PLoS ONE: Karakterisering af Transkriptionelle Ændringer i ERG-omlejring-Positiv prostatakræft Identificerer Regulering af metaboliske Sensorer Såsom neuropeptid Y

Abstrakte

ERG gen omlejringer findes i omkring halvdelen af ​​alle prostatakræft. Funktionelle analyser ikke fuldt ud forklare den selektive pres forårsager ERG omlejring under udviklingen af ​​prostatakræft. At identificere transkriptionelle ændringer i prostatakræft, herunder tumorer med ERG genomlejringer, vi foretaget en meta-analyse af publicerede genekspression data efterfulgt af valideringer på mRNA og protein niveauer samt første funktionelle undersøgelser. Otte udtryk studier (n = 561) på humane prostata væv indgik i metaanalysen. Transskriptionelle ændringer mellem prostatacancer og ikke-kræft prostata samt ERG omlejring-positive (ERG +) og ERG omlejring-negative (ERG-) prostatacancer, blev analyseret. Detaljerede resultater kan tilgås via en online database. Vi validerede vores meta-analyse ved hjælp af data fra vores egen uafhængige microarray studie (n = 57). 84% og 49% (fold-ændring 2 og 1,5, henholdsvis) af alle transkriptionelle ændringer mellem ERG + og ERG- prostatakræft bestemt ved metaanalyse blev kontrolleret i valideringsundersøgelsen. Udvalgte mål blev bekræftet ved immunhistokemi: NPY og PLA2G7 (opreguleret i ERG + kræft), og AZGP1 og TFF3 (nedreguleret i ERG + kræft). Første funktionelle undersøgelser til en af ​​de mest fremtrædende ERG omlejring-associerede gener – neuropeptid Y (NPY) – afslørede øget glukoseoptagelse

in vitro

indikerer potentielle rolle NPY i reguleringen cellulære stofskifte. Sammenfattende fandt vi robuste populationsbaserede uafhængig transkriptionelle ændringer i prostatakræft og første tegn på ERG omlejringer inducerer metaboliske ændringer i kræftceller ved at aktivere væsentligste metaboliske signalmolekyler som NPY. Vores undersøgelse viser, at metaboliske ændringer muligvis bidrage til det selektive pres begunstige ERG omrokeringer i prostatakræft

Henvisning:. Massoner P, Kugler KG, Unterberger K, Kuner R, Mueller LAJ, Fälth M, et al. (2013) Karakterisering af Transkriptionelle Ændringer i ERG-omlejring-Positiv prostatakræft Identificerer Regulering af metaboliske Sensorer Såsom neuropeptid Y. PLoS ONE 8 (2): e55207. doi: 10,1371 /journal.pone.0055207

Redaktør: Hari Koul, University of Colorado, USA

Modtaget: August 28, 2012; Accepteret: December 27, 2012; Publiceret: 4 februar 2013

Copyright: © 2013 Massoner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne for finansiel støtte fra Comet center Oncotyrol (Project 3.1), den selvstyrende provins Bolzano, Sydtyrol, (Grant 37 /40,3), den østrigske Science Fund FWF (Grant J3201), og forskningsfonden tyrolske. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: efter drøfte med Oncotyrol , center for Personlig Cancer Medicine GmbH, vil forfatterne gerne oplyse følgende: PM, KU og HK gennemført dette arbejde som medarbejdere /associerede Oncotyrol GmbH. Arbejdet på dette projekt blev co-finansieret af Oncotyrol GmbH i forbindelse med det østrigske COMET finansiering program. Oncotyrol GmbH har ikke planer om at indgive et patent eller kommercielt forfølge de resultater, der er indeholdt i dette manuskript. Derfor ingen konkurrerende interesse kan identificeres i forbindelse med det beskrevne arbejde. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Om halvdelen af ​​alle prostatakræft huser et gen omlejring [1]. Sidstnævnte er dannet ved fusion af 5’regulatoriske elementer af et androgen-reguleret gen til den kodende region af et medlem af E seksogtyve (ETS) genfamilien af ​​transkriptionsfaktorer.

