PLoS ONE: Centrosomal Lokalisering af kræft /Testikel (CT) Antigener NY-ESO-1 og MAGE-C1 reguleres af Proteasome aktivitet i tumor Cells

Abstrakt

Cancer /Testikel (CT) antigen familie af gener er transkriptionelt undertrykkes i de fleste humane væv, men er atypisk igen udtrykt i mange maligne tumortyper. Deres begrænsede udtryk profil gør CT antigener ideelle mål for kræft immunterapi. Så lidt er kendt om hvorvidt CT-antigener kan reguleres af posttranslationel processering, undersøgte vi de mekanismer, der styrer nedbrydningen af ​​NY-ESO-1 og MAGE-C1 i udvalgte cancercellelinier. Hæmmere af proteasom-medieret nedbrydning inducerede opdelingen af ​​NY-ESO-1 og MAGE-C1 til et rengøringsmiddel uopløselig fraktion. Desuden denne behandling resulterede også i øget lokalisering af NY-ESO-1 og MAGE-C1 på centrosom. Trods deres interaktion, kan flytning af enten NY-ESO-1 eller MAGE-C1 til centrosom forekomme uafhængigt af hinanden. Ved hjælp af en række afkortede fragmenter, regionerne svarende til NY-ESO-1

91-150 og MAGE-C1

900-1116 blev etableret som vigtig for styring af både stabilitet og lokalisering af disse CT-antigener. Vores resultater viser, at steady state niveauer af NY-ESO-1 og MAGE-C1 er reguleret af proteasomalaktivitet nedbrydning og at både opføre sig som sammenlægning-tilbøjelige proteiner upon akkumulation. Med Proteasominhibitorerne i stigende grad brugt som front-line behandling af kræft, disse oplysninger rejser spørgsmål om CT-antigen behandling for antigen præsentation og derfor immunogenicitet hos kræftpatienter

Henvisning:. Pagotto A, Caballero OL, Volkmar N, Devalle S, Simpson AJG, Lu X, et al. (2013) Centrosomal Lokalisering af kræft /Testikel (CT) Antigener NY-ESO-1 og MAGE-C1 reguleres af Proteasome aktivitet i Tumorceller. PLoS ONE 8 (12): e83212. doi: 10,1371 /journal.pone.0083212

Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japan

Modtaget: August 8, 2013; Accepteret 31. oktober, 2013; Udgivet: December 10, 2013 |

Copyright: © 2013 Pagotto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Ludwig Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Engagere immunforsvaret til at genkende og fjerne tumorer /kræftceller fortsat en lovende terapeutisk strategi til behandling af cancer. Tilgangen i sagens natur beror på identifikation af molekylære signaturer i stand til effektivt og konsekvent differentiere maligne befolkning. Den kræft /Testikel (CT) antigener er en samling af mere end 100 gen familier med flere medlemmer og splejsning varianter [1-3], som er blevet identificeret gennem en bred vifte af teknikker, herunder: T-celle epitop kloning [4-7] ; serologisk analyse af cDNA-ekspressionsbiblioteker (SEREX) [1], differentiel genekspression analyse [8,9]; og bioinformatiske metoder [10,11]. Deres udtryk er normalt begrænset til kimceller testis [12-15] og lejlighedsvis æggestok [16] og trofoblaster [17]. Men i en række forskellige tumortyper (fx melanom, småcellet lungecancer, sarkom, etc …) atypisk ekspression af et eller flere CT-antigener kan observeres [3,18,19]. De fysiologiske konsekvenser af CT antigenekspression for kræft progression er ikke fuldt forstået, men flere CT-antigener har vist sig at være modulatorer af ubiquitinering gennem komplekser dannet med RING-type ubiquitin ligaser [20].

CT-antigenet NY-ESO-1 /CTAG1 /CT6 blev først identificeret af SEREX i spiserøret planocellulært karcinom [1,21]. NY-ESO-1 udviser en forholdsvis unik arkitektur, med en PCC-1 domæne i C-terminalen (aa 89-164) homolog med en gærtransskriptionsfaktor involveret i cellecyklusprogression og polariseret vækst [22], idet dens eneste konserverede funktion. En endelig biologiske rolle for NY-ESO-1 forbliver ubestemt, men det har vist sig at interagere specifikt med en anden CT-antigen, MAGE-C1 [23]. MAGE-C1 er en del af den større

MAGE

(melanom Antigen Genes) familie, som består af mere end 50 gener i flere underfamilier (

