PLoS ONE: Immunhistokemi af tyk- og endetarmskræft Biomarkør Phosphorylering Kræver Kontrolleret vævsfiksering

Abstrakt

Phosphoryleret signalmolekyler er biomarkører for kræft patofysiologi og modstandsdygtighed over for terapi, men fordi phosphoprotein analytter er ofte labile, kunne dårligt kontrollerede kliniske laboratoriepraksis forhindre oversættelse af forskningsresultater på dette område fra bænken til bedside. Vi sammenlignede derfor flere biomarkør og phosphoprotein immunhistokemisk (IHC) resulterer i 23 kliniske kolorektal karcinom prøver efter enten en roman, hurtig vævsfiksering protokol eller et standard vævsfiksering protokol ansat af kliniske laboratorier, og vi undersøgte også effekten af ​​en defineret postoperativ “kold” iskæmi periode på disse IHC resultater. Vi fandt, at en times kold iskæmi interval, tillades af retningslinjer ASCO /CAP for visse cancer biomarkør-analyser, er yderst skadelig for visse phosphoprotein analytter, specielt det phosphorylerede epidermal vækstfaktor receptor (pEGFR), men kortere iskæmiske intervaller (mindre end 17 minut) lette bevarelse af phosphoproteiner. For det andet, fandt vi, at en hurtig 4 timers, to temperatur, formalinfiksering gav overlegen farvning i flere tilfælde med udvalgte markører (pEGFR, pBAD, Pakt) sammenlignet med en standard natten over stuetemperatur fiksering protokol, trods tager mindre tid. Disse resultater viser, at de fremtidige forsknings- og kliniske forsyningsvirksomheder af phosphoprotein IHC for vurdering kolorektal carcinom patofysiologi absolut afhænge af opmærksomhed på præanalytiske faktorer og strengt kontrollerede vævsfiksering protokoller

Henvisning:. Theiss AP, Chafin D, Bauer DR, Grogan TM, Baird GS (2014) Immunhistokemi af kolorektal cancer Biomarkør Phosphorylering Kræver Kontrolleret vævsfiksering. PLoS ONE 9 (11): e113608. doi: 10,1371 /journal.pone.0113608

Redaktør: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center, USA

Modtaget: 18 juni 2014 Accepteret den 28. oktober 2014 Udgivet: November 19, 2014

Copyright: © 2014 Theiss et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret delvist af en forskningsbevilling til GSB fra Ventana Medical Systems, Inc. Der er ingen tilskud nummer tilknyttet denne kontrakt forskning give. Denne undersøgelse var et samarbejde mellem GSB institut og Ventana, og dermed Ventana medarbejdere var involveret i alle faser af denne forskning (studie design, dataindsamling, analyse, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet). Den resterende del af dette arbejde blev finansieret af interne University of Washington midler

Konkurrerende interesser:. Geoffrey Baird har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: De angivne forfattere er ansat i Ventana Medical Systems, Inc. Dette ændrer ikke nogen forfatterens tilslutning til PLoS ONE politik.

Introduktion

i målrettet terapi af kolorektal cancer, der er aktuelle opmærksomhed placeret på vigtigheden af ​​at identificere aktivering tilstande af celle signalering molekyler til forudsigelse af reaktioner på behandlingen. Et eksempel herpå er den EGFR-medieret reaktivering af MAPK signalering, som bidrager til ufølsomhed af BRAF-mutant kolorektale karcinomer til RAF hæmning med Vemurafenib [1]. Vigtigere denne pEGFR reaktivering begivenhed er omfattet af gradueringen af ​​EGFR-hæmmere, og den kombinerede polyterapi BRAF og EGFR-hæmmere overvinde denne modstand, med gavnlig respons

in vitro

i dyremodeller

in vivo

.