ETS

rearrangementer resulterer i androgen-drevet overekspression af ETS transkriptionsfaktorer [1]. Den mest almindelige ETS omlejring er translokationen af ​​androgen-regulerede transmembrane protease serin 2 (

TMPRSS2

) gen, med v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog gen (

ERG

) transskription faktor tegner sig for omkring 85% af alle ETS omlejring-positive prostatakræft [2] – [4]. ERG-omlejring er en tidlig begivenhed i tilblivelsen af ​​prostatacancer. Det er allerede til stede i lokal lav kvalitet prostatacancer [5], [6] og vedvarer i metastatiske og kastrationsresistent typer (CRPC) [1], [4], [7]. Den tidlige udseende og den høje frekvens af ERG omrokeringer angiver den selektive fordel ved omlejring-positive celler i prostatakræft.

Funktionelle analyser udført hidtil har ikke lavet en omfattende redegørelse for det selektive pres tvinger ERG omlejring i tidlige stadier af prostatacancer. ERG omlejring resulterer i ERG overekspression [1]. Sidstnævnte blev rapporteret at fremme kræft cellemigration og invasion samt cellulære dedifferentiering og transformation [8] – [11]. Rolle ETS omlægning i udviklingen af ​​prostatakræft er heller ikke blevet afklaret. Mens nogle undersøgelser tyder en sammenhæng mellem omlejring-positive kræftformer, mere aggressive tumorer og en dårlig prognose (dvs. [12] – [14]), andre rapporterer ikke sådan forening (dvs. [15] – [17]); nogle endda rapportere en gunstig prognose (dvs. [18], [19]). Vi har naturligvis brug for flere oplysninger om ETS omlejring-positive prostatakræft for at forstå biologi prostatakræft.

En stor mængde genekspression data er blevet offentliggjort siden proceduren udtryk analyse ved hjælp mikroarrays blev etableret mere end et årti siden [20]. Disse undersøgelser har rapporteret en række forskellige ændringer i genekspression forbundet med forskellige sygdomme, herunder prostatacancer. Validering af den store mængde af data fra genekspression eksperimenter er udfordrende. Bare et lille antal af de identificerede kandidater er blevet funktionelt valideret. Disse data er langt fra udtømmende og stadig indeholder en masse oplysninger afventer udnyttelse. Meta-analyser tilladelser kombineret analyser af de enkelte studier er mindre påvirket af lokale fund, og tillade reduktion af data for at opnå solide resultater.

Vi præsenterer en meta-analyse af publicerede genekspression data med henblik på at identificere transkriptionel ændringer i prostatacancer. Vores tilgang omfattede sammenligning af prostatacancer versus godartet prostata væv, og ERG omlejring-positive (ERG +) til ERG omlejring-negative (ERG-) prostatakræft. Vi valideret resultaterne af vores meta-analyse ved hjælp af data fra en uafhængig microarray undersøgelse og bekræftet udvalgte mål ved immunhistokemi. Vi udførte også indledende funktionelle undersøgelser for en af ​​de mest fremtrædende regulerede gener, nemlig neuropeptid Y (NPY). Vores resultater viser, at ERG-rearrangementer muligvis fremkalde metaboliske ændringer i kræftceller ved at aktivere de store metaboliske signalmolekyler såsom NPY.