MAGE-A til -L

). Det fremherskende træk ved disse familier er det passende navn MAGE homologi domæne (MHD), en stor central region bevaret tværs sine medlemmer [24-26]. Den MHD er til stede i de fleste metazoan MAGE proteiner, men især fraværende i

C. elegans

samt encellede eukaryoter. Identificeret ved SEREX og repræsentative forskel analyse (ADT) [8], MAGE-C1 /CT7 er næsten tre gange større end noget andet MAGE familiemedlem (1142 aa). Dens udvidet N-terminalen har lidt at ingen mærkbar forudsagt domæne arkitektur, bortset fra flere gentagne sekvenser af 14, 16 og 21 aa [8]. MAGE-C1 udtrykkes normalt i myelomatose (MM) [27], samt sarkom, melanom og blærecancer [3,18]. En funktion til MAGE-C1 har endnu ikke fastlagt, men flere undersøgelser har knyttet det med apoptose i MM [28,29].

Blandt CT antigen genfamilier, har mindst 19 medlemmer vist sig at fremkalde humorale og /eller cellulære immunreaktioner hos cancerpatienter [19,30]. CT antigen proteiner forarbejdet til peptider ved proteasomet og præsenteret på celleoverfladen af ​​MHC molekyler, er anerkendt af autologe cytotoksiske T-lymfocytter. Tumor-begrænsede ekspression og høj immunogenicitet har gjort CT-antigener attraktive mål for immunterapeutiske strategier til behandling af udvalgte cancere [19,31-36]. NY-ESO-1 anses for at være en af ​​de mest immunogene CT-antigener og har været fokus på undersøgelse for formuleringen af ​​terapeutiske vacciner [37]. I modsætning til andre antigener, er det almindeligt at observere samtidige antistof og T-celle respons til NY-ESO-1, som er i stand til at fremkalde stærk integreret CD4

+ og CD8

+ T-celle-immunrespons [38-40] . Systematisk analyse har identificeret en epitop “hot spot” for T-celle-respons i den centrale del af NY-ESO-1 protein mellem aminosyrerne 80-110 [41-44].

Mens transkriptionel regulering af CT-antigen udtryk har høstet meget af den opmærksomhed, forstå deres post-translationel regulering og biologiske funktion skal også anses for at afgrænse deres roller i kræft. Som mål attraktive vaccine, bestemmer cellulære mekanismer, der styrer NY-ESO-1 og MAGE-C1 steady-state proteinniveauer er vigtig, da det kan give indsigt i midler, der kunne modulere deres ekspression eller forarbejdning til antigenpræsentation og følgelig immunresponset mod de tumorceller, der udtrykker disse CT-antigener. Her giver vi dokumentation for, at steady state-niveauerne, opløselighed og lokalisering af CT antigener NY-ESO-1 og MAGE-C1 er reguleret af nedbrydning gennem proteasomet. De specifikke domæner i hver enkelt stilling i reguleringen af ​​disse facetter protein er også identificeret og diskuteret.

Resultater

proteasomhæmning inducerer uopløselighed og centrosomal berigelse af NY-ESO-1

For at afgøre, om nedbrydning via ubiquitin-proteasom systemet (UPS) kan være involveret i post -translational CT-antigen regulering, ekspressionsniveauerne af NY-ESO-1 og MAGE-C1 blev først fastlagt i et panel af kræft cellelinjer. Vi observerede, SK-MEL-37 melanom og H146 småcellet carcinom (SCLC) cellelinier udtrykker høje niveauer af NY-ESO-1 (figur 1A og S1A henholdsvis). Begge cellelinier blev efterfølgende behandlet med proteasominhibitor MG132. Cellelysater blev adskilt i opløselige (SOL) og uopløselige (INSOL) fraktioner i RIPA-lysepuffer, opsamlet og separeret ved SDS-PAGE. Selvom det ikke er kvantitative, western blots probet for NY-ESO-1 påvist forhøjede niveauer i RIPA-uopløselige fraktioner af begge cellelinier efter MG132 behandling sammenlignet med ubehandlede (figur 1B, S1B), hvilket afspejler en nedsat opløselighed med tab af proteasomaktivitet . Med denne ændring i opløselighed blev det formodet, at NY-ESO-1 lokalisering muligvis også blevet ændret. I begge SK-MEL-37 og H146 celler, blev NY-ESO-1 observeret ved immunofluorescens at akkumulere på enkelt puncta efter MG132 behandling, ud over den overvejende cytoplasmatisk lokalisering ses i ubehandlede celler. Minder om den centrosom blev NY-ESO-1 tilstedeværelse på dette organ bekræftet ved colocalisation af NY-ESO-1 med pericentrin, en velkarakteriseret protein, der markerer denne struktur (figur 1C, S1c). Desuden ubiquitin puncta, et kendetegn for aggresome dannelse, blev også observeret at colocalise med NY-ESO-1 ved denne struktur (figur 1D). Med en vis hyppighed, kan centrosom-lokaliserede NY-ESO-1 selv detekteres i ubehandlede H146 celler (figur S1c, top, 2D), hvilket øger muligheden for en bona fide fysiologisk funktion på dette organ under normale forhold. Disse data indikerer NY-ESO-1 kan lokalisere til centrosom og at det kræver UPS’en til effektiv nedbrydning.

