evalueret for EPEX ekspression.

TMAs af brystkræft og tilstødende normalt brystvæv, prostatacancer og tilstødende normale prostatavæv, lungecancer, coloncancer og rektal cancer, fælles epiteliale cancere bestående af lever, urinblære, æggestokke, bugspytkirtel, bryst og prostata blev undersøgt. For Ep-ICD, antallet af analyserede væv var 38 brystcancere og 25 tilsvarende normale væv, 49 prostatakræft og 9 tilsvarende normale væv og 21 benign prostata hyperplasi, 57 HNSCCs og 20 tilsvarende normale væv, 46 ESCCs og 20 tilsvarende normale væv, 59 hver af lunge- og coloncancer, 10 hver af blære, ovarie- og pancreascancer, og 9 levercancere. For EPEX, at antallet af væv, som var til rådighed til immunhistokemisk analyse omfattede 40 brystkræft og 29 tilsvarende normale væv, 49 prostatakræft og 9 tilsvarende normale væv og 21 benign prostata hyperplasi, 39 HNSCCs og 20 tilsvarende normale væv, 47 ESCCs og 40 tilsvarende normale væv, 59 tilfælde af hver af lunge- og coloncancer, og 10 tilfælde af hver af blære, æggestokke og leverkræft.

immunhistokemisk analyse af Ep-ICD-ekspression i epitelial kræft

Serial paraffin- indlejrede snit (5 um tykkelse) af HNSCCs, ESCCs og deres normale væv blev anvendt til Ep-ICD og EPEX immunfarvning som vi har beskrevet for nylig [28]. TMA lysbilleder og de enkelte vævssnit blev de-paraffinized ved bagning ved 62 ° C i 1 time i lodret orientering og rehydreret i xylen og gradueret alkohol serien. Derefter blev antigen-genvinding betingelser optimeret og blev udført i 0,01 M citratpuffer, pH 6,0 i 3 minutter ved 115 ° C, under anvendelse af en TTmega ovn (Milestone Inc. Shelton, CT). Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubering sektioner i methanol indeholdende 0,3% hydrogenperoxid i 20 minutter. Efter blokering af ikke-specifik binding med normal hest eller gedeserum blev sektionerne inkuberet med α- Ep-ICD kanin monoklonale antistof 1144 (fortynding 1:200) i 30 minutter og biotinyleret gede-anti-kanin sekundært antistof i 30 minutter eller inkuberet med MOC-31 (fortynding 1:200) i 30 minutter med den tilsvarende biotinylerede sekundære antistof (heste-anti-mus eller ged-anti-kanin) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada) i 30 minutter. Sektionerne blev endeligt inkuberet med Vectastain Elite ABC reagens (Vector Laboratories) og diaminobenzedine blev anvendt som chromogen.

Evaluering af immunhistokemisk farvning

TMA billeder blev erhvervet ved hjælp af Visiopharm Integrator System (Visiopharm , Hørsholm, Danmark). Ep-ICD og EPEX immunpositive farvning blev evalueret i fem områder af de erhvervede billeder af vævssnit og gennemsnittet af disse fem scoringer blev beregnet. Snit blev scoret som positive, hvis epitelceller viste immunopositivitet i plasmamembranen, cytoplasma og /eller cellekernen når observeres af to bedømmere, der var blindet for den kliniske histopatologi og diagnose. Disse sektioner blev scoret på grundlag af procentvise positivitet som følger: 0, 10% celler; 1, 10-30% celler; 2, 30-50% celler; 3, 50-70% celler; og 4, 70% celler viste immunoreaktivitet som tidligere beskrevet [28]. Snit blev også scoret semikvantitativt på basis af intensiteten som følger: 0, ingen; 1, mild; 2, moderat; og 3, intens. Endelig blev en samlet score (i intervallet fra 0 til 7) ved at summere de snesevis af procentvise positivitet og intensitet for hver kræft og normalt væv sektion. De immunhistokemiske data blev udsat for statistisk analyse som tidligere beskrevet [29].

Statistisk analyse

IHC-data blev udsat for statistisk analyse ved hjælp af SPSS 17,0 software (SPSS, Chicago, IL) og Graphpad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Scatter plots blev anvendt til at bestemme fordelingen af ​​den samlede score for membranen, nukleare og cytoplasmiske Ep-ICD-ekspression i normale og cancerøse væv. Receiver operating characteristic (ROC) kurve analyser blev udført for at beregne følsomhed, specificitet og arealet under kurven (AUC) værdier i hver cancertype for nuklear og cytoplasmatisk Ep-ICD. Baseret på den optimale følsomhed og specificitet blev en IHC score cut-off værdi på ≥4 defineret som immunpositive ensartet for alle kræftformer analyseret for statistisk undersøgelse.

