PLoS ONE: Den Wnt Gatekeeper SFRP4 modulerer EMT, Cell Migration og Downstream Wnt Signalering i serøs ovariecancerceller

abstrakt

Aberrant Wnt signalering er impliceret i talrige humane cancere, og forstå virkningerne af modulation af pathway-medlemmer kan føre til udvikling af hidtil ukendte terapeutiske midler. Ekspression af secerneret frizzlede relateret protein 4 (SFRP4), et ekstracellulært modulator af Wnt signalvejen, progressivt tabt i mere aggressive ovariecancer fænotyper. Her viser vi, at rekombinant SFRP4 (rSFRP4) behandling af en serøse æggestokkene kræftcelle line resultater i hæmning af β-catenin afhængig Wnt signalering som målt ved TOP /FOP Wnt reporter assay og nedsat transskription af Wnt målgener, Axin2, CyclinD1 og Myc. Desuden rSFRP4 behandling signifikant øget evne ovariecancerceller at klæbe til collagen og fibronectin, og nedsat evne til at migrere hen over en påført såret. Vi konkluderer, at disse ændringer i celle adfærd kan medieres via mesenkymale at epitel overgang (MET), som rSFRP4 behandling også resulteret i forøget ekspression af epitelial markør E-cadherin, og reduceret ekspression af vimentin og Twist. Tilsammen indikerer disse resultater, at modulering af et enkelt opstrøms gatekeeper af Wnt-signalering kan have virkninger på downstream Wnt signalering og æggestokkræft celle adfærd, som medieres gennem epithelial til mesenchymal plasticitet (EMP). Dette rejser muligheden for, at SFRP4 kan anvendes både diagnostisk og terapeutisk i epitelial ovariekræft

Henvisning:. Ford CE, Jary E, Ma SSQ, Nixdorf S, Heinzelmann-Schwarz VA, Ward RL (2013) The Wnt gatekeeper SFRP4 modulerer EMT, Cell Migration og Downstream Wnt Signalering i serøs æggestokkene Cancer Cells. PLoS ONE 8 (1): e54362. doi: 10,1371 /journal.pone.0054362

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: 26 juli, 2012; Accepteret: 11. december 2012; Udgivet: 11 Jan 2013

Copyright: © 2013 Ford et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret delvist af tilskud fra Cure Cancer Australia Foundation (# 1.008.633, CEF), National Health og Medical Research Council CJ Martin Fellowship (# 466.005, CEF), Cancer Institute NSW (# 09 /CRF /2-02, VHS) William Maxwell Trust (VHS) og Royal Australian og New Zealand College of Obstetricians og gynækologer (VHS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelovariecancer har den højeste dødelighed af alle kvindelige gynækologiske cancere [1], [2]. Trods de seneste indsigt i heterogenitet af denne sygdom [3] – [6], og en debat over cellen af ​​oprindelse [7], [8], de fleste epitelial ovariecancer patienter får den samme systemisk behandling (carboplatin, paclitaxel [5] . Yderligere forskning i de molekylære veje, der understøtter denne sygdom er påkrævet for at identificere hidtil ukendte tumormarkører og mål for terapeutisk intervention One pathway, som er blevet identificeret som potentielt vigtige i ovariecancer er Wnt signalvejen [9] -. [11 ].

Wnt signalvejen er en afgørende udviklingsmæssig vej involveret i differentiering, polaritet, migration, invasion, vedhæftning og overlevelse [12]. Disse samme cellulære processer er centrale elementer i tumorudvikling og metastase, og dermed den rolle af Wnt signalering i human cancer stigende grad undersøgt sammen med terapeutiske strategier til at målrette pathway komponenter. dysregulering af Wnt signalvejen er blevet impliceret i talrige cancere herunder dem med høj forekomst og /eller dårlige resultater, såsom colorektal, bryst, ovarie, og prostatacancer (gennemgået i [13]).

Denne mangesidede signalering netværk er traditionelt forenkles ved at dividere det net kanoniske (β-catenin afhængig) og ikke-kanoniske (β-catenin uafhængige) veje. Canonical Wnt signalering involverer binding af Wnt ligand til en af ​​ti Frizzled receptorer (FZD) i nærvær af en lav densitet lipoprotein receptor relateret protein (LRP) coreceptor. Dette frembringer en kaskade af begivenheder, der fører til adskillelse af den Axin /APC /GSK3p ødelæggelse kompleks og stabiliseringen af ​​β-catenin. Akkumulering af β-catenin i cytoplasmaet medfører translokation til kernen og TCF /LEF medieret aktivering af target gener involveret i celledifferentiering og proliferation. Vigtige nedstrøms mål for aktiverede kanoniske Wnt signalering omfatter C-myc (

MYC

), CyclinD1 (

CCND1

) og Axin2 (

AXIN2

) [12].