A) Detektion af endogen MAGE-C1 og NY-ESO-1 ved Western blot (CT7.33 og NY-41-antistoffer, henholdsvis). Cellelysater blev fremstillet ud fra SK-MEL-37, U2OS og H1299-celler og separeret ved SDS-PAGE. β-tubulin tjente som en loading kontrol. B) Påvisning af NY-ESO-1 fra SK-MEL-37 celler behandlet med DMSO (negativ kontrol) og MG132 (40 uM, 4hrs). Lige store mængder af RIPA-opløselige (SOL) og -insoluble (INSOL) materiale (20 ug) blev opdaget. C) Immunofluorescens mikrografier af endogen NY-ESO-1 (grøn) og pericentrin (rød) i SK-MEL-37 celler er vist, sammen med deres flettede billeder. D) Immunofluorescens mikrografier af endogen NY-ESO-1 (grøn) og ubiquitin (rød) i SK-MEL-37 celler er vist, sammen med deres flettede billeder. Hvide pile angiver centrosomer og skala barer = 20 pm.

NY-ESO-1 og MAGE-C1 colocalise på centrosom på proteasomhæmning

NY-ESO-1 er ofte co-udtrykkes med MAGE-C1 i cancerceller, hvor de er i stand til at interagere. For at bestemme, om ændringer af NY-ESO-1 opløselighed og subcellulære lokalisering induceret af MG132 behandling også påvirket MAGE-C1, SK-MEL-37 celler, som endogent udtrykker både MAGE-C1 og NY-ESO-1 (figur 1A) blev behandlet med MG132. Ligesom NY-ESO-1, inhibering proteasomaktivitet markant forhøjet MAGE-C1-proteinniveauer i RIPA-uopløselige fraktion, med meget lille ændring observeret i RIPA-opløselige fraktion (figur 2A). Colocalisation med pericentrin viste, at, ligesom NY-ESO-1, MAGE-C1 akkumuleres på centrosomer når proteasomaktivitet er kompromitteret (figur 2B) og colocalisation af MAGE-C1 og NY-ESO-1 i lignende puncta understøtter deres samtidige tilstedeværelse (Fig 2C). Colocalisation med pericentrin steget betydeligt i SK-MEL-37 celler behandlet med MG132 og nåede op på 75% for både MAGE-C1 (p = 0,00222, 2-halet t-test) og NY-ESO-1 (p = 0,00013) ( Figur 2D) og indikerer en robust respons på proteasomhæmning. NY-ESO-1 colocalisation med ubiquitin puncta viste en markant forskel i SK-MEL-37-celler (p = 0,01139), men ikke H146s, som udviste mindre konsekvent dannelse (Figur 2E). SK-MEL-37-celler behandlet med enten epoxomicin, en mere selektiv proteasominhibitor (fig S2A), eller reducerede MG132 koncentrationer (figur S2B) gav sammenlignelige resultater. Ophobning af enten MAGE-C1 eller NY-ESO-1 ved puncta og i RIPA-uopløselige fraktioner var reversibel, afspejles af en tilbagevenden til spredt lokalisering og rengøringsmiddel opløselighed efter MG132 udvaskning (figur S2C, S2D). Tilsammen indikerer disse data, at både NY-ESO-1 og MAGE-C1 transient akkumuleres ved centrosomer som reaktion på en forringet nedbrydningsvej.