Materialer og metoder

Sample kohorter

Vævsprøver brugt for metaanalysen er beskrevet andetsteds (undersøgelser og henvisninger i tabel 1). Vævsprøver for validering udtryk studiet og immunhistokemiske undersøgelser blev udvalgt fra Innsbruck prostatakræft biobank. Denne biobank blev etableret i løbet af tidlig påvisning program tyrolsk for prostatakræft ved Institut of Urology, Innsbruck Medical University [21]. Skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter og dokumenteret i databasen fra University Hospital Innsbruck i aftale med lovbestemmelser og kravene i den etiske komité i Innsbruck Medical University. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Innsbruck Medical University (Undersøgelse nr. AM 3174, ændringsforslag 2). Kohorter analyseret her var følgende: a) Expression analyse valideringsstudie; 57 prostatakræft væv; GSC 5 n = 1, GSC 6 n = 5, GSC 7 n = 36, GSC 8 n = 3, GSC 9 n = 11, GSC 10 n = 1; patientens alder, middelværdi ± standardafvigelse (SD), 61,7 ± 6,9 år; patienternes serum prostataspecifikt antigen (PSA) niveau, 7,4 ± 5,0 ng /ml. b) Immunohistokemisk undersøgelse; 93 prostatakræft væv, GSR 5 n = 19, GSR 6 n = 22, GSR 7 n = 32, GSR 8 n = 10, GSR 9 n = 10; patientens alder, middelværdi ± standardafvigelse (SD), 60,6 ± 6,4 år; PSA-niveau, 6,6 ± 5,4 ng /ml.

Meta-analyse

Vi valgte otte udtryk undersøgelser, omfattende 561 humane prostata væv, for meta-analyse (tabel 1, figur S1). Disse er opført i databaserne Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [22], Array Express (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress) [23] og Oncomine (https://www.oncomine.org) [24]. Alle undersøgelser blev udført ved hjælp af Affymetrix microarray teknologi.

For integrativ analyse af microarray data, rådata, som er lagret i CEL-filer, blev normaliseret ved hjælp gcRMA algoritme [25], [26]. For nærmere oplysninger om studiet-specifikke data forbehandling, se supplerende metoder. For at udføre en tværgående undersøgelse sammenligning af genekspressionsniveauer, blev platform-specifikt gen probe-sæt identifikatorer kortlagt til et fælles namespace, som tidligere beskrevet [27], [28]. Her blev platform-specifikke identifikatorer kortlagt til Entrez gen id’er ved hjælp af de nuværende probeset /Entrez tilknytninger fra BioMart via biomaRt pakke [29]. Uanset hvor mere end én probe-sæt blev kortlagt til en Entrez gen identifikator, blev probe-sæt med den højeste varians anvendes til analyse. For at identificere differentielt regulerede gener brugte vi en to-trins tilgang. Først, vi afledt kombineret p-værdier på tværs af studierne hjælp Fishers omvendte chi-squared metode [30]. Vi derefter beregnet kombineret (vægtede) Fold ændringer. I en tidligere undersøgelse, forfatterne brugte en permutation test for at vurdere signifikans [27]. Vi, på den anden side, afledt af oplysninger fra en chi i anden-fordeling, som foreslået i [31]. Se supplerende metoder til detaljer om p-værdier og fold-change beregninger. Funktionel annotation gruppering af resultaterne af meta-analyse blev udført ved hjælp af DAVID-databasen (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [32].

Validering Expression Analysis

En uafhængig microarray datasæt (GSE32571) tidligere genereret af medforfattere blev anvendt til validering af ERG-associerede gen signatur. Til de foreliggende analyser blev prostatakræft væv (n = 57) tilknyttet grupperne ERG + og ERG- bruger break-apart fluorescerende in situ hybridisering (FISH) assay som tidligere beskrevet [33]. Vævsprøver blev isoleret ved macrodissection fra 10 um kryosektioner. Totalt RNA blev isoleret med EZ1 RNA Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner, checket for kvalitet ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), og kvantificeret. Total RNA blev forberedt til hybridisering på Illumina human Sentrix-12 BeadChip arrays (Illumina) i henhold til producentens anbefalinger. Illumina microarray data blev behandlet ved hjælp af den open source pipeline “Lumi” [34]. Efter fraktil normalisering blev differentiel ekspression af gener bestemt under anvendelse af R-pakken “LIMMA” [35]. Detaljerede metoder og kliniske data for udtrykket valideringsundersøgelse er beskrevet andetsteds [36]