Immunofluorescensanalyse af Ep-ICD og EPEX lokalisering i CX -1 coloncancercellelinie

CX-1 colon cancerceller blev dyrket på objektglas op til 60% konfluens og derefter inkuberet med enten α-Ep-ICD kanin monoklonale antistof 1144 (1:100 fortynding) eller mus monoklonalt antistof MOC-31 (1:100). For Ep-ICD, det sekundære antistof anvendte var en tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC) -mærket gede-anti-kanin-antistof (Sigma-Aldrich, 1:200 fortynding). For EPEX, det sekundære antistof anvendte var en fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket gede-anti-muse-antistof (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1:200 fortynding). Slides blev vist ved hjælp af et Olympus Upright fluorescens mikroskop (BX61) og billeder blev analyseret ved hjælp Volocity software (PerkinElmer, Waltham, MA).

Resultater

immunhistokemisk analyse af Ep-ICD-ekspression i human epitel kræftformer

de kendte kliniske parametre, histopatologi og Ep-ICD IHC scores for hver kræft type er angivet i de supplerende tabeller S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10. Blandt de typer kræft, som blev sammenlignet med de normale væv (Tabel 1), brystkræft udstillet 82% nukleare Ep-ICD-positivitet (31 af 38 væv) og 84% cytoplasmatisk Ep-ICD-positivitet (32 af 38 væv). Baseret på en IHC cut-off score på 4, blev ingen af ​​de 25 normale brystvæv analyserede positiv for nuklear Ep-ICD; 56% (14 af 25 væv) viste ingen påviselig kernefarvning i bryst- luftrør celler eller duktale celler, medens de resterende 11 tilfælde viste lave IHC score. Prostatakræft udstillet 82% nukleare positivitet (40 af 49 væv) og 82% cytoplasmatisk positivitet (40 af 49 væv). Nuclear Ep-ICD var positiv i 2 af 9 normale prostatavæv, og blev observeret cytoplasmatisk positivitet i 1 af 9 væv. Blandt de 21 BPH analyserede væv blev cytoplasmatisk positivitet observeret i en af ​​21 væv; ingen af ​​væv var nukleare Ep-ICD positive baseret på en cutoff score på 4. I HNSCCs, Ep-ICD nukleare positivitet var 65% (37 af 57 væv) og cytoplasmatisk positivitet var 74% (42 af 57 væv). ESCC nukleare positivitet var 37% (17 af 46 væv) og cytoplasmatisk positivitet var 70% (32 af 37 væv). Nuklear og cytoplasmatisk Ep-ICD blev hver observeret at være positiv i kun 1 af 20 normale væv i hoved og halscancer. For ESCC blev nukleare positivitet observeret i 2 af 20 normale væv og cytoplasmatisk positivitet blev observeret i 6 ud af 20 normale væv. Alle resterende epiteliale cancere vises nuklear og cytoplasmatisk akkumulering af Ep-ICD (tabel 1). Især selv om brugen af ​​en cutoff på ≥4 at bestemme positivitet førte til reduceret nukleare og cytoplasmatisk positivitet i pancreascancer, en undersøgelse af scoring afsløret, at en cutoff på 3,5 ville have identificeret 7 af 10 tilfælde af nukleare Ep-ICD ophobning og 5 af 10 tilfælde af cytoplasmatisk Ep-ICD akkumulering (se supplerende tabel S8).

De repræsentative mikrofotografier vist i figur 1 demonstrerer Ep-ICD immunfarvning i normale og cancer væv. Panel A viser fremherskende membran lokalisering af Ep-ICD og ingen nuklear farvning i normalt brystvæv (I), medens kræftvæv viser nuklear og cytoplasmatisk Ep-ICD akkumulering (II). Panel B (la) viser lavt niveau af membran Ep-ICD i epitelcellerne og de basale celler viser svag nuklear farvning i det normale prostatavæv og i godartet prostatahyperplasi (Ib). Den prostatacancer væv viser intens cytoplasmatiske og øget nuklear farvning (panel B, II). I endotelceller, blev stærk Ep-ICD-farvning konsekvent observeret. I adipocytter, farvning varierede fra fraværende til milde i nogle celler. Lymfocytter farves kraftigt i tumorvæv, mens ingen blev observeret i normale væv. Glat muskel-farvning var fraværende eller svag i alle tilfælde. Ingen påviselig Ep-ICD farvning blev observeret i den normale esophageal væv (panel C, I), mens ESCC viste intens nukleare og cytoplasmatiske immunfarvning (panel C, II). Hoved og hals normal mucosa viste svag membran Ep-ICD (felt D, I), medens intens nukleare og cytoplasmatiske immunfarvning blev observeret i HNSCC (felt D, II).