A) Western blot af MAGE-C1 fra lysater af SK-MEL-37 celler behandlet med DMSO (negativ kontrol) og MG132 (40 uM, 4hrs). RIPA-opløselige (SOL) og -insoluble (INSOL) fraktioner vist. B) Immunofluorescens mikrografier af endogen MAGE-C1 (grøn) og pericentrin (rød) i SK-MEL-37-celler. Flettede billeder er også vist. Scale barer = 20 um C) Immunofluorescens mikrografier af endogen MAGE-C1 (grøn) og NY-ESO-1 (rød) i SK-MEL-37-celler. Scale barer = 10 um. I alle billeder, hvide pile angiver centrosomer. D) Bar grafer præsenterer procentdelen af ​​NY-ESO-1 og MAGE-C1 puncta colocalised med pericentrin for SK-MEL-37 (MAGE-C1 /pericentrin – DMSO: 0,42 ± 0,72 og MG132: 76,94 ± 6,61, p = 0,00222; NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 5,77 ± 3,74 og MG132: 75,77 ± 1,73, p = 0,00013), U2OS (MAGE-C1 /pericentrin – DMSO: 2.75 ± 1.74 og MG132: 69,28 ± 6,79, p = 0,00212), HC33 (NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 21,32 ± 2,39 og MG132: 70,23 ± 6,86, p = 0,00312) og H146 (NY-ESO-1 /pericentrin – DMSO: 57,86 ± 18,53 og MG132: 80,95 ± 1,80, p = 0.16289) -celler. Selvom H146 celler udtrykker MAGE-C1, blev det ikke medtaget i denne analyse. E) Bar grafer præsenterer procentdelen af ​​colocalised NY-ESO-1 og ubiquitin puncta for SK-MEL-37 (DMSO: 0,65 ± 1,12 og MG132: 30,81 ± 6,09, p = 0,01139), HC33 (DMSO: 4,09 ± 2,52 og MG132 : 23,06 ± 6,70, p = 0,02739), og H146 (DMSO: 2,14 ± 1,43 og MG132: 20.00 ± 18.03, p = 0,22733) celler. Middelværdi, standardafvigelse og betydning vises.

Uafhængig lokalisering af CT-antigener på centrosom

Siden NY-ESO-1 og MAGE-C1 kan danne komplekser, vi næste testede, om interaktionen var forpligtet til at give partitionering til en RIPA-uopløselig fraktion eller lokalisering på centrosom på proteasomhæmning. U2OS osteosarkomceller udtrykker MAGE-C1, men ikke NY-ESO-1, mens HC33 SCLC celler udtrykker NY-ESO-1, men ikke MAGE-C1 (figur 1A, S1A). Ved behandling med MG132 blev hver CT antigen observeret til selvstændigt ophobes i RIPA-uopløselige fraktioner (figur 3A, 3C) og lokalisere til centrosomer (figur 3B, 3D). Disse data blev støttet af siRNA-medieret gen-nedregulering af enten antigen i SK-MEL-37-celler, hvilket viste, at udtømning af NY-ESO-1 påvirkede ikke centrosomal lokalisering af MAGE-C1 (figur S3, venstre) og omvendt ( Figur S3, højre). Både MAGE-C1 og NY-ESO-1 dannet puncta der colocalised med pericentrin i U2OS (p = 0,00212) og HC33 (p = 0,00312) celler, henholdsvis med niveauer nær 70% og signifikant større end DMSO-behandlede celler (figur 2D ). Ligesom H146s, var højere basale niveauer af NY-ESO-1 puncta også observeret i HC33 cellelinie. Tilsammen indikerer disse data, at NY-ESO-1 og MAGE-C1 kan akkumulere og lokalisere til centrosom uafhængigt af hinanden i perioder med nedsat proteasomaktivitet.

A) Påvisning af endogen NY-ESO-1 ved western blot fra HC33 SCLC celler behandlet med DMSO og MG132 (40 uM, 4hrs). RIPA-opløselige (SOL) og -insoluble (INSOL) fraktioner vist. B) Immunofluorescens mikrografier af endogen NY-ESO-1 (grøn) og pericentrin (rød) i HC33-celler behandlet med DMSO og MG132, som i fig 1C C) Påvisning af endogen MAGE-C1 fra U2OS osteosarkomceller under de samme betingelser som i Figur 2A. D) Immunofluorescens mikrografier af endogen MAGE-C1 (grøn) og pericentrin (rød) i U2OS celler behandlet med DMSO og MG132, som i figur 2B. Hvide pile angiver centrosomer. Scale barer = 20 pm.