Immunhistokemi

væv slides (n = 10) og væv microarrays (TMAS;. N = 92; diameter 0,6 mm ) indeholdende cancer (n = 3) og godartet (n = 1) kerner af prostatavæv fra prostatacancerpatienter blev anvendt til immunhistokemisk analyse. Alle vævsprøver blev farvet for ERG. Ni prøver blev udelukket på grund af deres lille mængde tumorvæv. 24 væv viste meget svag eller heterogen ERG farvning, mens 69 væv med mellemliggende til stærk eller negativ ERG farvning blev tildelt grupperne ERG + og ERG- hhv. 61 vævsprøver blev anvendt til immunhistokemisk sammenligning af ERG + og ERG-. Antigen-genvinding og immunohistokemi blev udført under anvendelse af en Discovery XT automatiseret slide-farvning systemet (Ventana Medical Systems). Alle mål antistoffer blev testet på en test væv microarray indeholder forskellige humane vævsprøver. Immunohistokemisk farvning blev vurderet af en erfaren uropathologist (G.S.). blev etableret Optimale antigen hentning betingelser for alle target antistoffer. Target antistoffer, leverandører, varenumre, og anvendte koncentrationer var som følger: anti-AZGP1, Sigma, HPA-012.582, 01:50; anti-ERG, Epitomics, EPR3864, 1:100; anti-GPR116, IMGENEX, IMG-71635, 1:100; anti-neuropeptid Y, Abcam, ab30914, 1:200; anti-PLA2g7, Sigma, HPA-0.035.915, 1:400; anti-HPGD, Atlas, HPA004919, 1:75; anti-TFF3, strategiske Diagnostics, 29.940.002, 1:5000. Antigen-genvinding for alle antistoffer blev udført ved varme forbehandling ved 98 ° C i 1 time i CC1, en tris-buffer med en svagt basisk pH. Target antistoffer blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C, efterfulgt af iView DAB detektion (diaminobenzidin visualisering, Ventana Medical Systems) og hematoxylin modfarvning. Billeder er erhvervet ved hjælp af en Axio Imager M1 mikroskop (Zeiss) og TissueFAXS software (TissueGnostics). Kvantitativ immunhistokemisk analyse blev udført under anvendelse af HistoQuest immunhistokemi analyse software (TissueGnostics), som er en celle-baseret farvningsintensitet analyseværktøj anvender en nuklear cellulær identifikationsmarkør (i dette tilfælde hematoxylin), efterfulgt af kvantitativ analyse af en given markør mærkes på et andet farve (i dette tilfælde cytoplasmatisk farvning med diaminobenzidin, DAB, brun).

Cell Culture Eksperimenter

DU145, DUCaP, LNCaP, PC3 og VCAP er derivater af prostatakræft metastaser. Disse blev indkøbt fra ATCC og dyrket i henhold til ATCC anbefalinger. EP156T og RWPE-1 er udødeliggjort godartede prostata epitelceller, mens CAF og PM151T er prostata stromale celler [37] – [39]. Benigne og stromale celler blev dyrket som tidligere beskrevet [37] – [39]. Identiteten af ​​cancercellelinier blev bekræftet ved retsmedicinske DNA fingeraftryk fremgangsmåder, der anvender den AmpFlSTR® SGM Plus® PCR-amplifikation kit (Applied Biosystems).

Celler blev podet i 24-brønds plader, serum sultet og behandlet med 25 nM rekombinant NPY /24 timer (Sigma) for en samlet periode på 48 timer. Totale celleantal bestemtes under anvendelse af CASY celletæller og analysesystemer (Schärfe System). Glucoseniveauer blev målt i cellekultursupernatanter under anvendelse af Gluc Cell glucose overvågningssystem (Thermo Fisher Scientific). qPCR og immunoblot blev udført som beskrevet tidligere [40]

Statistik

Statistiske beregninger for meta-analyse og validering udtryk analyse blev udført ved hjælp af R (http:. //www.r-project .org), pakker fra BioConductor open source bioinformatik database [41] og funktioner MADAM [42].

statistiske beregninger for immunohistokemi og cellekultur blev udført ved hjælp af SPSS 18 til Windows. The Kolmogorov-Smirnov-testen blev anvendt til at undersøge normale fordeling af datasæt. Ikke-normalfordelte data og data med Gaussisk (normal) fordeling blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney U-test og t-test, henholdsvis for at beregne betydningen af ​​forskelle mellem grupperne. P-værdier under 0,05 blev anset for signifikante. Fejl barer i histogrammerne repræsenterer standardafvigelsen (SD) af mindst tre uafhængige forsøg.

