PLoS ONE: Undecylprodigiosin induceret apoptose i P388 Cancer Cells er forbundet med dets binding til Ribosome

Abstrakt

Prodigiosins (PG) er en familie af naturlige røde pigmenter med anticancer aktivitet, og et medlem af familien har indgået klinisk fase II forsøg. Imidlertid anticancer mekanismer PG’er stort set uklar. Denne undersøgelse blev designet til at undersøge den molekylære basis for anticanceraktivitet af UP, et derivat af PG’er, i P388-celler. Ved at indføre farmakologiske inhibitorer og anvendelse af en række analytiske metoder, herunder Western-blotting, flowcytometri og konfokal laser mikroskopi, fandt vi, at UP inhiberede proliferation af P388 via arrestere celler ved G2 /M-fasen og inducerende celler apoptose, som var relateret til aktiveringen af P38, JNK snarere end ERK1 /2 signalering. ROS regenerering og forsuring i celler synes ikke involveret i UP induceret apoptose. Endvidere udnytte massespektrometri, sucrosemassefyldegradient fraktionering og immunfluorescensfarvning, opdagede vi, at op tilsyneladende var placeret på ribosomet. Disse resultater sammen indikerer, at ribosomet kan være potentielle mål for UP i kræftceller, som åbnede en ny avenue i afgrænse anticancer mekanisme PG’er

Henvisning:. Liu P, Wang Yy, Qi X, Gu Q, Geng M, Li J (2013) Undecylprodigiosin induceret apoptose i P388 Cancer Cells er forbundet med dets binding til ribosomet. PLoS ONE 8 (6): e65381. doi: 10,1371 /journal.pone.0065381

Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, Canada

Modtaget: 5. november 2012; Accepteret: April 24, 2013; Udgivet 14. juni, 2013 |

Copyright: © 2013 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National High-tech R 99,5%. 4,6-diamidino-2-phenyllindile (DAPI), propidiumiodid (PI). Føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra GIBCO (Gaithersburg, MD). En forøget kemiluminescens (ECL) kit blev købt fra PIERCE (Holmdel, NJ) .U0126, SP60012, SB203580, SRB, DCFH-DA, BCECF AM, AO blev alle købt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, Kina). PARP, Cyt C, caspase-3, Caspse-8, caspase-9, β-actin, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38 og P38 antistof blev indkøbt fra Cell Signaling (Beverly, MA). Ribosomprotein S3 antistof blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

cellelinjer og Kultur

Cellelinjer blev købt fra Institut for Biokemi og Cellebiologi (Shanghai, Kina) og vedligeholdes i henhold til leverandørens anvisninger. Kort fortalt blev P388-celler opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles minimale essentielle medium (DMEM); A459-celler blev dyrket i F12K-medium. Begge medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum. Cellerne blev holdt i 5% CO2 ved 37 ° C.

celleproliferationsassay

celleproliferation blev målt ved SRB-assay. P388-celler blev dyrket ved 8 × 10

3 celler /brønd i plader med 96 brønde og derefter behandlet med OP i 72 timer. I nogle forsøg blev cellerne forbehandlet med NAC, iminazole eller MAPK inhibitor i 1 time. Cellerne blev inkuberet med 16% trichloreddikesyre (TCA) ved 4 ° C i 1 time, hvorefter blev pladerne vasket fem gange med koldt vand, blev det overskydende vand aftappes og pladerne efterladt til tørring i luft. SRB plet (100 pi, 0,4% i 1% eddikesyre) blev tilsat til hver brønd og efterlades i kontakt med cellerne i 30 min, hvorefter cellerne blev vasket med 1% eddikesyre i fem gange. Pladerne blev tørret og 150 pi 10 mM Tris-base (pH 10,5) blev tilsat til hver brønd for at opløse farvestoffet i 30 minutter. Absorbansen (OD) af hver brønd blev aflæst på en mikropladelæser (Tecan, Østrig) ved 490 nm bølgelængde. Den% af cellelevedygtighed = (OD af behandlede celler /OD af kontrol celler) × 100%.

DNA Content Analysis

P388 celler blev udpladet i 100 mm dyrkningsskål ved 2 × 10

5 celler /skål, 24 timer senere blev cellerne behandlet med OP i 24 timer. Derefter blev cellerne høstet, fikseret med 70% kold ethanol ved 4 ° C i 12 timer, inkuberet med RNase A (30 ug /ml) i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter farvet med propidiumiodid (50 ug /ml ) ved 4 ° C i 30 minutter. Cellulært DNA blev analyseret ved flowcytometri (Vantage, Becton Dickinson, San Jose, CA).