De repræsentative mikrofotografier skildrer Ep-ICD immunfarvning i normale og cancer væv. Panel A viser fremherskende membran lokalisering af Ep-ICD og ingen nuklear farvning i normalt brystvæv (I), medens kræftvæv viser nuklear og cytoplasmatisk Ep-ICD akkumulering (II). Panel B viser lavt membran Ep-ICD i epitelcellerne og de basale celler viser nogle nuklear farvning i det normale prostatavæv (la) og i godartet prostatahyperplasi (B, Ib), mens kræftvæv viser intens cytoplasmatiske og nukleare farvning (II). Felt C viser ingen påviselig Ep-ICD-farvning i det normale esophageal væv (I), mens ESCC viser intens nukleare og cytoplasmatiske immunfarvning (II). Panel D viser hoved og hals normal slimhinde viser svag membran Ep-ICD (I), medens HNSCC viser intens nukleare og cytoplasmatiske immunfarvning (II). Oprindelig forstørrelse x 400.

Øget nukleare og cytoplasmatiske immunoreaktivitet og reduceret eller blev ikke observeret manglende membran farvning af Ep-ICD i kræft i blæren (Figur 2, panel A), lunge (B), lever (C), ovarie (D), colon (E), og pancreas (F). Især blev membranen Ep-ICD-farvning observeret i nogle tilfælde af hver epitelcancer analyseret. Repræsentative mikrofotografier af prostatacancer og coloncancer afbilder heterogene Ep-ICD-farvning er vist i figur 3 A, B. Nogle områder af vævssnittet viste fremherskende membran og svag cytoplasmatisk men ingen nuklear lokalisering af Ep-ICD (figur 3A, B – venstre firkant), mens de andre områder af det samme væv afsnit viste nuklear og cytoplasmatisk akkumulering af Ep-ICD med fravær af membranøs Ep-ICD-ekspression (figur 3A, B – højre firkant). De negative og positive kontrolprøver mikrofotografier er vist i figur 4.

Øget nukleare og cytoplasmatiske immunoreaktivitet og reduceret eller blev ikke observeret manglende membran farvning af Ep-ICD i kræft i blæren (felt A), lunge (Panel B ), lever (Panel C), ovarie (Felt D), colon (Felt E), og bugspytkirtel (Panel F). Original forstørrelse × 400.

Membran, cytoplasmatisk, og nuklear Ep-ICD-ekspression i prostatakræft (A) og tyktarmskræft (B). Nogle områder af vævssnit show fremherskende membran og svag cytoplasmatisk men ingen nuklear lokalisering af Ep-ICD (A, B – venstre firkant), mens de andre områder af det samme væv afsnit viser nukleare og cytoplasmatiske akkumulering af Ep-ICD med fravær af membranøs Ep-ICD-ekspression (A, B – højre firkant). Original forstørrelse × 400.

vises De negative og positive kontrol mikrofotografier. EP-ICD negative kontroller for HNSCC (A), prostatacancer (B), coloncancer (C), brystcancer (D), ESCC (E), og normal esophagus (F); paneler G og H er positive kontroller til Ep-ICD farvning. Original forstørrelse × 400.