NY-ESO-1

91-150 bidrager til den samlede stabilitet

Vi har vist, at NY-ESO-1 er et substrat af proteasomet men som regioner påvirke dens nedbrydning er ikke kendt. For at identificere de områder, der er ansvarlige for partitionering i RIPA-uopløselige fraktioner og centrosom lokalisering, vi konstrueret fragmenter af NY-ESO-1 (NY-ESO-1

1-90, NY-ESO-1

91-180 og NY-ESO-1

50-150, figur 4A) og udtrykt dem individuelt sammen med den fulde længde formen (NY-ESO-1

FL) i mus afledt NIH3T3-celler, som udtrykker hverken MAGE-C1 eller NY-ESO-1. Efter MG132 behandling og solubilisering regimen ovenfor beskrevne, blev relative ekspression og subcellulære lokalisering analyseret ved western blot og immunfluorescens hhv. Både RIPA-opløselige og -insoluble fraktioner af NY-ESO-1

FL, NY-ESO-1

91-180 og NY-ESO-1

50-150 blev stabiliseret af MG132, mens NY- ESO-1

1-90 kun ophobet i RIPA-opløselige fraktion (figur 4B). Markant ophobning af NY-ESO-1

91-180 fragmentet med MG132 implicerer UPS i fragmentet hurtige omsætning og foreslår NY-ESO-1 stabilitet er afledt fra et område uden for Pcc1 domæne. Den NY-ESO-1

1-90 fragment dukkede koncentreret i kernen, mens NY-ESO-1

91-180 og NY-ESO-1

50-150 lokaliseret til både nukleare og cytoplasmatiske regioner uanset om endogen NY-ESO-1 og MAGE-C1 stede (SK-MEL-37, figur 4C) eller ej (NIH3T3, fig S4). Subcellulære lokalisering af enten NY-ESO-1 trunkeringer udtrykt i NIH3T3s (fig S4) eller NY-ESO-1 blev ikke markant ændret af MG132

1-90 i SK-MEL-37s (figur 4C). Men ligesom endogent NY-ESO-1, både NY-ESO-1

91-180 og NY-ESO-1

50-150 akkumuleret på centrosomer i SK-MEL-37-celler (Figur 4C). Sammen fremhæve disse data området mellem aa 91-150 så indflydelsesrig i NY-ESO-1 stabilitet og i lokalisering på centrosom.

A) Skematisk fremstilling af V5 /His6 epitopmærket fuld længde og trunkerede konstruktioner af NY-ESO-1. NY-ESO-1

1-90, NY-ESO-1

91-180 og NY-ESO-1 er vist

50-150, sammen med det konserverede Pcc1 domæne. B) Påvisning af NY-ESO-1-konstruktioner transient udtrykt i NIH3T3-celler ved Western blot med anti-V5 og anti-β-tubulin (loading control). Cellerne blev behandlet med MG132 og fraktioner opsamlet som i figur 1B. C) Immunofluorescens mikrografier af SK-MEL-37-celler (± MG132) vedvarende udtrykker NY-ESO-1-fragmenter (anti-V5, grøn) og pericentrin (rød), med kerner identificeret af DAPI farvning (blå). Hvide pile angiver centrosomer. Scale barer = 20 pm.

Den MHD bidrager til MAGE-C1 stabilitet

Ligesom NY-ESO-1, de aspekter, der påvirker MAGE-C1 steady state niveauer ikke godt karakteriseret. For at bestemme region /s af MAGE-C1 påvirker dets stabilitet, genereret vi en række fragmenter herunder: MAGE-C1

1-138, MAGE-C1

600-901, MAGE-C1

902- 1029 og MAGE-C1

1030-1142 (figur 5A). Vi var ikke i stand til at konstruere fragmenter spænder over hele længden af ​​MAGE-C1, som det store antal GC-rige gentagelser mellem aminosyrerne 139 og 600 hindres amplifikation af denne region. Når forbigående transficeret ind i både NIH3T3 (figur 5B) og H1299 celler (figur S5), MAGE-C1

1-138 og MAGE-C1

600-901 vises højere steady state niveauer af overvejende enkelte bands, i forhold til andre trunkeringer. Desuden er den enkelte syntes at migrere ved en molekylvægt, der var højere end forventet. Dette kunne repræsentere dannelsen af ​​MAGE-C1-oligomerer eller kan afspejle retarderede migration grund polypeptid sammensætning. I modsætning hertil udviste både C-terminale fragmenter (MAGE-C1

902-1029 og MAGE-C1

1030-1142) reducerede RIPA-opløselige steady state-niveauerne, hvor blev opdaget to forskellige bands. De højere end forventet bands kan afspejle en post-translationel modifikation (fx ubiquitinering) eller potentielt en oligomere arter. Fragmenter indeholdende dele af MHD (MAGE-C1