Western blot-analyse

Efter OP (0,05 uM) behandling i 1 h eller 24 h, 1 × 10

6 celler blev vasket med PBS og derefter lyseret med RIPA (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS) i 30 minutter på is. Cellelysatet blev påsat til elektroforese i 10% SDS-PAGE. De separerede proteiner blev elektroforetisk blottet på NC-membran (Millipore, USA). Membranerne blev blokeret i 5% fedtfri mælk fortyndet i TBS-T i 2 timer ved stuetemperatur og derefter inkuberet natten over med antistoffer for PARP, Cyt C, Caspase-8, 9, 3, s-AKT, AKT, p- ERK, ERK, p-JNK, JNK, p-P38 og P38. Gede-anti-kanin-IgG konjugeret til peberrodsperoxidase (1:3000 fortynding) blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Mellem hver inkubation blev membranerne vasket 3 x 5 min i TBS-T. Antistofbinding blev påvist med forøget kemiluminescens-reagens.

Lokalisering af UP i Celler

P388 celler dyrket på dækglas blev behandlet med OP (0,05 uM) .at 37 ° C i 1 time. Efter tre gange vask med PBS blev cellerne derefter inkuberet med DAPI. De dækglas blev undersøgt med en laser konfokalt (LSM510-Meta, Zeiss, tysk) [10].

AO Farvning

De levende dyrkede celler blev farvet med acridinorange som tidligere beskrevet [ ,,,0],11], [12]. Kort fortalt blev P388 celler på et kammer slide udsat for op til 1 time. Derefter blev cellerne inkuberet med 5 ug /ml acridinorange i 30 min ved 37 ° C i mørke. Kammeret Objektglassene blev vasket med Hanks opløsning og derpå blev undersøgt under anvendelse af konfokal laser mikroskopi.

Påvisning af intracellulære pH (pHi)

P388 celler blev udsat for 0,05 uM UP i 1 time. Dyrkede celler blev vasket med PBS, centrifugeret og fyldt med 10 pM 29, 79-bis- (carboxyethyl) -5 (69) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM) ved 37 ° C i 30 minutter i PBS. Efter centrifugering blev cellerne resuspenderet i PBS og analyseret ved flowcytometri [4].

Påvisning af intracellulære reaktive oxygenarter (ROS)

Intracellulær oxidativt stress blev vurderet ved at måle intracellulær oxidation af 2 ‘, 7’-dichlorofluorescin (DCFH). Substratet er DCFH-DA som let diffunderer ind i cellen og dernæst deacetyleret ved cellulære esteraser til den mere hydrofile, ikke-fluorescerende DCFH. ROS-generering i cellen oxiderer DCFH til den fluorescerende 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein (DCF). P388-celler blev podet og inkuberet med OP (0,05 uM) i 1 time, derefter høstede celler, vasket og påført med DCFH (10 uM) ved 37 ° C i 30 minutter. Derefter blev cellerne høstet, vasket og påført med DCFH (10 uM) ved 37 ° C i 30 minutter. Endelig blev cellerne vasket med PBS, og cellulært fluorescens blev erhvervet ved anvendelse af flowcytometri med excitation ved 488 nm og emission ved 530 nm [13], [14].

Native-PAGE og massespektrometrianalyse

efter inkubering med OP (0,05 uM) i 1 time ved 37 ° C, P388 celler blev høstet og lyseret med lyseringsbuffer (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100) i 30 min på is, centrifugeret ved 12.000 g i 20 minutter ved 4 ° C. Et tilsvarende volumen af ​​ladningsbuffer (50 mM trisbase, 30% glycerol, 0,01% bromphenolblåt) blev tilsat til supernatanten. Prøverne blev separeret på 8% nativ PAGE, og strimlen blev skåret efter farve UP. Proteinerne binder med UP blev analyseret med LC-ESI-LTQ (Thermo Finnigan LTQ) mod NCBI museprotein database [15].

