PLoS ONE: Analyse af tarmlumen mikrobiota i en dyremodel af kolorektal cancer

Abstrakt

Seneste rapporter har antydet, at flere faktorer som vært genetik, miljø og kost kan fremme udviklingen af ​​sunde slimhinde mod sporadisk kolorektal carcinom. Akkumulerende beviser har desuden tilknyttet tarmbakterier med sygdom initiering og progression. For at undersøge og analysere sammensætningen af ​​tarmens mikrobiota i fravær af forstyrrende påvirkninger, har vi etableret en dyremodel af 1, 2-dimethylhydrazin (DMH) -induceret tyktarmskræft. Under anvendelse af denne model har vi udført pyrosekventering af V3-regionen af ​​16S rRNA-generne i denne undersøgelse for at bestemme mangfoldighed og bredde af de intestinale mikrobielle arter. Vores resultater viser, at den mikrobielle sammensætning tarmlumen varierer betydeligt mellem kontrol- og tumor- grupper. Den overflod af Firmicutes blev ophøjet mens overflod af Bacteroidetes og Spirokæter blev reduceret i lumen af ​​CRC rotter. Fusobacteria blev ikke påvist i nogen af ​​de raske rotter, og der var ingen signifikant forskel i observerede Proteobacteria arter når man sammenligner de bakterielle samfund mellem vore to grupper. Interessant, den overflod af Proteobacteria var højere i CRC rotter. På slægten niveau,

Bacteroides

udviste en relativt højere overflod i CRC rotter sammenlignet med kontroller (14,92% vs. 9,22%,

s

0,001). I mellemtiden,

Prevotella

(55,22% vs. 26,19%),

Lactobacillus

(3,71% vs. 2,32%) og

Treponema Hotel (3,04% vs. 2,43%), viste sig at være betydeligt mere rigelige i sunde rotter end CRC rotter (

s

0,001 henholdsvis). Vi viser også en betydelig reduktion af butyrat-producerende bakterier såsom

Roseburia

og

Eubacterium

i tarmen mikrobiota af CRC rotter. Desuden er en betydelig stigning i

Desulfovibrio, Erysipelotrichaceae

Fusobacterium

blev også observeret i tumor gruppen. Et fald i probiotiske arter som

Ruminococcus

Lactobacillus

blev ligeledes observeret i tumor gruppen. Tilsammen kan vi konkludere, at en væsentlig forskel i tarmens bakterieflora eksisterer mellem sunde rotter og CRC rotter

Henvisning:. Zhu Q, Jin Z, Wu W, Gao R, Guo B, Gao Z, et al. (2014) Analyse af tarmlumen mikrobiota i en dyremodel af kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (3): e90849. doi: 10,1371 /journal.pone.0090849

Redaktør: Georgina L. Hold, University of Aberdeen, England

Modtaget: December 10, 2013; Accepteret: 30 Jan 2014; Udgivet: 6 marts 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Nature Science Foundation of China (nr 81.230.057). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hvert år bliver cirka 1,2 millioner personer diagnosticeret med tyktarmskræft (CRC) på verdensplan [1]. CRC er den tredje mest almindelige cancer hos mænd, og den anden mest almindelig hos kvinder med hovedparten af ​​tilfælde, der opstår i den udviklede verden. En sammensat cellulær samfund eksisterer inden en malign tumor. Dette fællesskab blev udgjort af oncogenically transformerede celler, ikke-neoplastiske celler, såsom stromale og immunceller, og mikrober, såsom bakterier og vira i visse tilfælde [2]. Mange typer cancer er forbundet med infektiøse midler og disse kræftformer tendens til at forekomme i slimhindevæv, der har høj-niveau eksponering for mikrober. Nogle mener, at op til en femtedel af alle kræfttilfælde er forårsaget eller fremmet af smitstoffer [3]. For eksempel kan livmoderhalskræft og gastriske cancere være forårsaget af humane papillomavira og bakterien,

Helicobacter pylori

henholdsvis [4].