udvidelsen af ​​disse tidligere laboratorieresultater til klinikken, og vores evne til at påvirke alternative behandlinger, er helt afhængig af vores evne til præcist at bevare og registrere de aktivering stater pågældende. I forsøget på at bestemme den optimale konservering (vævsfiksering) betingelser for at støtte målrettet terapi, har litteraturen fået os til at sætte spørgsmålstegn hvorvidt standard praksis i anatomisk patologi laboratorium er tilstrækkelige til at løse alle de potentielle faldgruber, der kunne påvirke biomarkør /aktivering tilstand bevarelse. For eksempel i vores eget klinisk laboratorium erfaring, kan vævsprøver forblive ved stuetemperatur før neddypning i fiksativ i længere perioder, og det faktiske tidsforbrug i et fiksativ, og temperaturen af ​​denne fiksativ, undertiden dårligt kontrolleret. Nuværende amerikanske faglige retningslinjer om dette spørgsmål [2] – [4] fat kun et begrænset antal kliniske typer prøve og nedstrøms biomarkør analyser, eller er stadig ret bred i at definere, hvad der betragtes som acceptabelt i form af fiksering tid (en 2-fold variation i maksimal fiksering tid, 16-32 timer, anbefales i CLSI retningslinjer, og en 12-fold vifte af fiksering varighed, 6-72 timer, betragtes som acceptabelt i ASCO /CAP brystkræft markør retningslinjer). En præ-fiksering “kold iskæmi” tid på op til en time, anses ligeledes for acceptabel i et af disse retningslinjer [3], som er inden for området af, hvad vi har observeret klinisk i vores egne institutioner. Tidligere kræft biomarkør immunhistokemi undersøgelser har faktisk fundet ~ 1 time iskæmi gange acceptabel, selv om disse undersøgelser primært har fokuseret på etablerede biomarkører såsom østrogen-receptor og HER2 [5], [6]. Men af ​​de retningslinjer, der findes, ingen foregiver at løse bevarelsen af ​​biomarkør aktivering stater, såsom phosphoryleringsassays stater, overhovedet. Dette er særligt problematisk, fordi phosphoryleringstilstande har været kendt i nogen tid til at være meget følsomme over for præanalytiske vej [7] -. [9], herunder varme iskæmiske lejligheder [10] (som ikke undersøgt her)

til dette formål har vi udviklet en ny, hurtig to-temperatur formalin fiksering strategi, som vi fandt bevarer centrale elementer i væv såsom morfologi, samt protein-ekspression som vurderet ved immunhistokemi [11]. I dette arbejde, fandt vi signifikant Pakt konservering i en Calu3 mus xenotransplantationsmodel, som vurderet ved IHC under anvendelse af en to-temperatur fiksering protokol, og vi fandt, at denne farvning blev næsten helt tabt hjælp normal rumtemperatur fiksering. Bevæger sig fremad fra denne undersøgelse, udvidet vi vores undersøgelse kolorektale carcinoma prøver, analysere for yderligere phosphoepitopes. I denne aktuelle omfattende undersøgelse, spurgte vi, hvorvidt de to-temperatur-teknologi desuden hjulpet i at bevare aktiveringstilstanden af ​​biomarkører relevante for kolorektal cancer terapi, såvel som hvorvidt kontrollerende pre-fiksering kolde iskæmiske intervaller var vigtigt for disse biomarkører. Brug af 23 colorectalt carcinom kirurgiske prøver indsamlet med definerede kolde iskæmiske intervaller og formalinfiksering protokoller, studerede vi phosphoryleringstilstanden af ​​talrige PI3 kinasebanen mål, samt BRAF V600E mutation og andre markører ved anvendelse af immunhistokemi [12], [13]. Vi rapporterer her om både betydningen af ​​kolde iskæmisk tid som en variabel i phosphoprotein analyse, samt den samlede effekt af vores hurtige to-temperatur formalin fiksering protokol.

Materialer og metoder

Sample Indsamling og Fiksering

menneskelige kolon carcinoma prøver blev opnået fra Indivumed GmbH (Hamburg, Tyskland) som paraffinindlejrede blokke. Prøver blev indsamlet ved Indivumed fordi Ventana er ikke en medicinsk facilitet, og derfor ikke har adgang til kirurgiske prøver og også fordi Indivumed var kendt for at være i stand til at give vævsprøver med en dokumenteret kort (mindre end 17 minutter) efter excision iskæmisk interval. Indivumed forskere udførte væv samlinger under godkendelse fra deres lokale institutionelle review board, og fået skriftligt samtykke fra de involverede patienter.