saccharosedensitetsgradient Fraktionering

For at forberede cytoplasmatisk ekstrakt for ribosomale fraktionering blev P388-celler behandlet med 0,05 uM UP i 1 time, derefter vasket med iskoldt PBS to gange og lyseret i iskold RIPA i 30 min, derefter centrifugeret ved 10.000 x g i 15 minutter for at fjerne den resulterende supernatant af kerner, mitokondrier og snavs. Lysat proteinopløsning blev lagt over 9 ml lineær sucrosegradient opløsning (10-50%) i et 11,5 ml Sorvall centrifugerør og centrifugeret ved 35.000 x g i 3 timer ved 4 ° C i ultracentrifuge (Beckman Optima tm L-100 XP). Kun UP uden lysat oven på lineær sucrosegradient opløsning blev anvendt som kontrol [16].

immunfluorescensfarvning

P388 celler blev inokuleret i en seks-brønds plade og dyrket natten over. Celler blev udsat for OP (0,05 uM) i 1 time. Celler blev skyllet to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseret i 10 minutter med 4% formaldehyd. Derefter blev cellerne vasket to gange med PBS og derefter permeabiliseret i 10 minutter med 0,1% Triton X-100 blev cellerne præinkuberet med PBS indeholdende 1% BSA i 20-30 min og farvet med ribosomalt protein S3 antistof natten over ved 4 ° C, efterfulgt af inkubation med anti-muse-IgG-FITC i 30 minutter. Cellerne blev derefter vasket med PBS og undersøgt ved hjælp af konfokal laser-scanning mikroskoper [17].

Resultater

UP hæmmer væksten af ​​P388 Celler

For at bestemme den cytotoksiske effekt UP på P388 celler, blev SRB-assay anvendes til at vurdere celleproliferation efter 72 h behandling. I et koncentrationsområde på 0,0048 til 15

μ

Μ, UP behandling resulterede i en koncentrationsafhængig inhibering i cellevækst af P388-celler. IC

20 og IC

50 på P388 celler 0,0049

μ

Μ og 0,042

μ

Μ (fig. 2).

Celler var behandlet med angivne koncentration af UP og PG i 72 timer. De viste data repræsenterer de procentdele af cellelevedygtighed af tre uafhængige forsøg med tre bestemmelser i hver. **,

s

0,01 og ***, s. 0,001 vs. Kontrol

UP inducerer G2 /M Phase og apoptose i P388 Cells

undertrykkelsen af ​​kræft cellevækst har været kendt for at være primært medieret af apoptose og cellecyklusstop. Vi anvendte næste flowcytometri til analyse cellecyklus fasefordeling og apoptose ved UP behandling. P388 celler behandlet med OP (0,05 uM) i 24 timer viste akkumulering i G2 /M (40.73%) med et samtidigt fald i G0 /G1-fasen celler, hvilket antyder en cellecyklusstandsning ved G2 /M-fasen. UP inducerede også en højere procentdel af sub G0 /G1 befolkning, der indikerer apoptose forekomst. Ca. 8,23% celler var apoptotiske, når de behandles med OP i 24 timer i modsætning til 1% apoptotiske celler i den ubehandlede kontrolgruppe. Endvidere undersøgte vi UP induceret poly (ADP-ribose) polymerase spaltning, et kendetegn for apoptose, der angiver aktivering af caspaser. Resultaterne viste, at hydrolyse af 116 KD poly (ADP-ribose) polymerase proteinet til 85 KD blev detekteret i UP behandlede celler efter 24-timers udsættelse ved 0,05 uM. For at undersøge om caspaser var involveret i UP induceret apoptose, blev western blot-analyse gennemføres med yderligere bekræfter den pågældende caspase-3, caspase-8 og caspase-9. blev afsløret cleavaged bånd af procaspase-3, procaspase-8 og procaspase-9 efter behandling med OP i 24 timer, hvilket indikerer aktiveringen af ​​caspase-3, caspase-8 og caspase-9.

A. DNA histogrammer for P388 celler dyrket i medium alene, eller i DMSO (1:1000) eller i nærvær af 0,05 uM PG og OP i 24 timer. B. Ekspression af apoptose-relaterede proteiner blev bestemt ved immunblotting med specifikke antistoffer efter eksponering for OP i 24 timer. Udtrykket blev kvantificeret ved hjælp af edb-billedanalyse-system ImageQuant. Hver kolonne repræsenterer dem scannet i to eksemplarer af tre brønde udtrykt som procentdel af kontrol ± standardafvigelse. *,

P

0,05, OP vs. Blank. C. repræsentant flowcytometri profiler ved rhodamin 123-farvning, efter at cellerne blev inkuberet med 0,05 uM UP i 24 timer. a, DMSO; B, 0,05 uM PG; c, 0,05 μΜ UP.