Wnt pathway reguleres på flere niveauer, med Wnt antagonister eller “gatekeeper proteiner” modtagende opmærksomhed i de senere år på grund af deres hyppige inaktivering i cancer. Denne gruppe af Wnt modulatorer indbefatter Dickkopf familie (DKK1-4), WIF-1 og familien af ​​secernerede frizzled receptorproteiner (SFRP1-5). SFRPs er opløselige ekstracellulære proteiner karakteriseret ved deres Frizzled-lignende cysteinrige domæne (CRD), som menes at være ansvarlig for deres evne til at modulere Wnt signalering ved at binde direkte til Wnt ligander eller Frizzled receptorer. SFRPs har vist sig at fungere som tumorsuppressorer i andre cancertyper [14] – [17]. Vi har tidligere vist, at en af ​​disse dørvogtere, SFRP4, secerneres ind i blodstrømmen og progressivt tabt i mere aggressive ovariecancer fænotyper, såsom type II cancere [18]. Endvidere patienter mangler SFRP4 ekspression havde en dårligere prognose end dem udtrykker SFRP4 [18].

Epithelial til mesenkymale overgang (EMT) er en vigtig udviklingsproces at cancerceller kapre at øge deres aggressivitet og invasive potentiale [19] . Selvom kompleks, og celletype specifik, kan celler, der undergår EMT generelt være præget af tabet af E-cadherin og gevinst på vimentin, Twist og Snail. Overgangsordningen proces kan også forekomme i den modsatte retning (mesenkymale til epitelial overgang (MET).) Det er nu forstået, at MET er lige vigtige i organogenese og metastase, og at der findes mange mellemliggende eller “metastabile” celle stater som celler overgang mellem de to yderpunkter [20], [21]. Denne dynamiske proces er blevet kaldt epitelial til mesenkymale plasticitet, eller EMP. Mange signalveje er blevet knyttet til EMP, navnlig TGF β, hak og Wnt veje.

I nærværende studie undersøger vi de funktionelle effekter af modulation af en nøgle Wnt vej gatekeeper, SFRP4 om Wnt signalering, celle adfærd og EMT. Vi rapporterer for første gang, at re-ekspressionen af ​​SFRP4 i en epitelial ovariecancer cellelinje hæmmer Wnt signalering, øger vedhæftning, hæmmer celle migration og hæmmer EMT. Da SFRP4 udtryk har vist sig at være tabt i et stort flertal af patienter med ovariecancer [18], hæver det muligheden for, at modulation af Wnt signalering gennem SFRP4 eller andre opstrøms Wnt pathway medlemmer kan repræsentere en ny vej for målrettet terapi i kræft i æggestokkene.

Materialer og metoder

Cell kultur

Humane serøse ovariecancer OVCAR3 celler, opnået fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) blev dyrket i RPMI indeholdende 10% føtalt kalveserum. Medier blev suppleret med penicillin /streptomycin (90 enheder /ml penicillin, 90 ug /ml streptomycin) og 1,8 mM Glutamax (Life Technologies). Alle celler blev dyrket i en fugtig atmosfære af 5% CO

2, ved 37 ° C og blev påvist at være fri for forurening med mycoplasma.

Wnt reporter assays

OVCAR3 celler blev udpladet ved en koncentration på 5000 celler /brønd på hvid bund plader med 96 brønde. Celler blev serum sultet natten over og co-transficeret med 0,2 ug af enten TOPflash (3 × TCF4 bindingssteder) eller FOPflash (3 × muterede TCF4 bindingssteder) ekspressionsplasmider (Millipore, Temecula, CA, USA) og 0,1 ug pRL-TK (Renilla-TK-luciferase vektor, Promega) som kontrol, ved hjælp af lipofectamin 2000. Celler blev efterfølgende behandlet med stigende doser af rSFRP4 og /eller rekombinant Wnt3 a (rWnt3 en 0,1 ug /ml) i 48 timer før luciferaseaktiviteter der måles under anvendelse af en Glomax 96 Microplate Luminometer (Turner Biosystems instrument, Sunnyvale, CA, USA). Ildflue-luciferase-aktivitet blev normaliseret for transfektionseffektivitet ved at dividere med Renilla luciferaseaktivitet. TOP /FOP forholdet blev anvendt som et mål for β-catenin drevet transskription. Gennemsnitlige aktivitet og standardafvigelser blev afledt fra octopulate transficerede prøver.

Kvantitativ revers-transkriptase PCR (qPCR)

Efter DNAse behandling, 1 ug totalt RNA blev transkriberet til cDNA under anvendelse af Quantitect RT kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Kontroller indeholdende RNA, men uden revers transkriptase blev inkluderet for alle prøver. qPCR blev udført tre gange på en Stratagene MxPro 3005 P maskine under anvendelse af 25 ng cDNA skabelon og SYBR green /Rox Master Mix (Qiagen). Ekspression blev normaliseret til tre forskellige husholdning gener (SDHA, HSPCB, YWHZA) ved hjælp af Vandesompele normaliseringsmetode [22]