Resultater

Meta-analyse på Udgivet Gene Expression Data til prostatakræft

for at undersøge ændringer i genekspression i humane prostatacancer, udførte vi en meta-analyse af offentliggjorte genekspression data. Otte uafhængige microarray studier blev inkluderet i meta-analysen, som bestod af 561 prostata vævsprøver (tabel 1). De følgende to spørgsmål blev undersøgt: a) sammenligning af genekspression i prostata cancer væv og benign prostata væv; og b) sammenligning af genekspression i ERG omlejring-positive (ERG +) og ERG omlejring-negative (ERG-) prostatakræft (studie plan i figur 1).

Meta-analyse blev udført på otte uafhængige genekspression undersøgelser, der fokuserer humane prostatavæv. To typer af sammenlignende analyser blev anvendt. Gener, der viser forskelligt regulerede ERG + og ERG- prostatakræft væv blev valideret ved hjælp af en uafhængig genekspression analyse (første validering) og immunhistokemisk farvning (anden validering kun for udvalgte gener).

Resultatet af vores meta -analyse er vist i figur 2A-B, og opført i tabellen S1A-B. Resultaterne af meta-analysen og de enkelte undersøgelser kan også ses online på https://prostatedb.eigenlab.net/. Ud over den mindre konservative Chi-squared metode, som vi anvendte til at udlede et resumé p-værdi [31], databasen opregner også en mere konservativ resumé p-værdi afledt ved en permutationel tilgang [27].

Gener differentielt reguleret i prostatacancer og benign prostata væv (A, C), og ERG + og ERG- prostatacancer væv (B, D). A-B) vulkan plots. Differentielt regulerede gener blev fremhævet, når mindst 2-fold ned- (grøn) eller opreguleret (rød), og havde en justeret p-værdi mindre end 0,1. C-D) grafisk diagram af de otte top-rangerede funktionelle klynger bestemt ved funktionelle annotation klyngedannelse, ved hjælp af DAVID database. Størrelsen af ​​klynger korrelerer med antallet af identificerede proteiner associeret med funktionelle annotation (fold-change 1.5). Når proteiner er til stede i mere end én klynge, er klyngerne forbundet med linjer. Tykkelsen af ​​forbindelseslinierne afspejler antallet af tilstedeværende proteiner i begge forbundet klynger. Data om 561 vævsprøver blev anvendt til meta-analyse.

Vi først sammenlignet prostatakræft væv med benign prostata væv. Med hensyn til gener, der var mindst 1,5 gange reguleret og afslørede en justeret p-værdi 0,1, fandt vi, at 280 gener var opreguleret (46 af dem mere end 2-fold), mens 275 gener var nedreguleret (36 mere end 2 gange) i prostata cancer væv sammenlignet med benigne prostatavæv (figur 2A, tabel S1A). Funktionel anmærkning afslørede, at differentielt regulerede gener (fold-ændring 1,5) kode for signalmolekyler (trans-membran og ekstracellulære signalering proteiner), strukturelle proteiner (cytoskeleton og celleadhæsionsproteiner) og proteiner involveret i proteolyse og sårheling (Figur 2C) . Proteiner, der vides at være associeret med prostatacancer (fx AMACR [43], AGR2 [44], CRISP3 [45], HPN [46], HOXC6 [47], OR51E2 [48]) samt proteiner ikke associeret med prostatacancer således langt (eksempler PPM1H, SLC4A4, CaMKK2) blev identificeret i meta-analysen.