Scatter Plot Analyse

De scatter plots i figur 5A og 5B viser fordelingen af ​​nukleare og cytoplasmatiske Ep-ICD Immunofarvning scores i alle de epitelial typer kræft analyseret . Nuclear Ep-ICD blev observeret i 39 af de 57 HNSCC væv og i 18 af de 46 ESCC væv. Tredive syv af disse 39 HNSCC væv undersøgt og 17 af de 18 ESCC væv viste IHC score ≥4. Cytoplasmatisk Ep-ICD-farvning blev påvist i 42 af de 57 (74%) HNSCC undersøgte væv og 32 af de 46 (70%) ESCC væv. Brystkræft, prostatakræft, og positivt farvning HNSCCs og ESCCs alle udstillede bemærkelsesværdige stigninger i både nukleare og cytoplasmatisk Ep-ICD i forhold til de normale væv og prostata godartede hyperplastiske analyserede væv. Lung, tyktarm, lever, blære, æggestokke, og pancreas cancer typer hver demonstrerede fremtrædende udtryk for nukleare og cytoplasmatisk Ep-ICD. De scatter plots i figur 5C viser fordelingen af ​​membran Ep-ICD score i alle de epitelial kræft typer analyseres.

Scatter plots viser fordelingen af ​​de samlede Immunofarvning scoringer bestemt af IHC af vævssnit af kræft i bryst (n = 38), prostata (n = 49), lunge (n = 59), ovarie (n = 10), colon (n = 59), blære (n = 10), leveren (n = 9), positivt farvende HNSCCs (n = 39) og ESCCs (n = 19), og normalt bryst (n = 25), prostata (n = 9) og BPH (n = 21), normal esophageal (n = 20), og hoved og hals (n = 20) væv. Den lodrette akse viser det samlede IHC score som beskrevet i fremgangsmåderne. En afskæring på ≥4 blev anvendt til bestemmelse positivitet. N, normal; Ca, cancer. A. Øget nukleare akkumulering af Ep-ICD blev observeret i de fleste af de epiteliale cancere analyseres. B. Øget cytoplasmatisk akkumulering af Ep-ICD blev observeret i næsten alle epitel kræft analyserede. C. Membrane lokalisering af Ep-ICD varieret i de forskellige kræft og normale vævstyper undersøgt.

immunhistokemisk analyse af EPEX-ekspression i humane epiteliale cancere

Lignende IHC-analyse af EPEX udtryk i disse humane epiteliale cancere blev også udført under anvendelse MOC31, et specifikt antistof mod det ekstracellulære domæne af EpCAM (EPEX) i alle de ti epiteliale cancere (figur 6 og 7). Repræsentative mikrofotografier i figur 6, panel I viser lavt membran EPEX ekspression i normalt bryst (A) og prostata (B, la), BPH (B, Ib), og normal esophagus (C) og hoved og hals (D) væv . De tilsvarende cancervæv afbilder forøget niveau af EPEX i membranen, er vist i figur 6, panel II (A bryst; B-prostata, C- spiserøret og D- hoved og hals). I modsætning hertil mange af cancervæv for hver cancertype viste fravær af membran EPEX; repræsentative mikrofotografier er vist i panel III (A-D). Figur 7, panel I viser intens membran EPEX i coloncancer (A), lever (B), blære (C), lunge (D), ovarie (E) og pancreas (F) kræft. Figur 7 panel II (A-F) viser reduceret eller fravær af membran EPEX i en undergruppe af hver af disse epiteliale cancere. De positive og negative kontroller er vist i supplerende Figur S1.

Mikrofotografierne skildrer MOC31 farvede membran EPEX i epiteliale cancere. Panelet I viser lavt membran EPEX ekspression i normalt bryst (A) og prostata (B, la), BPH (B, Ib), og normal esophagus (C) og hoved og hals (D) væv. De tilsvarende cancervæv afbilder forøget niveau af EPEX i membranen er vist i panel II (A-D). I modsætning mange af cancervæv for hver cancertype viste fravær af membran EPEX (panel III, A-D). Original forstørrelse × 400.

Membran EPEX ekspression blev observeret i alle de epiteliale kræftformer. Panel I viser intens membran EPEX i coloncancer (A), lever (B), blære (C), lunge (D), ovarie (E) og pancreas (F) kræft. Panelerne II A-F viser reduceret eller fravær af membran EPEX i en undergruppe af hver af disse epiteliale cancere. Original forstørrelse × 400.

Analyse af Ep-ICD og EPEX immunfluorescens i CX-1 coloncancercellelinie

I CX-1, en aggressiv coloncancercellelinie, EPEX og Ep-ICD blev begge detekteret i plasmamembranen (figur 8). Intens membran-ekspression blev observeret ved celle-celle kryds med både EPEX og EP-ICD domænespecifikke antistoffer (figur 8 – A, D, F, og G). Desuden blev akkumulering af Ep-ICD observeret i cytoplasmaet og kerner af kræftceller, men ingen EPEX akkumulering blev fundet i kerner (figur 8 – C, E, G). Den kvantitative fluorescenssignal scanning af EPEX og EP-ICD klart støtter disse observationer (figur 8H).