Vi næste undersøgt mitokondrie frigivelse af Cyt C, opstrøms vej af caspase 9. Efter 24 h behandling med UP, frigivelse af Cyt C i cytosolen var betydeligt steget, mens Cyt C i mitokondrierne faldt tydeligvis (fig. 3B). Det har været kendt, at frigivelse af intermembrane proteiner som Cyt C forekommer efter integriteten af ​​mitokondrie membran blev svækket, hvilket fører til en afbrydelse af den indre transmembranpotentiale (A ^ m). Virkningen af ​​UP på mitokondrie transmembrane potentiale (A ^ m) blev yderligere vurderet ved hjælp rhodamin 123, en specifik fluorescerende probe. Fluorescensintensiteten blev signifikant reduceret i UP behandlede celler sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 3C). Disse resultater sammen tyder på, at den indre mitokondrielle apoptosecyklus, der involverer caspase-9 og -3, er impliceret i UP-induceret apoptose i P388 celler.

OP Overvejende lokaliserer i Cytoplasma

UP udsender rødt fluorescens ved 488 nm excitation, hvilket kan visualiseres i levende celler. P388 celler blev farvet med DNA bindende farvestof DAPI efter 1 time udsættelse for 0,05 uM OP for at undersøge sub-cellulære lokalisering af UP. Cellerne blev afbildet under konfokal laser mikroskopi. Som vist i fig. 4, UP blev overvejende lokaliseret i cytoplasmaet, men ikke membran eller i kernen.

Den blå repræsenterer kernen farvning og den røde repræsenterer UP.

UP Aktiverer MAPK men ikke AKT Signaling

for at bestemme den potentielle inddragelse af protein kinase veje i G2 /M anholdelse og apoptose induceret af UP, vi undersøgt phosphorylering status af fire store proteinkinaser som vedrører celle proliferation i P388 celler efter udsat for UP i 1 time. Som vist i fig. 5A, OP tydeligvis øget niveauerne af phospho-ERK1 /2, phospho-p38MAPK, og phospho-JNK1 /2, hvorimod AKT phosphoryleringsstatus knapt blev påvirket. Samlet proteinindhold af de respektive proteinkinaser blev ikke ændret.

A. Virkninger af eksponering af P388-celler til 0,05 pM DIG i 1 time på phosphoryleringsstatussen og ekspressionsniveauet af proteinkinaser. Udtrykket blev kvantificeret ved hjælp af edb-billedanalyse-system ImageQuant. Hver kolonne repræsenterer dem scannet i to eksemplarer af tre brønde udtrykt som procentdel af kontrol ± standardafvigelse. ***,

P

0,001, OP vs. Control. B. Virkninger af MAPK inhibitorer på UP-induceret P388 vækstinhibering blev cellerne forbehandlet med U0126 (10 uM), SP60012 (20 uM) eller SB203580 (20 uM) i 1 time, derefter co-behandlet med OP i 72 timer. U0126, ERK-inhibitor; SP60012 (SP), JNK-inhibitor; SB203580 (SB), P38-inhibitor. **, P 0,01, PG vs. (PG + inhibitor), OP vs. (UP + inhibitor)

For yderligere at tage fat om ERK1 /2, JNK1 /2 eller P38 var involveret i UP. -inhibited cellevækst, blev celler inkuberet med eller uden inhibitoren af ​​ERK1 /2, JNK1 /2 og P38 henholdsvis og derefter cotreated med 0,05 uM OP i 72 timer. Celleproliferation blev estimeret ved SRB-metoden. Som vist i fig. 5B, ingen af ​​disse inhibitorer påvirkede proliferation cellerne per se. SP og SB men ikke U0126 tydeligvis tilbageføres den inhibitoriske virkning af UP på proliferation af P388-celler, hvilket indikerer, at JNK1 /2 og P38 aktivering blev involveret i UP-induceret apoptose. Kun P38 aktivering viste sig at være relateret til PG-induceret apoptose, hvilket var i overensstemmelse med litteraturen rapporter [18].