Det vurderes, at det samlede celleantal af forskellige bakteriearter i fordøjelsessystemet er 10

14, hvilket er mere end 10 gange antallet af eukaryote humane celler [5] og måske så mange som 10 gange mere virus. I en sund tarm, den normale bakterieflora opretholder homøostase med værten [6]. Imidlertid har ændringer i bakterielle populationer og deres metaboliske produkter blevet forbundet med adskillige sygdomme, herunder ulcerativ colitis, Crohns sygdom og CRC [7] – [9]. Og der er voksende rapporter om, at tarmens mikrobiota spiller vigtig rolle i udviklingen af ​​tyktarmen carcinogenese [10]. For eksempel, i modelstudier dyr, mutante mus, som er genetisk modtagelige for CRC fandtes at udvikle signifikant færre tumorer når det holdes i kim-fri miljøer [11]. Wei og hans kolleger bestemmes strukturen ændringer i tarmen mikrobiota af rotter udvikler forstadier slimhindelæsioner induceret af kræftfremkaldende DMH behandling, og viste, at den overflod af

Ruminococcus

-lignende og

Allobaculum

-lignende bakterier var steg i fæces DMH-behandlede rotter [12]. Moore og medarbejdere rapporterede også, at 15 bakteriearter fra humane fækale flora væsentligt var forbundet med en høj risiko for tyktarmskræft og fem var forbundet med lav risiko for tyktarmskræft [13]. Derudover blev Bacteroides og Bifidobacterium stærkest forbundet med øget risiko i deres undersøgelse af kaukasiske, japanske Hawaiian, og afrikanske patienter. Disse undersøgelser foreløbigt vist, at der var en tæt sammenhæng mellem tarmen mikrobiota og udvikling af CRC [13]. Der blev imidlertid ikke klare enkelt bakteriearter identificeret som risikofaktorer for CRC, fordi omkring 80% af de menneskelige bakterier blev anset dyrkbare [14]. For at overvinde dette problem og undersøge mikrobiel diversitet, har forskere vendt til området for metagenomics [15]. I 2011 var der fire kort i høj opløsning, der henviser til sammenhængen mellem menneskets colon dysbiosis og CRC opstod i træk, som rapporteret af tre uafhængige grupper [2], [8], [16], og flere bakteriearter viste sig at være fortrinsvis bebor enten tumorvæv eller omgivende ikke-tumorvæv. Den berigelse af

Fusobacterium spp.

I tumor prøver var slående lighed med disse dokumenterede CRC microbiomes. Især ét isolat af Fusobacteria (CC53), blev påvist at have invasivitet i dyrkede colon adenocarcinom-2 (Caco-2) celler [16]. Disse studier rapporteret også en relativ overflod af

Bacteroidaceae

,

Streptococcaceae

,

Fusobacteriaceae

,

Peptostreptococcaceae

,

Veillonellaceae

, og

Pasteurellaceae

i kræft væv i forhold til de normale intestinale lumen [17]. Desuden for at etablere kolorektal cancer-relaterede dysbiosis, Sobhani

et al

. undersøgte afføringen mikrobiota af normale og tyktarmskræft patienter ved hjælp pyrosekventering og efterfølgende principal komponent analyse (PCA) [18]. Og de detekteres en sammensætning i tarmen mikrobiota af CRC patienter. Især

Bacteroides

Prevotella

arter blev fundet at være mere rigelige i cancerpatienter end i kontrolindivider. Tilsammen disse undersøgelser viste, at tarmen mikrobiota kan spille en vigtig rolle i CRC udvikling

Host genetik, miljø og kost have en dramatisk effekt på værten mikrobiota af personer fra forskellige lande [19] -. [20 ]. Derfor kan vi observere eksisterer at variation i sammensætningen af ​​tarmens mikrobiota fører til kliniske sammenhænge mellem bakteriel infektion og CRC. I denne undersøgelse har vi etableret en dyremodel af 1,2-dimethylhydrazin (DMH) -induceret koloncancer og udførte pyrosekventering af 16S rRNA-generne til at sammenligne mikrobiota inden tarmlumen af ​​CRC rotter og raske kontroller. Vi har desuden identificeret bakterielle phylotypes der kan tjene som potentielle biomarkører i CRC udvikling.