Vi derefter sammenlignet ERG + og ERG- prostatakræft væv. Der forelå ingen oplysninger om ERG omlejring status prostatakræft prøver anvendt i undersøgelser af meta-analyse. ERG omlejring resulterer i ERG overekspression og observeres i ca. 50% af alle prostatakræft væv [1], [3]. Vi delte alle prostatakræft prøver af de undersøgelser, der indgår i metaanalysen i tre grupper baseret på deres ERG udtryk niveau: ERG overekspression-positive prøver, ERG mellemliggende prøver, og ERG overekspression-negative prøver (Figur S2). Hver gruppe bestod af en tredjedel af alle prøver af én undersøgelse. ERG overekspression-positive prøver blev antaget at være ERG omlejring-positive og tildelt ERG + kategori, mens ERG overekspression-negative prøver blev antaget at være ERG omlejring-negative og tildelt ERG- kategori. Prøver tildelt ERG mellemliggende gruppe blev udelukket fra analysen for at sikre nøjagtig sammenligning af ERG + og ERG- prostatakræft prøver. Anvendelsen af ​​ERG ekspression som et surrogat for genomlejring-status er blevet beskrevet tidligere [49] og blev bekræftet i vores egen microarray undersøgelse som beskrevet nedenfor. Den sammenlignende meta-analyse viste 109 opreguleres og 58 ned-regulerede gener (fold-change 1.5; justeret p-værdi 0,1; 36 gener var mere end 2-fold regulerede) i ERG + sammenlignet med ERG- prostata cancer (figur 2B, tabel S1B). Differentielt regulerede gener var relateret til de funktionelle klynger signalering (ekstracellulære signalering peptider og hormon-signalering), vedhæftning (celleadhæsion og ekstracellulære matrix proteiner) og forsvar respons (sårheling og inflammatorisk respons, Figur 2D).

Vores meta-analyse afslørede ændringer i genekspression i forskellige undergrupper under udviklingen af ​​prostatakræft. En række undersøgelser omfatter uafhængige patientkohorter blev inkluderet i analysen. Derfor er de identificerede ændringer i genekspression betyde generelle befolkningsundersøgelser-uafhængige virkninger i forbindelse med prostatakræft.

Meta-analyse Validering af Independent Expression Analysis

Vi derefter valideret resultaterne af vores meta-analyse. Vi fokuserede på en sammenligning af ERG + og ERG- prostatakræft, fordi disse undertyper blev beskrevet for nylig og har ikke blevet grundigt undersøgt indtil videre. For validering af metaanalysen brugte vi data fra en uafhængig udtryk undersøgelse udført på en alternativ udtryk platform (Illumina). Valideringen undersøgelse adskiller sig fra de meta-analyse undersøgelser i følgende aspekter: a) uafhængige patient- kohorte (n = 57) vælges fra Innsbruck prostatakræft biobank; b) alternativ genekspression teknologi (valideringsundersøgelse Illumina BeadChip arrays, meta-analyse undersøgelser, Affymetrix GeneChip microarrays); og c) ERG + og ERG- gruppetildelingen (figur 3A). I metaanalysen blev ERG + og ERG- væv tildelt i henhold til ERG ekspressionsniveauerne. I valideringsundersøgelsen ERG omlejring-status blev bestemt ved fluorescens in situ hybridisering ved anvendelse af en pause fra hinanden assay som tidligere beskrevet [33] (Figur S3A).

84% af alle gener viser sig at være forskelligt reguleret i ERG + og ERG- væv (fold-ændring 2) blev verificeret af en uafhængig udtryk undersøgelse. A) Undersøgelse egenskaber. B) ERG ekspressionsniveauerne i ERG omlejring-positive og ekskluderet væv af valideringen undersøgelsen. ERG omlejringer blev bestemt ved fluorescerende in situ-hybridisering. C) Gener differentielt reguleret i ERG + og ERG- væv. D) Valideret regulerede gener i meta-analyse og validering studiet. P-værdi korrigeret BH; Fishers kombinerede p-værdi, Benjamini-Hochberg korrigeret.