NAC undlader at redde UP Forårsaget Hæmning af Cell Proliferation

Det er rapporteret at PG’er kan inducere ROS-produktion i celler [19]. For at undersøge den mulige inddragelse af ROS i UP-induceret apoptose og G2 /M fase anholdelse i P388 celler, vi først målte ROS generation i cellerne. Resultaterne viste, at ROS-generering blev forøget så tidligt som 1 time efter UP behandling (fig. 6A). For at afsløre, om de ROS generation regnskab for UP-induceret apoptose, blev en ROS ådselsæder NAC brugt før UP behandling. Som vist i fig. 6A, NAC undladt at redde væksten hæmning fremkaldt af UP og PG, hvor der i modsætning H

2O

2 undertrykt celleproliferation blev klart vendes ved NAC behandling. Disse resultater antyder, at ROS-generering er mest sandsynligt ikke involveret i UP-induceret apoptose.

A. P388-celler blev behandlet med 0,05 uM UP i 1 time og farvet med DCFH (10 uM). Fluorescens blev målt ved flowcytometri. a, DMSO + DCFH; B, 0,05 uM PG; c, 0,05 uM PG + DCFH; d, 0,05 uM UP; e, 0,05 uM UP + DCFH. B. P388 celler blev forbehandling med eller uden NAC (0,5 mM) i 1 time, derefter celler samtidig var inkuberet med PG (0,05 uM), OP (0,05 uM) og H

2O

2 (0,4 mM) i 72 timer. *, P. 0,05, H

2O

2 vs (H

2O

2 + NAC)

Forsuring deltager ikke i UP forårsaget Vækst Inhibition

Acridin orange er en “syre- tropic” svag base, der er taget op af levende celler og akkumuleres i syrnede rum såsom lysosomer [17], [20]. Fluorescens af acridinorange er grøn ved lave koncentrationer, hvorimod ved høje koncentrationer fluorescens skifter til orange [17]. Vi observerede indlysende forsvinden i orange granulater i celler efter kort behandling (1 time) med 0,05 uM PG og UP (fig. 7A). Ændringerne Phi blev også analyseret ved flowcytometri med BCECF-AM, en membran-gennemtrængelig fluorescerende indikator til måling af cytoplasmatisk pH. Vi fandt, at phi faldet betydeligt i PG eller op-behandlede celler (fig. 7B) sammenlignet med ubehandlede celler.

A. Acridinorange farvning af P388 celler, PG og MP var 0,05 uM, AO var 5 ug /ml. Orange granulater blev forsuret rum. B. repræsentere data af flow-cytometrisk analyse under anvendelse pHi 10 uM BCECF-AM-farvning efter at cellerne blev inkuberet med 0,05 uM PG eller op i 24 timer med eller uden imidazol (0,5 mM) forbehandling i 1 time. a, kontrol; b, PG; c, PG + imidazol; d, UP; e, UP + imidazol C. Virkning af forsuring hæmmer på UP-induceret P388 vækstinhibering, blev cellerne forbehandlet med imidazol (0,5 mM) i 1 time, derefter co-behandlet med PG (0,05 uM) og OP (0,05 uM) i 72 h.

i modsætning hertil celle-gennemtrængelige baser imidazol behandling markant forhindret faldet i phi. Vi derefter testet, om OP-forårsaget vækstinhibering kunne reddes af imidazol. Samtidig til UP eksponering, var vi ikke i stand til at identificere signifikante forskelle i forhold til celler behandlet, om kun 3% genvinding (fig. 7C), tyder på, at forsuring af cytoplasma bør ikke være den vigtigste grund af apoptose induceret af UP. PG blev bemærket at have lignende resultater til UP.

OP binder sig til ribosomet i P388 Celler

Vi fortsatte med at identificere de molekylære mål af UP i P388 celler ved at identificere UP bindende proteiner ved hjælp af massespektrometri analyse. UP migration kan nemt observeres med et blotte øje som et band i orange farve i native PAGE (Fig. 8A). Gelen bånd blev skåret og underkastet massespektrometrianalyse. blev påvist i alt 951 proteiner, heriblandt 171 proteiner, til vores overraskelse, var ribosomale proteiner med højere CoverPercent (tabel 1), hvilket tyder på, at UP primært kan binde til ribosomet.

A. Striben af ​​UP i Native-PAGE. B. sucrosemassefyldegradient fraktionering af UP-behandlede P388-celler og alene. C og D. Subcellulær lokalisering af Rps3 og UP i P388-celler (C) og A549-celler (D) detekteres ved konfokal. UP fluorescens vises i rødt, Rps3 fluorescens i grøn og colokalisering (fusionere) i gult.