Materialer og metoder

Dyr og reagenser

Fire uger gamle Wistar hanrotter (180 -200 g) købt fra Shanghai Skrig Laboratory Animal Corporation (Shanghai, Kina) blev anvendt til denne undersøgelse. Alle dyr blev huset i plastikbure (med fire eller fem rotter /bur) under kontrollerede fugtighed (44 ± 5%), lys (12 h lys /mørke cyklus) og temperatur (22 ± 2 ° C). 1, blev 2-Dimethylhydrazin (DMH) indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). DMH blev fremstillet frisk før anvendelse i 1 mM EDTA-saltvand og pH indstillet til 7,0 under anvendelse af fortyndet NaOH-opløsning.

Eksperimentelle procedurer

Fyrre 4 uger gamle Wistar-hanrotter blev inddelt i to grupper : a DMH-induceret-tumor-gruppe (TG, n = 30) og en ikke-DMH-induceret-tumor-gruppe (kontrolgruppe, CG, n = 10). Dyrene blev akklimatiseret til gnaver kost og vand

ad libitum

i 1 uge. Efter akklimatisering rotterne fra TG var intraperitonealt (i.p.) injiceret med DMH (40 mg /kg) en gang om ugen i 10 på hinanden følgende uger. De resterende 10 rotter blev intraperitonealt injiceret med EDTA – normalt saltvand som kontrol. Dyret vægte blev registreret en gang om ugen i forsøgsperioden. Begyndende på den 12. uge af protokollen blev tre rotter aflives hver 2. uge for at undersøge dannelsen af ​​kolon tumorer. Dyrene blev bedøvet med ketamin 100 mg /kg og Xylazin 15 mg /kg legemsvægt i.p. under aseptiske forhold. Hele tyktarmen blev fjernet kirurgisk og åbnet på langs. Afføringsprøver blev opsamlet og straks nedfrosset i flydende nitrogen. De fæcesprøver blev senere overført til -80 ° C, indtil DNA-ekstraktion blev udført. Tyktarmen blev fotograferet, og det samlede antal tumorer blev talt. Til histologisk undersøgelse blev tyktarmstumorer separat udskåret og fikseret i 10% neutral phosphatpufret formalin.

histologisk undersøgelse

til histologisk undersøgelse blev de fikserede væv indlejret og snit på 5 um intervaller. Væv blev farvet med standard hematoxylin og eosin til lysmikroskopisk undersøgelse. Vævssnit blev revideret af to uafhængige patologer i en blind måde. Enhver uoverensstemmelse mellem disse to efterforskere blev løst gennem revurdering af den tredje patolog indtil enighed om, blev nået.

Bakteriel DNA-ekstraktion

Nucleinsyrer blev udvundet fra hver afføringsprøver ved hjælp af en metode, modificeret fra producentens retningslinjer for QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Mængden af ​​DNA blev bestemt ved Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, US). Integritet og størrelse af DNA blev bestemt ved 1% (vægt /volumen) agarosegelelektroforese. Alle DNA-prøver blev opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Rør, der kun indeholder de QIAamp DNA Stool Mini Kit udvinding kontroller blev inkluderet hele lysis og PCR skridt til at tjene som negative kontroller

PCR og 454 Pyrosequencing

Følgende universelle 16S ribosomale RNA primere:. ( 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘, 533R: 5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) svarer til V3 positioner 16S rRNA-genet, med en prøve stregkode sekvens og de FLX Tianium adaptorer blev anvendt til at amplificere V3-regionen af ​​hver fecal prøve ved polymerasekædereaktion. PCR blev udført med 10 ng skabelon, 0,4 pi FastPfu Polymerase (transgen Biotech, Kina), 4 pi 5 × FastPfu buffer, 2 pi dNTP’er (2,5 mM hver, Takara Bio, Japan), 0,4 pi forward primere (5 uM) og 0,4 pi reverse primere (5 uM) på en ABI GeneAmp® 9700 cycler. De cykliseringsparametre var som følger: 5 min denaturering ved 95 ° C efterfulgt af 25 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C (denaturering), 30 sekunder til annealing ved 55 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C (forlængelse), med en endelig ekstension ved 72 ° C i 5 min. Triplo PCR reaktioner blev udført på hver prøve. Amplificerede produkter fra fæcesprøver blev verificeret ved gelelektroforese anvendelse af 5 pi af PCR-reaktionsblandingen i en 2,0% agarosegel. PCR-produkterne blev oprenset ved hjælp af AxyPrepDNA gelekstraktionskittet (Axygen, US) og kvantificeret på QuantiFluor ™ -ST Fluorometer (Promega, USA). Produkterne fra forskellige prøver blev blandet ved lige forhold for pyrosekventering hjælp af Roche GS FLX 454 Sequencer ifølge producentens instruktioner.