Vi først bekræftet, at ERG omlejring resulterede i ERG overekspression (figur 3B, fig S3A-C), hvilket viser, at ERG + og ERG- grupper var korrekt tildelt i metaanalysen samt valideringsundersøgelsen. Vi analyserede derefter ekspression af de 155 gener (12 gener blev udelukket på grund af manglende eller overflødige probe sæt) identificeres som værende forskelligt reguleret i ERG + og ERG- væv i metaanalyse (FC 1,5; p 0,1). 49% (76/155) af alle gener viser sig at være forskelligt reguleret i ERG + og ERG- prostatakræft i metaanalysen blev kontrolleret i valideringsundersøgelsen. Når valideringen analyse var begrænset til gener, der var reguleret mindst 2 gange i meta-analyse, disse udgjorde 84% (27/32) (figur 3C-D, tabel S2). Når vi analyserede validering udtryk undersøgelsen som en uafhængig undersøgelse og undersøgt alle gener i arrays, disse stadig udgjorde 20% og 41% for FC 1,5 og FC 2 (tabel S2). Den overensstemmelse mellem meta-analyse og den uafhængige validering studiet viste, at vores meta-analyse genereret robuste resultater, der var uafhængig af prøven kohorte, prøve opgaven, og ansat genekspression teknologi.

Protein Analysis Brug Immunhistokemi

Vores undersøgelse havde været fokuseret på mRNA ekspressionsniveauer indtil dette tidspunkt. Vi undersøgte derefter, om proteiner kodet af de differentielt regulerede gener findes i forskellige mængder i ERG + og ERG- prostatakræft væv. Vi valgte uafhængige væv (der ikke anvendes til udtryk analyse) fra Innsbruck prostatakræft biobank med henblik på yderligere at sikre, at vores undersøgelse ville afsløre generelle ERG + prostatakræft-relaterede forandringer i stedet for patient-specifikke forskelle.

For at tildele væv til grupperne ERG + og ERG-, vi bestemt ERG protein niveauer ved immunhistokemi anvendelse af et antistof, der tidligere er angivet for dette program [50]. ERG immunhistokemi tilladt en klar sondring mellem ERG + og ERG- væv. I overensstemmelse med publicerede data vedrørende ERG + væv, farvningen intensiteten af ​​ERG varierede fra stærk til svag (figur S4A) [50]. Nogle væv optrådte heterogene for ERG. Begge ERG-positive og ERG-negative cancerceller var til stede i disse væv (fig s4b). Farvning kontroller blev udført på a) benign prostata celler, som er negative for ERG (fig S4C, venstre billede); b) endotelceller og lymfocytter, som pletten positive for ERG [50], og have en intern farvning kontrol (eksempel i figur S4C, højre billede); og c) cellelinier, der repræsenterer ERG + (VCAP) eller ERG- (DU145) prostatacancer (fig S4D). I overensstemmelse med tidligere rapporter, cirka halvdelen (her 60%) af alle undersøgte prostata væv dukkede ERG-positive (sammenfatning af 93 prostata kræfttilfælde i figur S4E) [1], [3]. For at afspejle den meta-analysen blev væv med høj til mellemliggende ERG farvning sammenlignet med væv med negativ ERG farvning; væv med heterogen og lav ERG farvning blev udelukket

Seks målgener blev udsat for protein validering:.

GPR116

,

NPY

PLA2G7

, tre gener overudtrykt i ERG + væv og

AZGP1, HPGD

TFF3

, tre gener nedreguleret i ERG + prostatakræft væv. I fire af de testede gener, protein niveauer afspejlede regulering af mRNA: NPY og PLA2G7 var opreguleret i ERG + væv mens AZGP1 og TFF3 optrådte nedreguleret (figur 4). TFF3 er blevet rapporteret at være differentielt reguleret i ERG + væv [51]; derfor kun 11 prøver blev anvendt til sammenligning. I tråd med vores data, blev PLA2G7 nylig rapporteret at være relateret til ERG + tumorer [52]. Protein niveauer af target gener

GPR116

og

HPGD

ikke blev ændret på en sammenligning af ERG + og ERG- prostatacancer (data ikke vist). Det er fortsat uklart, om de observerede mellem mRNA og protein niveauer af disse to gener afvigelser afspejler biologiske (forskellige regulering på mRNA og protein niveau) eller teknisk (antistof ydeevne) variationer.