For yderligere validering blev P388 celler inkuberet med OP på 0,05 uM i 1 time og ribosom blev isoleret ved sucrosemassefyldegradient fraktionering. Sammenligning med kontrolgruppen, hvor UP blev beriget ved toppen af ​​saccharose tæthed løsning blev indlysende lagdelte farve-bånd fundet i UP behandlede celler (fig. 8B), støtter en forestilling om, at UP binder til ribosomet. Vi har registreret også colokalisering mellem UP og ribosom hjælp konfokalt mikroskop i begge P388 celler (Fig. 8C) og A549-celler (fig. 8d). Immunofluorescens farvning viste, at UP colocalized at ribosomet identificerede ved endogen Rps3 i de to cellelinjer.

Diskussion

Indtil dato, anticancer mekanisme PG’er har stadig ikke afklaret i detaljer. For eksempel Francisco R rapporterede PG påvirket mitokondrier, udøvede en afkobling effekt på den elektroniske kæde, blev cellekernen bevaret fra prodigiosin adgang [17]. Men resultaterne af Montaner B anførte, at apoptose induceret af PG’er blev kobber-medieret spaltning af DNA [21]. Jing Zhang et al. rapporterede også, at PG’er øget intercellulære ROS, hvilket førte til cytotoksiske virkninger [19]. De molekylære mål for PG’er inkonsekvent rapporteres herunder JAK3, mTOR og NAG-1 [7], [8], [22]. I vores undersøgelse, mener vi, at UP-induceret apoptose i P388 celler er forbundet med UP-ribosom binding.

Vi fandt, at UP hæmmede celleproliferation, anholdt cellecyklus ved G2 /M-fasen, førte til aktivering af caspase 3, 8, 9, ændringer i mitokondrier membranpotentiale, frigivelse af Cyt C og spaltning af PARP. Disse resultater indikerer, at OP har cytotoksicitet til P388 og inducerer P388-celler apoptose involverer i mitokondrier apoptotiske vej mindst. For at belyse mekanismen underliggende apoptose induceret af UP, vi først vurderede celle fordeling af UP med sin autofluorescens, viste det resultat, at UP fordelt i cytoplasmaet, men ikke membran eller kerne, hvilket tyder os, at UP kan interagere med molekyler i cytoplasma at inducere apoptose.

PI3K /Akt pathway regulerer grundlæggende cellulære funktioner såsom cellevækst, overlevelse, og bevægelse. Ekstravagant aktivering af PI3K /Akt pathway er blevet rapporteret at være forbundet med udviklingen af ​​cancer. Akt kan også direkte regulere apoptotiske maskiner ved phosphorylering og inaktivere pro-apoptotiske proteiner såsom BAD desuden er Akt aktivitet kræves for G2 /M faseovergang og AKT hæmning ofte inducerer G2-M anholdelse [23]. Men i vore eksperimenter, UP blev ikke fundet at påvirke AKT aktivering af P388.

MAP kinaser er sammensat af serin /threonin proteinkinaser, herunder de ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK), den p38 MAPK, de c-Jun-NH2-terminale kinaser (JNK) og MAP-kinaser signalveje regulerer stort set alle aspekter af ondartet celle adfærd, spredning, overlevelse, migration og invasion [24]. Vores resultater viste, at UP aktiverer P38, ERK og JNK bemærkelsesværdigt. De selektive hæmmere af P38 og JNK stedet ERK-hæmmer, forhindrede P388 kræftceller fra cytotoksicitet induceret af UP. Disse resultater viser, at apoptose induceret af UP er relateret til aktivering af P38 og JNK, der er forskellig fra PG hvorved kun phosphorylering af p38 involverer i dens aktivitet.

ROS genereres intracellulært som biprodukter af normal aerob metabolisme eller som sekundære budbringere i forskellige signaltransduktionsveje eller som reaktion på miljøbetinget stress [25], [26]. Som specifikke sekundære budbringere i signaleringskaskader involveret i celleproliferation og differentiering, er ROS blevet impliceret i reguleringen af ​​forskellige cellulære funktioner, herunder intracellulære signalering transkriptionel aktivering, proliferation og apoptose [27]. I de seneste år, aktiverede mange forskningsmæssige fokus på forholdet mellem ROS og mitogen proteinkinase-MA