All pyrosekventering læser blev derefter fjernet af deres primere, stregkoder og adaptorsekvenser, og screenes yderligere og filtreret i henhold til standarderne for kvalitetskontrollen som følger: fjernelse af sekvenser, der ikke passer perfekt proksimale PCR-primer (over to uoverensstemmelser til primerne), dem med korte sekventering længde (mindre end 200 nt) sekvenser, der indeholdt mononukleotidbyggeblokken gentagelser af 6 nt, sekvenser med tvetydige tegn eller sekvenser med en læse kvalitet score 25. Endelig blev der i alt 197,911 høj kvalitet sekvenser fra tyve prøver produceret, som tegnede sig for 62,9% af gyldige sekvenser efter barcode- og primer-sekvens filtrering.

Bioinformatik Analyse af Sequencing data

sekvenserne blev justeret ved hjælp af database SILVA (https://www.arb-silva.de/), og afgrænsning af operationelle taksonomiske enheder (Otus) blev udført med Mothur på 97% cutoff i henhold til deres parvise afstande. Så vi foretaget en analyse af den gode dækning, mangfoldighed estimatorer (Shannon og Simpson), rigdom estimatorer (Chao1 og Ace), og fortyndingscyklussen kurve ved hjælp af Mothur softwarepakke (https://www.mothur.org/wiki/Main_Page) på konfidensniveau på 80% [21]. Den Heatmap blev bygget på slægten oplysninger med Heatmap 2 funktion i R veganer pakke. Desuden blev Bray-Curtis ligheder anvendes til at konstruere en klynge dendrogram. Vi har udført også Uvægtet Unifrac distance målinger analyse ved hjælp Otus fra hver prøve, og udførte den principal komponent analyse i form af matrix af afstanden. En metagenomisk biomarkør opdagelse fremgangsmåde blev anvendt med Lefse [lineær diskriminant analyse (LDA) kombineret med virkning størrelse måling], som udførte en ikke-parametrisk Wilcoxon sum-rank test efterfulgt af LDA analyse ved hjælp online software (https://huttenhower.sph.harvard.edu /galakse /) for at vurdere effekten størrelsen af ​​hver forskelligt rigelige taxon [22].

Statistisk analyse

t

-test og Mann-Whitney-test blev udført ved hjælp af SPSS-version 19,0 til Windows.

Etik Statement

den eksperimentelle protokol blev revideret og godkendt af Animal Care og brug Udvalg og den etiske komité i sjette Folkets Hospital Tilknyttet til Shanghai Jiao Tong University.

data Access

16S sekvens information, der genereres i denne undersøgelse er blevet forelagt NCBI Sequence Læs Arkiv under tiltrædelsen nummer SRA098098.