A) Konsekutive lysbilleder af prostata væv af to repræsentative patienter. B) Kvantificering af vævsprøver opnået fra 61 forskellige patienter med prostatacancer ved hjælp af immunhistokemi kvantificering software HistoQuest. HistoQuest skelner ikke mellem epitel og stromaceller. Forskelle i farvningsintensitet i epitelceller overstiger forskellene vist i box-blotting. Bar, 100 uM. Statistik, Mann Whitney U-test; *, P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001

ERG-associeret ekspression af NPY inducerer Øget glukoseoptagelse i Prostata Cancer Cells

For at få nye indsigter om den rolle, ERG-omrokeringer i prostatakræft undersøgte vi funktionerne af differentielt regulerede gener i ERG + prostatacancerceller. NPY blev udvalgt til funktionel analyse. NPY er en lille neuropeptid med blev beskrevet som en central regulator af energibalancen i den menneskelige krop (gennemgået i [53]). Vi målte glukoseoptagelse

in vitro

at afgøre, om NPY inducerer metaboliske ændringer i prostata kræftceller.

Vi bekræftede NPY overekspression i ERG + prostatakræft-cellelinier hjælp qPCR og immunoblotting. qPCR ekspressionsniveauer af NPY afslørede højeste udtryk for NPY-mRNA i ERG + cellelinier DUCaP og VCap sammenlignet med andre prostata cellelinier (figur 5A). NPY protein var påviseligt ved udelukkende immunoblotting i DUCaP og VCap (figur 5B). Da vi behandlede prostatacancerceller som ikke udtrykker endogen NPY (DU145, LNCaP og PC3) med rekombinant NPY (48 h, 25 nM), observerede vi større glucoseoptagelse i NPY-behandlede celler end i ubehandlede celler (figur 5C). Denne effekt blev ikke observeret i celler, der udtrykker endogene NPY (VCAP, figur 5C). For at undersøge om humane prostata væv er potentielt NPY lydhør, vi endelig sammenlignet udtryk for NPY og NPY-responsive receptorer NPY1R, NPY5R og NPY2R (NPY affinitet rangeret, [54]) i prostata med dem i andre menneskelige organer, ved hjælp af Oncomine database (https://www.oncomine.org) [24]. Vi fandt NPY at være mere rigelige i godartede og ondartede prostatavæv sammenlignet med benigne og cancerøse væv hidrørende fra andre organer mens NPYRs blev udtrykt i et tilsvarende omfang i prostata og andre væv (repræsentative studier er vist i figur S5). Således kan flere væv være NPY lydhør. Prostata frembringer imidlertid signifikante niveauer af endogen NPY. Tilsammen vore data viser, at ERG-omlejringer i prostatacancer er forbundet med en række transkriptionelle ændringer i cancerceller, herunder ekspressionen af ​​metaboliske sensorer som NPY.

NPY blev målt ved qPCR (A) og immunoblot (B ) i prostatacellelinjer. NPY udtryk var højest i ERG + DuCAP og VCAP prostata kræftceller. C) NPY stimulation (48 h, 25 nM) øget glucoseoptagelse i prostatacancerceller som ikke udtrykker endogen NPY (DU145, LNCaP, PC3). PC, prostatacancer-cellelinier; BP, godartede prostata-cellelinjer; PS, prostata stromale cellelinier.

Diskussion

Denne undersøgelse blev udført for at bestemme ændringer i genekspression i prostatacancer, som skyldes generelle ændringer relateret til prostata og uafhængigt af patientens kohorter, tekniske variationer og den anvendte metode. Vi fokuserede på transkriptionelle ændringer i ERG omlejring-positive (ERG +) prostatacancer, fordi disse tumorer udgjorde en mindre karakteriseret undergruppe af prostatakræft. Vi forventede resultaterne af denne undersøgelse at give en offentligt tilgængelig database for genekspression ændringer i prostatakræft og give ny indsigt i biologi ERG + prostatakræft. Vi observerede, for første gang, at ERG omlejringer eventuelt er forbundet med metaboliske ændringer i prostatacancerceller.

Vores meta-analyse bestod af 561 væv hidrørende fra otte uafhængige undersøgelser.