Sekundære antistoffer er FITC-anti-muse (grøn) og TRITC-anti-kanin (rød). A) EPEX; B) Ep-ICD; C) DAPI; D) EPEX og DAPI (A E) Ep-ICD og DAPI (B C fusionerede); F) EPEX og Ep-ICD (A B fusioneret); G) EPEX, Ep-ICD, og ​​DAPI (A, fusioneret B, C); I) Måling af tætheden af ​​tre farver på tværs af linjen i cellerne i H.

ROC Curve Analyse

ROC kurver blev genereret for nukleare og cytoplasmatisk Ep-ICD i HNSCC, ESCC, prostata, og brystcancer (Figur 9) og deres resultater er sammenfattet i tabel 2. på grundlag af denne analyse blev en cutoff på ≥4 bruges til at bestemme nukleare og cytoplasmatisk positivitet. Analyse viste, at nukleare Ep-ICD ophobning skelnes prostata kræft og brystkræft fra normale væv med 82% følsomhed og med en specificitet på 100% for bryst og 78% for prostata. I HNSCCs, nuklear Ep-ICD var i stand til at skelne kræft fra normale væv med 65% sensitivitet og 95% specificitet, mens det i ESCCs viste nukleare Ep-ICD 37% sensitivitet og 90% specificitet. AUC-værdierne viste sig at være 0,905 for brystkræft, 0,867 for prostatakræft, 0,822 for HNSCC, og 0.630 til ESCC. Cytoplasmatisk Ep-ICD-ekspression i bryst- og prostatakræft havde en sensitivitet på 82% og 84%, med en specificitet på 100% for bryst og 89% for prostata. I HNSCC, cytoplasmatisk Ep-ICD-ekspression havde en følsomhed på 74% og en specificitet på 95%, mens cytoplasmatisk Ep-ICD havde følsomhed og specificitet på 70% hver i ESCCs. De AUC-værdierne for cytoplasmatisk Ep-ICD var 0,928 i brystkræft, 0,880 i prostatakræft, 0,864 i HNSCC, og 0,758 i ESCC.

ROC kurver, der beskriver forholdet mellem følsomhed og 1-særlige forhold nukleare og cytoplasmatisk Ep -ICD ekspression i disse epiteliale cancere. Den lodrette akse i hver kurve indikerer følsomhed og den horisontale akse angiver 1-specificitet. Følsomhed, specificitet og AUC-værdier for de kræftformer er sammenfattet i tabel 2.

Diskussion

Den aktuelle undersøgelse fremhæver den hyppige forekomst af nuklear og cytoplasmatisk akkumulering af Ep -ICD i ti epitelial typer kræft. Den normale epitel i bryst, prostata og esophageal væv analyserede viste tydelig membran Ep-ICD lokalisering. Vigtigt er det, reduceres eller iagttoges fravær af membranøs Ep-ICD i cancere i bryst, prostata, hoved og hals og spiserør, parallelt med markant Ep-ICD akkumulering i kernen og cytoplasmaet af de respektive tumorceller. Men en undergruppe af tumorer af hver af disse ti cancertyper viste høj Ep-ICD membran udtryk, der korrelerede med høj EPEX ekspression af den detekterede anvendelse af en Ep-CAM eksternt domæne (EPEX) specifikt antistof (MOC31) membran, hvilket antyder øget ekspression af fuld længde proteinet som påvist ved Ep-ICD og EPEX specifikke antistoffer. Især viste immunohistokemisk analyse af epiteliale cancere under anvendelse MOC31 forøget EPEX membran-ekspression i sammenligning med de normale væv i nogle tumorer, mens de andre viste nedsat eller fravær af membran EPEX, støtte vores observationer med Ep-ICD domænespecifikke antistoffer. Det er værd at understrege, at cancere som frembyder nedsat eller manglende membran EPEX eller Ep-ICD havde markant forøget Ep-ICD i cytoplasmaet og kerner af sådanne tumorceller. Især blev EPEX ikke påvist i nogen af ​​kernerne i tumorceller i nogen af ​​de analyserede cancere. Tilsammen favor disse observationer øget ekspression og forøget afgivelse af EPEX ved tumorceller i en delmængde af alle epiteliale tumorer undersøgt.