Resultater

Animal modeller og tumordannelse

Ifølge den eksperimentelle protokol (figur 1A), vi aflivet tre DMH-behandlede rotter hver anden uge begynder i 12. uge. Adenom blev først fundet i den 12. uge i en af ​​tre dyr aflivet. Størstedelen af ​​adenomer blev dog fundet mellem det 14. og 18. uge (7/9). Desværre, to DMH-behandlede rotter døde i det 19. uge af kolon obstruktion og kakeksi. I prøverne fra 20. uge, fandt vi, at to rotter demonstrerede adenocarcinom (2/3) med lejlighedsvis adenom i vævet. Som et resultat, besluttede vi at aflive de resterende DMH-behandlede rotter såvel som dem hører til kontrolgruppen i den 22. uge for at holde rotterne livscyklus samstemmende. Ved obduktion fandt vi patologisk bekræftet colonadenocarcinom held induceret i elleve DMH-behandlede rotter (11/13) uden tegn på orgel metastase. De resterende to rotter viste ingen tegn på tumordannelse. Men en af ​​dyrene viste sig at have en ufuldstændig kolon obstruktion, derfor kun ti DMH-behandlede rotter blev inkluderet i vores endelige undersøgelsesgruppe. I mellemtiden, alle rotter i kontrolgruppen overlevede til d.22 uge. Den gennemsnitlige kropsvægt i de ti udvalgte DMH-behandlede rotter var 343,5 ± 10,74 g og 359,3 ± 7,61 g i kontroldyr uden statistisk signifikans (

s

= 0,59). Detaljer for DMH-inducerede tumorer er opsummeret i tabel 1 og vist i figur 1B-G.

(A) Eksperimentelle fremgangsmåder. (B) Normal kolon. (C) Adenoma (hvid pil). (D) Adencarcinoma (gul pil). Den blodpletter omkring tumoren var forårsaget af tumor ulcus i stedet for vores dissektion. Repræsentative fotomikrografier viser den normale slimhinde (E), adenom (F) og adenocarcinom (G) blev forstørret i 40 × (venstre), og hver af den højre mikrografi (400x) fremhævede distriktet fra den tilsvarende grønne rektangel.

Karakteristik af 454 Pyrosequencing

i alt 314,880 gyldige sekvenser blev opnået fra alle 20 prøver, med et gennemsnit på 15,744 sekvenser pr prøve. De resulterende sekvenser blev behandlet ved hjælp Seqcln (https://sourceforge.net/projects/seqclean/) og Mothor [23]. Efter at have fjernet lav kvalitet sekvenser ( Q25) og sekvenser kortere end 200 bp, med homopolymerer længere end seks nukleotider, og som indeholder flertydige base-opkald eller forkerte primersekvenser, blev i alt 197,911 høj kvalitet sekvenser produceret med en gennemsnitlig længde på 481 bp per sekvens. Sekvenser blev justeret mod silva databasen (SSU111 udgave: https://www.arb-silva.de/) ved hjælp af k-mer søgning (https://www.mothur.org/wiki/Align.seqs). Potentielt kimære sekvenser blev påvist under anvendelse UCHIME (https://drive5.com/uchime) og fjernes. De resterende lyder blev præ-klynger (https://www.mothur.org/wiki/Pre.cluster) og derefter grupperet hjælp ukorrigeret parvis algoritme. De detaljerede karakteristika for hver prøve findes i tabel 2. Derudover blev Operationelle taxonomiske enheder defineret som deling 97% sekvens identitet ved hjælp Længst nabo metode (https://www.mothur.org/wiki/Cluster). Det samlede antal Otus på 97% lighed niveau var 41.923, med et gennemsnit på 2096 Otus per prøve.

Middelværdien for god dækning for hver gruppe var over 80%, hvilket indikerer, at 16S rRNA identificerede sekvenser i de to grupper udgør størstedelen af ​​bakterier i undersøgelsesprøverne. Hvor vi ikke har overholdt plateauet af brydning kurve (figur S1A) med den nuværende sekventering, havde Shannon diversity estimater af alle prøver allerede nået stabile værdier på dette sekventering dybde, hvilket tyder på, at selv om man kunne forvente identifikation af nye phylotypes fra yderligere sekventering, havde udvalget af mangfoldighed i prøverne blevet fanget (fig S1B, C, D). Statistisk signifikante forskelle blev set i Shannon indeks mellem tumor og kontrolgruppen (5,92 ± 0,30 vs. 6,17 ± 0,20,

s

= 0,042, figur S1E). Forskelle viser, at højere diversitet kunne findes i de noncancerous tarmlumen af ​​rotter fra kontrolgruppen, der er bekræftet af Simpson mangfoldighed indeks (0,024 ± 0,013 vs. 0,013 ± 0,007,

s

= 0,037, figur S1F). De estimatorer samfundstjeneste rigdom (Chao1 og Ace) og detaljerede karakteristika for hver prøve er vist i tabel S1.