902-1029, MAGE-C1

1030-1142) akkumuleret i både RIPA-opløselige og -insoluble fraktioner med tilsætning af MG132. Omvendt MAGE-C1

600-901 blev kun beskedent stabiliseret med MG132 mens det N-terminale fragment (MAGE-C1

1-138) viste sig at være stort set upåvirket (figur 5B). I NIH3T3 celler, MAGE-C1

1-138 og MAGE-C1

600-901 dukkede op i både kernen og cytoplasmaet, mens MHD-holdige fragmenter (MAGE-C1

902-1029 og MAGE- C1

1030-1142) blev helt udelukket fra kernen (figur 5C). Lokalisering af MAGE-C1-fragmenter i NIH3T3-celler blev ikke markant ændret efter MG132 behandling. For at bestemme hvorvidt MHD alene var tilstrækkeligt for MAGE-C1 separation og lokalisering, det isolerede domæne (MAGE-C1

900-1116) blev udtrykt i H1299-celler, en human lungecarcinom-cellelinje, der udtrykker NY-ESO-1, men ikke MAGE-C1. Ligesom de fragmenter, der indeholdt dele af MHD, MAGE-C1

900-1116 akkumuleret i både RIPA-opløselige og uopløselige fraktioner med MG132 som to immunreaktive bånd detekteret ved western blot (figur 5D). I overensstemmelse med de relaterede fragmenter, MAGE-C1

900-1116 var overvejende cytoplasmatisk i H1299 celler og MG132 ikke især ændre denne lokalisering (figur 5E). Disse data implicerer stærkt konserverede MAGE homologi domæne i proteasomet-afhængige forarbejdning og cytoplasmatisk lokalisering af MAGE-C1.

A) Skematisk repræsentationer af V5 /His6 epitopmærket fuld længde og trunkering konstruktioner af MAGE-C1. MAGE-C1

1-138, MAGE-C1

600-901, MAGE-C1

902-1029, MAGE-C1

1030-1142 og MAGE-C1

900-1116 er vist og MAGE homologi domæne (MHD) er indiceret. B) Forbigående ekspression af MAGE-C1-fragmenter i NIH3T3 musefibroblaster detekteret ved Western blot med anti-V5 og anti-β-tubulin (loading control). Celler blev behandlet og lyseret som i figur 1B. Stjerner angiver mulige oligomere former. C) Immunofluorescens mikrografier af NIH3T3 musefibroblaster, der udtrykker MAGE-C1-fragmenter (anti-V5, grøn) hvor TOPRO blev inkluderet til at farve kerner (rød). Cellerne blev behandlet med MG132 (40 uM, 4 hr) eller DMSO (negativ kontrol). D) Forbigående ekspression af MAGE-C1

900-1116 i H1299 NSCLC-celler og detekteret under de anvendte betingelser i figur 5B. Asterisk angiver mulig oligomer form. E) Immunofluorescens mikrografier af H1299-celler udtrykker MAGE-C1

900-1116 som i figur 5C. For alle billeder, skala barer = 20 pm.

Diskussion

immunterapeutiske strategier for kræftbehandlingen stole på effektivt at skelne mellem normale og maligne celler baseret på differentierede ekspressionsmønstre af celleoverfladeproteiner eller præsenteres antigener. Cancer /Testis (CT) antigen familie af gener har over 100 forskellige medlemmer, hvis normalt begrænset ekspression i kønsceller i testikler bliver dysreguleret i mange cancere, effektivt differentiere dem fra det normale, omgivende væv. CT antigen gener normalt bragt til tavshed af methylering på deres CpG rige initiativtagere og så demethylering af disse regioner, samt histonacetylering, er delvist ansvarlig for deres afvigende re-udtryk i kræft (revideret i 19). Men disse mekanismer er ikke i stand til helt at forklare den manglende ekspression af CT-antigener i visse tumortyper karakteriseret ved global hypometylering (fx tyktarmskræft) [45,46] eller heterogenitet ofte observeret i tumorprøver [47]. Sådanne komplekse udtryk mønstre kræver flere niveauer af regulering, som næppe vil være udelukkende kan tilskrives transkriptionelle mekanismer. Derfor undersøgte vi dublerede posttranslationel regulering af CT-antigener. Her præsenterer vi data implicerer nedbrydning, via 26S proteasomet, som en vigtig regulator af CT antigen steady state niveauer og viser, at når det er kompromitteret, er opløselighed og subcellulær lokalisering af både NY-ESO-1 og MAGE-C1 dramatisk ændret.