Til alle eksperimenter blev fiksering protokoller udført af Indivumed videnskabsmænd, og bestod af nedsænkning i 10% neutral bufret formalin (10% mættet vandig formaldehyd fra Fisher Scientific, Houston, TX, pufret til pH 6,8-7,2 med 100 mM phosphatbuffer) i varierende tider ved temperaturer fra 4-45 ° C. Stuetemperatur lå fra 20-25 ° C. Vævsprøver indsamlet fra kliniske tilfælde blev opdelt i tredjedele, og hver fast forskelligt. Ét stykke blev indpakket i saltvand gennemvædet gaze og holdt ved stuetemperatur i 1 time ( “1 time kold iskæmi”) inden 24 timer fiksering ved stuetemperatur. Dette var at teste virkningen af ​​den længere guideline-ordineret kold iskæmi tidsrum på en time. De resterende to stykker var at teste virkningen af ​​kortere (mindre end 17 minutter) kold iskæmi interval. Ét stykke blev anbragt direkte i stuetemperatur formalin i 24 timer ( “24 hr”). En tredje stykke blev anbragt direkte i 4 ° C formalin i 2 timer, efterfulgt af 2 timer i 45 ° C formalin ( “2 + 2”) [11]. Sidstnævnte var at teste, om processen kan fremskyndes for at øge effektiviteten på hospitalet. Fiksering blev udført i 100-500 ml dækket bægerglas i et køleskab i 4 ° C behandling, eller i et standard kemisk stinkskab for højere temperaturer. Kolde iskæmi tider for “24” og “2 + 2” prøver i gennemsnit 10 +/- 3 minutter (range 6-17 min). Downstream vævsbehandling blev udført som beskrevet [11], med alle opløsningsmidler processor trin holdes ved 45 ° C under omgivende tryk, og paraffin trin blev holdt ved 60 ° C under vakuum. Alle prøver blev indlejret i paraffin og skåret på objektglas som 4-mikron sektioner for IHC eller histomorphology.

Automatiseret Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført på en VENTANA Discovery XT automatisk farvning instrumentet ifølge producentens anvisninger. Objektglas blev de-paraffinized hjælp EZprep løsning (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) i 30 minutter ved 75 ° C. Epitopgenfinding blev gennemført på den automatiserede farvningsværktøjet med CC1 løsning (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) i 64 minutter ved 95 ° C. Antistoffer opnået fra cellesignalering Technologies eller Epitomics blev først titreret over et område af koncentrationer for at tilvejebringe det optimale forhold mellem specifik farvning til baggrundsfarvning. Når titre blev sat, blev antistoffer overført med fortynder til bruger indtastningsklare dispensere til brug på automatiseret farvningsværktøjet. Slides blev udviklet ved hjælp af Opti

visning

DAB afsløring kit (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Kort beskrevet trin inkluderet inhibitor i 8 minutter, linker i 8 minutter, multimer i 12 minutter, DAB /peroxid i 8 minutter og kobber i 4 minutter. Objektglas blev derefter modfarvet med hæmatoxylin II i 8 minutter (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Antistoffer, kloner, og titre er anført i tabel 1. Antistoftitre blev bestemt for hvert antistof ved hjælp af positive og negative kontrolprøver væv efter producentens anvisninger.

Immunhistokemi Analyse

Immunohistokemiske analyser var scoret af to uafhængige patologer, hver blindet til fiksering metode for hvert dias, ved hjælp af en H-score for semiquantitation af farvning andel og intensitet [14]. I tilfælde med både

in situ

og invasiv neoplasi, blev kun den invasive tumor væk fra udkanten af ​​vævsprøve scoret. Høj intensitet farvning, der klart var forvist til de absolutte væv marginer (dvs. hvad der almindeligvis omtales i klinisk immunhistokemi som en “kant effekt” [15]) blev ignoreret. Scores blev afblindes af en tredjepart, og alle H scoringer fra hvert patolog blev plottet mod hinanden for hver markør. Scores der optrådte subjektivt afvigende, dvs. dem, der væsentligt afveg fra den linje af identitet som vurderet ved visuel inspektion, blev revideret i fællesskab på en multi-headed mikroskop og et konsensus point er genereret.