Sammenligning af Gut mikrobiota mellem kontrolgruppe og Tumor Group

mikroflora og sammensætninger af to grupper blev analyseret og sammenlignet gennem den relative forekomst af Otus ved hjælp af uvægtede Unifrac distance matrix for hver gruppe. Efterfølgende resultater af PCA udstillet, at der var signifikant forskel i bakteriel samfund sammensætning mellem raske rotter og CRC rotter under anvendelse af de første to hovedkomponent snesevis af PC1 og PC2 (31.32% og 20,4% af forklaret varians, henholdsvis) (figur 2). Desuden blev Lefse udføres for at opnå den kladogram repræsentation og de fremherskende bakterier af mikrobiota inden for de to grupper, som er vist i figur 3A. Vi viste også de største forskelle i taxa mellem de to samfund i figur 3B.

Peptostreptococcaceae

,

Erysipelotrichales

,

Coriobacteriaceae

og

Porphyromonadaceae

blev beriget i CRC rotter, hvorimod

Roseburia

Prevotella

blev beriget med sunde rotter, som alle var vigtige phylotypes involveret i adskillelse af intestinal mikroflora i CRC og sunde rotter i overensstemmelse med lefse analysen.

Hvert symbol repræsenterer en prøve. Røde cirkler repræsenterer raske rotter; Blå cirkler repræsenterer CRC rotter.

(A) Taksonomisk repræsentation af statistisk og biologisk konsistente forskelle mellem sunde rotter og CRC rotter. Skellene består farven på den mest udbredte klasse (rød indikerer kontrolgruppe, grøn tumor gruppe og gul ikke-signifikant). Diameteren af ​​hver cirkel diameter er proportional med taxon overflod. (B) Histogram af LDA scores for differentielt rigelige slægter. Kladogram blev beregnet ved Lefse, og vises i henhold til effekt størrelse.

Sammenligninger af Gut mikrobiota på forskellige niveauer mellem Sunde Rotter og CRC Rats

Vi studerede de bakterielle samfund i afføring fra tarmlumen af ​​rotter med eller uden CRC. De forskellige phyla og slægter blev vurderet ved taksonomisk tildelingen af ​​alle sekvenser, og den samlede mikrobielle sammensætning for hver gruppe på phylum niveau er vist i figur 4A, B. Ifølge de taksonomiske resultater, vi demonstreret, at Bacteroidetes, der tegner sig for 79,26% og 63,95 % af tarmens mikrobiota hos raske og CRC-rotter henholdsvis var den mest fremherskende phylum i vores undersøgelse. Og Firmicutes var den sekundære phylum med andelen af ​​15,14% og 29,55%, henholdsvis. Endelig spirokæt og Proteobacteria udgjorde den tredje mest udbredte phyla, bidrager 3,04% og 1,06% hos raske rotter, og 2,44% og 2,95% i CRC rotter hhv. Sammensætningen af ​​dominerende phyla er vist i tabel S2. Vi finder, at den mikrobielle sammensætning viser høj inter-individuel variation (figur 4C). Firmicutes udgjorde 3,39% -48,35%, og Bacteroidetes 43,24% -95,79% blandt alle individuelle dyr (tabel 3). Bortset fra at den overflod af Bacteroidetes og cyanobakterier var højere i tarmen mikrobiota af raske rotter end i CRC-rotter, og forskellen viste statistisk signifikans (

s

= 0,044 og 0,003) (Figur S2A, B ). Betragtninger, Firmicutes og aktinobakterier var signifikant mindre rigelige mikrobiota hos raske rotter (

s

= 0,01 og 0,035 henholdsvis) (Figur S2C, D). Fra vores data blev fundet nogen Fusobacteria i nogen af ​​de sunde rotter (figur S2E) og der var ingen signifikant forskel i Proteobacteria (

s

= 0,175) (Figur S2F), når man sammenligner de bakterielle samfund i de to grupper, selv om dens overflod var højere i CRC rotter. Statistisk signifikante forskelle mellem tumoren og kontrolgruppen i familien blev også udført i vores undersøgelse. Forskel i den relative forekomst af Bacteroidetes (11,6% vs. 4,6%,