ubiquitin-proteasom systemet (UPS) er en vigtigste mekanisme for reguleret protein nedbrydning i eukaryoter (revideret i 48). For at undersøge, hvordan nedbrydning via UPS påvirket steady-state niveauer af NY-ESO-1 og MAGE-C1 i cancer cellelinjer, vi behandlede celler med proteasominhibitorer under overvågning ændringer opløselighed og lokalisering af hvert protein. Proteasominhibitorer forårsaget endogent udtrykte NY-ESO-1 og MAGE-C1 at akkumulere, enten alene (HC33, U2OS), når både CT-antigener var til stede (SK-MEL-37), eller når hver blev forbigående udtrykt i cellelinier mangler enten ( NIH3T3). Af note, blev ophobning overvejende detekteret som en stigning i vaskemidlet-uopløselige fraktion af cellelysatet. Mens hverken NY-ESO-1 eller MAGE-C1 er blevet rapporteret tidligere at være sammenlægning-tilbøjelige, tilbøjeligheden til CT-antigener til at blive uopløselig tyder på, at kapaciteten i chaperone (og nedbrydning) netværk /s er blevet overskredet. Både MAGE-C1 og NY-ESO-1 blev observeret at akkumulere på centrosom under de samme betingelser. Dette mønster minder om andre sammenlægning tilbøjelige proteiner såsom CFTRΔF508 [49] og huntingtin [50], hvis ophobning på centrosomer forværres med proteasomhæmning (revideret i 51,52). Centrosomer tjene som den primære mikrotubuli organisering center (MTOC) og spiller en vigtig rolle som regulator af celle-cyklus progression [53]. Den MTOC også bliver et knudepunkt for komponenter af både cytosoliske chaperoner (f.eks Hsp40, Hsp70) og UPS (f.eks ubiquitin, 19S og 20S underenheder) [49,54,55], der akkumulerer som reaktion på fejlfoldede proteiner leveres der ved direkte transport på mikrotubuli at danne benævnt aggresome [49,56,57] intracellulært krop. I denne rolle, centrosomer fungerer som triage platforme for kontrol beslutninger protein kvalitet. Der er beviser for, at de centrosom-lokaliserede UPS komponenter er i stand til at engagere sig i aktiv nedbrydning [54,58,59]. Den uopløselige partitionering og akkumulering på centrosomer både NY-ESO-1 og MAGE-C1 foreslå en tilbøjelighed disse CT-antigener til at samle, en funktion forværres når proteasom aktivitet er kompromitteret.

Ophobning af både NY-ESO-1 og MAGE-C1 på centrosomer i fravær af proteasom aktivitet sandsynligvis afspejler adskillelse af fejlfoldede proteiner (muligvis som uopløselige aggregater) til en central placering, hvor de venter på oprydning. Påvisningen af ​​koncentrerede ubiquitin klynger på centrosomer (figur 1D) og opbygningen af ​​polyubiquitinated materialer i INSOL fraktion (figur S2D) understøtter denne model. Højere niveauer af NY-ESO-1 puncta på centrosomer i ubehandlede H146 celler (og i mindre grad HC33s) versus SK-MEL-37s kan også afspejle forskelle mellem deres chaperone og nedbrydningsprodukter netværk, hvilket gør sammenlægning mere udbredt i celler med reduceret kapacitet. En alternativ forklaring på dette kan være, at enten NY-ESO-1 eller MAGE-C1 (eller begge) har en bona fide funktionel rolle ved centrosom (dvs. NY-ESO-1 i H146 celler, fig S1c, 2D). For eksempel Proteasominhibitorerne forringe omsætning centrosomal proteiner, der påvirker både mikrotubulus nukleering og organisation [60,61]. Tilstedeværelsen af ​​enten MAGE-C1 eller NY-ESO-1 (eller begge) ved centrosomer kunne modulere nedbrydningshastigheden og /eller stabilitet af væsentlige faktorer der. De MHDS af flere MAGE familiemedlemmer interagerer med RING-type E3 ubiquitin ligaser (fx TRIM28) og modulere ubiquitinering [20]. I MM, hvor MAGE-C1 og NY-ESO-1 er ofte overudtrykkes, er centrosom amplifikation i ~ 30% af tilfældene og er blevet forbundet med overekspression af CT gener af MAGE-familien [62]. Således kan en gevinst på funktion effekt af NY-ESO-1 og /eller MAGE-C1 på centrosom ikke udelukkes.