PK

signalveje. Ling Liu et al rapporterede, at NG-induceret apoptose af HepG2-celler var karakteristisk for intracellulær ROS-generering. Samtidig NG behandling kan føre til aktivering af phosphorylering af JNK- og p38, men ikke ERK1 /2. Vores data viste, at op induceret intracellulær ROS-produktion i P388-celler. Imidlertid kunne en ROS ådselsæder NAC ikke omvendt hæmning af spredning forårsaget af UP, selv om det naturligvis antagoniserede ROS produktion af H

2O

2. Disse resultater viser, at generering af ROS er ikke impliceret i apoptose induceret af UP.

phi inden sure organeller er ansvarlige for en lang række vigtige cellulære funktioner, såsom endocytose, exocytose og intracellulær transport, samt celledifferentiering, cellevækst og celledød. PHI i transformerede eller kræftceller generelt forbliver neutral eller endda lidt mere basisk end normale celler [28], er reguleret af en række phi homeostatiske mekanismer, herunder Na

+ /H

+, Na

+ – afhængig og uafhængig Cl

– /HCO

3

– vekslere, vakuolær type H

+ – ATPase (V-ATPase) og andre. Daigo Ya mamoto rapporterede, at den intracellulære forsuring af KPL-1 ved cPrG.HCl behandling induceret apoptose og cyklus anholdelse, som var stærkt undertrykt af imidazol, en celle-gennemtrængelig base. Det er blevet påvist, at bafilomycin A1, en potent selektiv hæmmer af vakuolær H

+ – ATPase [29] også inducerer et fald i intracellulært pH og hæmmer væksten af ​​forskellige cancer cellelinier [30]. Vi fandt også, at UP kunne formindske intracellulær pHi opdaget af konfokal og flowcytometri hhv. Imidlertid imidazol, en inhibitor af forsuring undladt at redde vækstinhibering af UP. Disse resultater udelukke muligheden af ​​forsuring i apoptose induceret af UP.

Ved at udnytte sin autofluorescens funktion, bemærkede vi, at UP primært er fordelt i cytoplasma. Vi yderligere isolerede proteiner binder til UP i native-PAGE-gel og indsendes til massespektrometri analyse. 171 proteiner fra 951 detekterbare proteiner blev ribosom-relaterede, hvilket antyder, at OP sandsynligvis kan binde til ribosomet. Vi yderligere valideret hypotesen ved sucrosemassefyldegradient fraktionering metode, en konventionel fremgangsmåde til isolering og studere ribosom og ved immunfluorescensfarvning at observere colokalisering af UP og ribosom i P388-celler og A549-celler. Ribosomale proteiner spiller flere roller i koordineringen protein biosyntese at opretholde celle homeostase og overlevelse. De seneste oplysninger tyder på, at en række ribosomale proteiner har sekundære funktioner uafhængigt af deres involvering i protein biosyntese. Disse proteiner fungerer som celleproliferation regulatorer og i nogle tilfælde som inducere af celledød [31], [32]. Johnson CR fandt, at interferens med 28S-rRNA af BCS indledt apoptose i Reh celler gennem rekruttering af SAPK-JNK signalering [33]. Bae HK rapporterede, at SG specifikt interageret med 40S og 60S ribosomale subunits så tidligt som 5 min i RAW 264.7 celler og induceret fosforylering af p38 og JNK [16]. I betragtning af at UP kunne inducere P388-celler apoptose involverer aktivering af P38 og JNK i vores tidligere undersøgelse har vi spekulere at apoptose af induceret af UP kan være relateret til UP-ribosom binding, som igen påvirker funktionen af ​​nogle ribosom proteiner og fører til apoptose. Det var også værd at nævne, at kun to mitokondrier proteiner blev påvist ved massespektrometri med coverprecent af protein. 10%, hvilket stort set udelukker muligheden for direkte målretning til mitokondrielle proteiner ved UP

Sammenfattende vores resultater præsenteres i denne undersøgelse udelukker deltagelse af ROS og forsuring i UP induceret apoptose, på trods af enorme litteratur. Vores data i stedet tyder på, at UP binder til ribosomet, som kan, i det mindste delvist, udløse P38, JNK signalering og mitokondrie pathway apoptose, i sidste ende fører til hæmning af celle proliferation.The målrettede ribosomale molekyler skal undersøges nærmere. Ikke desto mindre kunne ribosom eventuelt åbne en ny vej til at udforske anticancer mekanisme af PG’er i fremtiden.