s

= 0,0029), Rikenellaceae (3,71% vs. 1,47%,

s

= 0,0008), og Peptostreptococcaceae (9,18 % vs. 1,61%,

s

= 0,046) var signifikant mellem CRC rotter og raske rotter, mens der var en yderst lavere Prevotellaceae (31,91% mod 62,88%,

s

= 0,0027) og Cyanobakterieceller (0,3% vs. 0,82%,

s

= 0,003) i CRC-rotter sammenlignet med raske rotter.

(A) raske rotter, (B) CRC rotter. Histogrammet repræsenterer den relative forekomst af bakteriel phyla i mikrobiota af hver prøve (C). “Andet” repræsenterer de uklassificerede bakterier, aktinobakterier, cyanobakterier Deferribacteres, Elusimicrobia, Fusobacteria og Tenericutes.

På slægten niveau, vi studerede den mikrobielle sammensætning af hver prøve (figur S3) og fandt dem at være signifikant forskellig mellem de to grupper. De ti mest udbredte slægter i kontrolgruppen var

Prevotella

,

Bacteroides

,

Lactobacillus

,

Treponema

,

Parabacteroides

,

Anaerovibrio

,

Ruminococcus

,

Roseburia

,

Oscillospira

og

Sutterella

. Men

Prevotella

,

Bacteroides

,

Allobaculum

,

Treponema

,

Lactobacillus

,

Blautia

,

Parabacteroides

,

Paenibacillus

,

Anaerovibrio

og

Paraprevotella

var de ti mest udbredte slægter i tumor gruppe, tilsvarende (figur S4). Interessant, selvom

Prevotella

var den mest forekommende slægt i begge grupper, den overflod af det var meget højere hos raske rotter. Statistisk set

Bacteroides

, med over 1% af det samlede antal bakterier i afføringen, var relativt rigelige i CRC rotter. Af særlig note, slægter

Bacteroides. fragilis

blev hovedsageligt fundet i CRC rotter. I mellemtiden,

Prevotella

,

Lactobacillus

Treponema

viste sig at være væsentligt højere hos raske rotter end CRC rotter (figur 5). Genera

Desulfovibrio

,

Clostridium

,

Actinobacillus

,

Succinatimonas

,

DOREA

,

Phascolarctobacterium

,

Parabacteroides

,

Bilophila

,

Paraprevotella

,

Helicobacter

Paenibacillus

udstillet lav tæthed; imidlertid blev de alle statistisk beriget i fæces fra CRC-rotter sammenlignet med raske rotter. Desuden slægter

Roseburia, Eubacterium

Ruminococcus

blev beriget i kontrolgruppen, og

Fusobacterium

var fraværende fra sunde rotter. Den Heatmap af den bakterielle slægt niveau viste også det samme fænomen (figur S5). Yderligere forskelle mellem de to grupper kan findes i tabel S3.

Mann-Whitney-test blev anvendt til at evaluere betydningen af ​​sammenligninger mellem angivne grupper.

Diskussion

mikrobielle population i tarmen er heterogene og komplekse. Laboratorie gnavere har været medvirkende til at hjælpe forskere til at optrævle de komplekse vekselvirkninger, pattedyr, herunder mennesker, har med deres mikrobielle kommensale [24]. Vi har anvendt en fælles dyremodel for CRC i denne undersøgelse for at undersøge karakteren af ​​mikrobielle samfund struktur i CRC sammenlignet med raske dyr. De undersøgelser i dyremodeller kunne muligvis have vigtige implikationer er relevante for human sygdom [25].

I denne undersøgelse har vi sammenlignet den bakterielle sammensætning tarmlumen af ​​rotter raske gruppe og CRC gruppe ved hjælp af platform Roche 454 sequencer. Vi observerede en betydelig differentiering af tarmen mikrobiota mellem raske rotter og kræftfremkaldende rotter, der udviklede colon karcinomer. Vi viste en relativ højere overflod af Firmicutes, Proteobacteria og aktinobakterier i tarmlumen af ​​CRC rotter og yderligere viste, at Bacteroidetes var mindre rigelige i denne gruppe. Dette resultat er i overensstemmelse med lignende fund af Zhao

et al.