En dokumenteret kompleks mellem NY-ESO-1 og MAGE-C1 betød, at lokaliseringen af ​​hver CT-antigen til centrosomer eller deres uopløselighed kunne have været afhængig af interaktion. Men da cellelinjer, der udtrykker en enkelt CT-antigener stadig akkumuleret på centrosomer efter MG132 behandling, er en interaktion ikke ud til at være en forudsætning. Dette blev bekræftet ved hjælp af SK-MEL-37 celler og CT-antigen målrettet RNAi individuelt (figur S3) og understøtter en model, hvor både NY-ESO-1 og MAGE-C1 er uløseligt stand til selvstændigt centrosomal lokalisering. Desuden kunne regionerne for denne lokalisering kortlægges til aa 91-150 af NY-ESO-1 og aa 900-1116 af MAGE-C1. Denne region af NY-ESO-1 er en del af en “hot spot”, der er konstateret groft mellem aminosyrerne 80-110, for det cellulære immunrespons mod NY-ESO-1 i cancer [37,63]. Da disse MHC klasse I præsenterede epitoper er biprodukter af proteasomalaktivitet nedbrydning, identificere denne region så vigtig for omsætning og lokalisering ved MG132 behandling er konsistent. Den MHD (aa 908-1106) af MAGE-C1 er konserveret inden MAGE-familien, men udviser ringe homologi med andre kendte domæner. Selvom dets funktion er stadig ikke godt forstået, at MHD for nogle MAGE’er betegner en lokalitet af protein-protein-interaktion [20,23]. Faktisk MAGE-C1 synes at binde NY-ESO-1 via sin MHD [19,23,30]. To MAGE-C1 epitoper præsenteret af MHC-I-molekyler på MM-celler er i stand til at inducere CD8 + T-celle-respons [64] og de peptider er afledt af MHD (aa 959-968 og 1083-1091). Den fælles tilstedeværelse MHD i alle MAGE familiemedlemmer tyder på, at denne funktion i MAGE-C1 kan være relevante for at forstå den immunologiske reaktion på andre MAGE familie proteiner.

Samlet set vores resultater fremhæve en post-translationel niveau af regulering af NY-ESO-1 og MAGE-C1, der kan påvirke immunresponset mod CT antigen-udtrykkende tumorceller. Disse observationer er især relevante for MM. Anvendelsen af ​​selektive proteasominhibitorer (fx Velcade /bortezomib) har været et stort fremskridt i behandlingen af ​​MM. Vi har vist, at proteasominhibitorer sandsynligvis tilskynde centrosomal lokalisering og akkumulering af uopløseligt MAGE-C1 og NY-ESO-1 som en del af aggresomes i mm celler. Hvad fysiologisk konsekvens CT-antigen ophobning kan have i MM er endnu ikke klart. Både MAGE-C1 og NY-ESO-1 udtrykkes ofte i MM (66% og 22% af tilfældene henholdsvis), med 93% af MAGE-C1-positive myelomer som bevirker en detekterbar humoral og cellulær immunreaktion mod dette antigen [65, 66]. Akkumulering af enten CT antigen (eller begge) kan være cytotoksiske og forværre den resulterende apoptotiske program induceret af proteasominhibitorer [67]. Vi har overholdt reduceret MAGE-C1-farvning i kernen, når celler blev behandlet med MG132. Myelomer med nuklear-cytoplasmatisk eller nuklear kun MAGE-C1 har en dårligere prognose sammenlignet med dem med MAGE-C1 kun i cytoplasmaet [27]. Selvom antigen præsentation ville blive bragt i fare, kan den begrænsede CT antigen lokalisering, at resultaterne fra proteasomhæmning faktisk bidrage positivt til en forbedret prognose. Denne potentielle fordel skal dog afvejes mod de veldokumenterede pleiotrope virkninger på vigtige cellulære funktioner, der opstår med proteasomhæmning. Den centrale rolle, som UPS spillede i alle celler, herunder tumorceller, gør afgrænser et terapeutisk vindue nøgle til anvendeligheden af ​​disse forbindelser. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at bestemme de fysiologiske roller CT-antigener og de potentielle konsekvenser for effekten af ​​immunterapi mod tumorer, der ofte udtrykker dem, såsom melanom, lungecarcinom og myelomatose.

Materialer og Metoder

Celledyrkning, antistoffer og reagenser

Menneskelig melanom (SK-MEL-37) [1] og småcellet lungecancer (SCLC) cellelinjer (H146, HC33, H69, H209, H524, H889, og