Statistisk analyse

All analyse blev udført ved anvendelse af R-statistikker pakken. For hvert tilfælde blev H scoringer fra de to korrekturlæsere gennemsnit. Statistiske forskelle mellem fiksering grupper (24 timers vs 2 + 2, 24 timers vs kold iskæmi) ved hjælp af en to-sidet parret Wilcoxon-test. Fordi flere betingelser blev vurderet på samme tid, blev p-værdier for disse sammenligninger konverteret til falske opdagelse sats-korrigeret q-værdier [16], [17]. Boxplots i figur 1 blev genereret med pakken ggplot2. Sorte søjler repræsenterer medianværdier og kasser strækker sig fra 25

th til 75

th percentiler. Whiskers udvides til 1,5 × det interkvartile afstand.

H snesevis af farvning intensitet for alle undersøgte biomarkører, ved behandling tilstand. “2 + 2” er den hurtige fiksering tilstand, “24 timer.” Er den standard 24-timers stuetemperatur tilstand uden pre-fiksering kold iskæmi, og “Iskæmi” betegner en 1-times koldt iskæmisk periode forud for 24-timers room fiksering temperatur. Medianerne er repræsenteret ved horisontale linjer, kasserne i parceller svarer til 25

th og 75 percentiler for hver distribution, knurhår udvides til den mest ekstreme værdi, der er inden for 1,5 gange afstanden mellem første og tredje kvartiler, og data ud over de knurhår vises som prikker.

resultater

H-score for alle markører er grafisk repræsenteret i boxplots figur 1, og resultaterne af test sammenligning er vist i tabel 2 .

Meget få tilfælde viste nogen mærkbar farvning for tre af markørerne (BRAF V600E, pMEK1 /2, og Pakt), men to tilfælde var entydigt positivt for BRAF V600E mutation, en konstatering bekræftes af molekylær analyse (data ikke vist). Samlet, 2 + 2-protokol gav så meget eller mere IHC signal end 24 hr behandling, med repræsentative farvningsresultater vist i figur 2. Mens flere sagsspecifikke forskelle er fremhævet i figur 2, var der ingen statistisk signifikante forskelle observeret på flere parvise sammenligninger på tværs af de 24 tilfælde (tabel 2). Tabel 2 viser, at to markører syntes at have lidt større farvning i 24 timers behandling (EGFR og pERK), men igen, disse forskelle var ikke statistisk signifikant, heller ikke de patologer scoring prøverne finder alle tilfælde, hvor afvigende farvning mellem 2 + 2 og 24 timers betingelser ville føre til en ændring i patofysiologisk fortolkning af disse to markører.

Repræsentative resultater fra IHC analyse af to colon carcinoma prøver underkastes enten den hurtige fiksering tilstand ( “2 + 2”) eller standard 24 -timers stuetemperatur tilstand uden pre-fiksering kold iskæmi ( “24 timer”). pERK, pMTOR, pMEK1 /2 og pPRAS40 er vist for en sag og pBAD og Pakt vises fra et andet tilfælde. To forskellige sager er vist her, fordi ikke alle tilfælde viste farvning for alle markører. Alle mikrografer er taget ved 200 × med ækvivalente engagementer.

IHC signal blev meget mere skadeligt påvirket af den længere 1 times kold iskæmi periode forud for fiksering i forhold til de kortere iskæmiske interval protokoller, med undtagelse af EGFR. Disse tendenser var stærkt statistisk signifikant for pEGFR og pMSK1, og reduktionen i pERK farvning nærmede statistisk signifikans. I to tilfælde i specifikke, vist i figur 3 og 4, carcinomer huser BRAF V600E mutation viste sig at være klart positive for pEGFR i begge af de kortere iskæmiske interval betingelser, men farvning var næsten helt fraværende, når prøven blev udsat for længere 1 time kold iskæmi tilstand.