[26] fra humane undersøgelser. Det er blevet rapporteret, at de inflammatoriske tarmsygdomme, såsom Crohns sygdom og ulcerativ colitis er kendte risikofaktorer for colorektal cancer, og en signifikant reduktion af phylum Bacteroidetes blev påvist i disse to sygdomme ved forskere [27] – [28]. I yderligere undersøgelse blev ændringer blandt slægter af denne phylum også påvist i vores undersøgelse. Især konstateringen af, at

B. fragilis

blev øget i tarmlumen af ​​CRC rotter.

Tidligere undersøgelser har antydet, at forskellige

Bacteroides

stammer kan påvirke sundheden for værten gennem deres colitogenic eller probiotiske potentiale. Waidmann og hans kolleger havde beskrevet den isolerede B. vulgates stamme med mulige probiotiske propertites, der var i stand til at lindre E. coli induceret colitis udvikling ved en endnu ukendt mekanisme i interleukin-2-mangel mus [29]. Men et menneske colon kommensal, enterotoxigen

B. fragilis

er blevet påvist, at koloniseringen af ​​det i flere tarm neoplasi (min) mus kunne resultere i en markant stigning i colon tykkelse, inflammation og synlige colon tumorer, som er ledsaget af aktivering af STAT3 og infiltration af T

H17 inflammatoriske celler [30]. Disse forskningsresultater er i overensstemmelse med vores fund, at

B. fragilis

var aplenty i CRC rotter. Desuden har Proteobacteria også blevet rapporteret at blive forøget i mikrobiota af dyr med eksperimentelt induceret colitis og patienter, der lider af IBD [31]. Det kan være relevant med det direkte samspil mellem Proteobacteria og tarmceller gennem bakterielle sekretion systemer såsom type III sekretion systemet (T3SS) [32]. Desuden er det blevet rapporteret, at Firmicutes holdt evnen til at øge energi høst fra kosten [33]. Den Firmicutes phylum indeholder relevant slægter, herunder

Ruminococcus

,

Clostridium

og producenterne butyrat

Eubacterium

,

Faecalibacterium

Roseburia

[34]. Butyrat er en vigtig energikilde for colon epitelceller, ofte foretrukket frem kredsløbssygdomme glucose eller glutamin. Op til 90% af butyrat metaboliseres af colonocyter [35]. Her viser vi reduceret overflod af

Roseburia

Eubacterium

i tarmen mikrobiota af CRC rotter. I to kosten interventionsstudier, befolkningstæthed af

Roseburia

og

Eubacterium

blev vist sig at have en stærk korrelation med fecal butyrat koncentrationer som reaktion på ændrede kulhydrat forsyning [36], hvilket tyder på betydningen af ​​

Roseburia

Eubacterium

i produktionen af ​​butyrat in vivo. Sengupta

et al.

[37] viste, at der kan være tegn på, at levering af en passende mængde butyrat til tarmslimhinden kan beskytte mod tidlige tumorigene begivenheder. Derfor strukturen ubalance i dette papir spiller en vigtig rolle i begrænsningen af ​​butyrat-producerende bakterier i tarmen af ​​CRC rotter.

Desuden strukturen ubalance i tarmen mikrobiota af CRC rotter signifikant relateret med stigningen i flere potentielle patogener og faldet i probiotiske arter. Det er blevet påvist, at

Bacteroides

befolkninger og mere specifikt de

B. fragilis

producere en metalloprotease kaldet fragilysin hos patienter med tyktarmskræft, men ikke i kontrol. Rapporten foreslår, at dette delpopulation kan begunstige carcinogenese [38]. Hertil kommer, at fast sluttede

Desulfovibrio

reducerer sulfat til at producere hydrogensulfid (H

2S), hvilket har vist sig at være i stand til at generere DNA skader, der kan være delvist ansvarlig for generering af genomisk ustabilitet og de kumulative mutationer observeret i kolorektal cancer [39] – [40].