Repræsentative billeder af en colon carcinom tilfælde farvet med antistoffer mod BRAF V600E, pEGFR, EGFR, og pMSK1, der viser betydelige tab af pEGFR farvning i iskæmi tilstand. Alle mikrografer er taget på 200 × med tilsvarende engagementer.

repræsentant for en anden colon carcinom tilfælde farvet med antistoffer mod BRAF V600E, pEGFR, PTEN, og pMSK1, viser betydelige tab af pEGFR farvning i iskæmi tilstand. Alle mikrografer er taget på 200 × med tilsvarende engagementer.

Diskussion

Resultaterne af denne undersøgelse viser klart, at en væsentlig post-kirurgisk, præ-fiksering koldt iskæmisk interval (en time ) forvirrer forsøg på at identificere de phosphoryleringstilstande af en nøgle PI3 kinase pathway element i formalin-fikseret væv. Dette fund er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der angiver den betydelige præanalytiske følsomhed phosphoprotein analyser [7], [18]. Hvis omhyggelig prøvehåndtering er ansat til at minimere den kolde iskæmisk interval (mindre end 17 minutter), men både 24-timers stuetemperatur formalin fiksering og vores hurtige to-temperatur fiksering protokol bevare phosphoryleringsbegivenheder signaler i gennemsnit for stort set alle de undersøgte markører. Hvorfor nogle markører blev mere påvirket af kold iskæmi er uklart for os; balancen mellem uhindret kinase og phosphatase aktivitet under kolde iskæmiske intervaller er ikke sandsynligt, at spille ud identisk for hver fosforylering mål, men så identificere disse mål med overdrevne følsomhed for kold iskæmi gennem undersøgelser som denne, vil være af afgørende betydning, da området phosphoprotein immunhistokemi fremskridt.

Når forudfastsættelse koldt iskæmi tid strækker sig til en time anses en acceptabel interval i de nuværende retningslinjer ASCO /CAP for ER test [3], fandt vi, at signalet fra udvalgte phosphoproteiner mindskes betydeligt. Konkret i to eksemplarer fundet at havnen BRAF V600E mutation (figur 3 og 4), den 1-times koldt iskæmisk interval syntes at tilsløre udtryk for pEGFR, en fejl, der kunne føre til manglende identifikation disse patienter som kandidater til yderligere terapi [12], [13], [19]. I disse to tilfælde, den hurtige to-temperatur fiksering protokol gav synligt mere pEGFR farvning end 24 timers fiksering protokol, hvilket indikerer, at den hurtige protokol kunne være en mere robust metode til vurdering dette klinisk signifikant biomarkør aktivering tilstand. observeres En lignende tendens i nogle yderligere markører (f.eks. pBAD, Pakt) i de udvalgte sager, der er vist i figur 2. Dette resultat klart accentuerer den potentielle virkning af præanalytiske præparatbehandling i en tid med personlig medicin, da bevarelsen af ​​biomarkør aktivering stater synes at være relativt konstant i gennemsnit mellem fiksering protokoller for nogle biomarkører, men adskiller sig væsentligt i særlige tilfælde.

Flere undersøgelser har nu identificeret, at MAPK pathway reaktivering udgør en mekanisme for terapi modstand i BRAF V600E muteret kolorektale karcinomer der behandles med Vemurafenib [1], [20], [21].

In vitro

xenograftmodeller viser, at denne resistente tilstand kunne overvindes ved dobbeltterapi herunder EGFR inhibitorer er rettet mod pEGFR, men denne fremgangsmåde er baseret på evnen af ​​diagnostiker at identificere pEGFR overekspression i den kliniske vævsprøve. Mens den eksisterende litteratur viser, at dobbelt terapi rummer meget potentiale til gavn for patienter med disse specifikke tumor fænotyper, vores resultater viser, at alt dette potentielle fordel er i fare, hvis en ukontrolleret vævskonservering og fiksering proces er ansat. De to patienter, hvis carcinomer nærede BRAF V600E mutationer, for eksempel, ville ikke blive identificeret som kandidater til EGFR-rettet terapi havde deres prøver indsamlet med længere man timers kold iskæmisk interval, der ikke kun set i kliniske patologi områder, men er også anses for acceptabel i en aktuel cancer biomarkør analyse retningslinje. Ud over disse kliniske overvejelser, er det også værd at overveje de ekstreme omkostninger forbundet med nye målrettede behandlinger, således at misidentifying patienter som kandidater til behandlinger kunne være ikke blot personligt skadeligt, men også økonomisk spild.

Udover BRAFV600E /pEGFR eksempel er det også bemærkelsesværdigt, perk ekspression er formindsket efter 1 time kold iskæmi (se tabel 2). Da pERK er blevet anvendt til at overvåge terapi effekt, denne effekt, hvis de forekommer i et klinisk assay potentielt kan forringe overvågning terapi. Også i udvalgte tilfælde (figur 2), tilsyneladende pBAD udtryk kan reduceres ved forudfastsættelse iskæmi, confounding vores evne til at vurdere udtryk for en faktor kendt for at være relevante for tyktarmskræft patogenese [19].

Et potentielt svaghed med denne undersøgelse er, at relativt få prøver blev undersøgt. Mens alle prøver blev analyseret for alle markører, de høje omkostninger og vanskeligheden ved at opnå prøver med præcist definerede præanalytiske behandlinger fra vores kommercielle leverandør udelukket studiet af flere prøver. Det er klart, ville yderligere større undersøgelser være gavnligt at bekræfte disse resultater. Arbejdet med xenograftmodeller kunne også forventes at være en fordel på dette område, og det har jo været så i vores tidligere arbejde om dette emne [11] på grund af den udsøgte kontrol over præanalytiske forhold, der er mulig i disse systemer. Men vi valgte at arbejde på kliniske prøver her på grund af deres øgede betydning for de aktuelle problemer i translationel kræftforskning. Det skal bemærkes, at de 10-minutters gennemsnitlig kold iskæmi tider af prøver indsamlet under denne forsøgsprotokol ikke typisk observeres i løbende anatomisk patologi praksis, heller ikke kan sådanne hurtige kold iskæmi gange kunne opnås med nuværende processer på plads i kliniske laboratorier. Selv om det kan være en udfordring at indarbejde vores resultater i standard kliniske arbejdsgange, fordi mange nuværende medicinske faciliteter er ikke i stand til at reducere iskæmiske gange betydeligt, vi mener, at vores data tyder på, at standardisering og optimering af præanalytiske forhold er mindst et værdigt mål.

En anden potentiel svaghed er, at phosphoprotein signal scores på tværs af behandling betingelser ikke blev sammenlignet ved hjælp score tærskler klinisk validerede, simpelthen fordi der ikke findes sådanne tærskler for de undersøgte her markører. Hvad vi observeret med vores semikvantitativ tilgang, var imidlertid, at signaler blev ofte reduceret dramatisk i prøver med en lang forudfastsættelse iskæmisk interval, og at der i de to konkrete sager, vi diskuterede, den lange forudfastsættelse iskæmisk interval syntes at ablatere alle relevante signal fra en kritisk biomarkør. I disse tilfælde, de kontrollerede fiksering protokoller undersøgte vi bevarede signaler, der sandsynligvis ville blive fortolket, i medicinsk vurdering af to praktiserende patologer, som patofysiologisk relevante for potentiel terapi.

Endelig mens vi har fortolket tab på phosphoprotein IHC signaler som tegn på skadelige præanalytiske effekter, kunne det være tilfældet, at stigninger i farvningen var de sande artefakter og det faldt farvning var tættere på den sande tilstand

in situ

. andre har imidlertid demonstreret, at mange phosphomarkers, herunder Pakt, er klart mindre i forbindelse med ændrede fiksering betingelser eller kold iskæmi [22], [23], så vores fortolkning er ikke uden fortilfælde. Mens dette spørgsmål aldrig kan løses uden fremtid

in vivo

studier, hvad der er helt klart fra dette arbejde er, at ændringer i de tilsyneladende aktivering stater i mange relevante kræft biomarkører synes at være følsomme over for fælles præanalytiske variabler. Af disse variabler, det iskæmiske interval er måske et af de vigtigste, og vi mener derfor, at yderligere forskning og kliniske undersøgelser skal omfatte kontrol, adresse denne faktor.

Støtte Information

tabel S1.

Raw H-score data for alle undersøgte sager i denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0113608.s001

(XLSX)