Primer sekvenser anvendt til qPCR var SFRP4:. Fremad (F) 5 ‘TGTGTTACGAGTGGCG 3’, omvendt ( R) 5 ‘GGGGGATTACTACGACTG 3’, CDH1: F 5’AGGCCAAGCAGCAGTACATT 3 ‘R5’ ATTCACATCCAGCACATCCA 3 ‘, VIM F 5’CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC 3’ R5 ‘GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA 3’, TWIST F 5’GCCAATCAGCCACTGAAAGG 3 ‘R5’ TGTTCTTATAGTTCCTCTGATTGTTACCA 3 ‘ , AXIN2 F 5’TCAAGTGCAAACTTTCGCCAACC 3 ‘R5’ TAGCCAGAACCTATGTGATAAGG 3 ‘, MYC F 5’CGTCTCCACACATCAGCACAA 3’, R5 ‘CACTGTCCAACTTGACCCTCTTG 3’, CCND1 F 5’GGCGGAGGAGAACAAACAGA 3 ‘R5’ TGGCACAAGAGGCAACGA 3 ‘, JNK F 5’TCTGGTATGATCCTTCTGAAGCA 3 R 5 ‘TCCTCCAAGTCCATAACTTCCTT, RhoA F 5’GGAAAGCAGGTAGAGTTGGCT 3’ R5 ‘GGCTGTCGATGGAAAAACACAT 3’, Rac1 F 5’TGTAGTCGCTTTGCCTATTGATG 3 ‘R5’ CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3 ‘, PRKCA F 5’GCTTCCAGTGCCAAGTTTGC 3’ R5 ‘CATCGTCAGCACTAGCACAGTTT 3’, SDHA F 5 ‘CTTGAATGAGGCTGACTGTG 3’ R5 ‘ATCACATAAGCTGGTCCTGT 3’, HSPCB F 5’TCTGGGTATCGGAAAGCAAGCC 3 ‘R5’ GTGCACTTCCTCAGGCATCTTG 3 ‘, YWHZA F 5’ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA 3’ R5 ‘CCGCCAGGACAAACCAGTAT 3’.

Western blots

Cellelysater blev fremstillet ved at lysere celler i lysepuffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natriumorthovanadat, 50 mM natriumfluorid, 0,27 M saccharose, 1 × komplet proteaseinhibitor (Roche, Basel, Schweiz)). Lysater blev centrifugeret, og supernatanten blev opsamlet for proteinkoncentration analyse under anvendelse af BCA-kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Nukleare proteinlysater blev fremstillet ved lysere celler i iskold Nuclei Buffer (10 mM Tris, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA og 0,5% NP-40, proteaseinhibitorer) og inkubering på is i 10 minutter . Kerner blev udvundet ved centrifugering ved 900 g i 3 minutter, vasket i Nuclei vaskebuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCI2 og 0,1 mM EDTA indeholdende proteaseinhibitorer) og resuspenderes i lysepuffer. Proteiner blev separeret under anvendelse af SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. For Western blotting, antistoffer mod SFRP4 (ab32784, Abcam, Cambridge, MA, USA), E-cadherin (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), vimentin (# 5741, Cell Signaling Technology), Twist (# sc15393 blev Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), β-catenin (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), histon H3 (# 9715s, Cell Signalling) og α-tubulin (# 3873, Cell Signaling Technology) anvendes. Protein bands blev påvist og kvantificeret ved hjælp af billede Quant LAS 4000 (GE Healthcare).

Migration assays

OVCAR3 celler blev podet på IBIDI Kultur-Indsætter (IBIDI GmbH, Am Klopferspitz 19, 82152 Martinsried , Tyskland) og blev behandlet i 24 timer med rSFRP4 (5 ug /ml). IBIDI insertioner blev fjernet og lukningen af ​​den resulterende sår blev overvåget i løbet af de næste 48 timer. Billeder af såret blev indfanget på forskellige tidspunkter under anvendelse af Leica DMIL mikroskopsystem (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).

adhæsionsassays

vævskulturplader blev belagt med opløsninger af 10 ug /ml type i collagen (Sigma, Castle Hill, Australien), 5 ug /ml fibronectin (Millipore, Bedford, MA, USA) eller 3% BSA i PBS og inkuberet natten over ved 37 ° C. Plader blev skyllet med 80% ethanol, inkuberet i 3% BSA i serumfrit medium i 30 minutter ved 37 ° C og skylles igen med PBS. Cellesuspensioner blev tilsat til de coatede plader og fik lov til at klæbe i 4 timer ved 37 ° C. Pladerne blev forsigtigt vasket med PBS, fikseret med 96% ethanol og farvet med 0,1% krystalviolet. Overskydende farve blev fjernet ved ekstensivt vaske plader med sterilt vand. Efter pladerne var tørret, blev celler lyseret med 50% eddikesyre, og absorbans blev aflæst ved 595 nm under anvendelse af en SpectraMax Plus384 Absorbans Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Statistisk analyse

Resultater udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Statistik blev udført under anvendelse af en to-halet Students t-test. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001

Resultater og Diskussion

SFRP4 hæmmer Wnt signalering i en serøs kræft i æggestokkene cellelinje

i forlængelse af vores tidligere arbejde indikerer, at SFRP4 tab var en hyppig begivenhed i epitelial ovariekræft [18] vi bestemmes, hvis tilsætning af human rekombinant SFRP4 (rSFRP4)

in vitro

kunne hæmme β-catenin afhængig Wnt signalering. Vi valgte den serøse ovariecancer cellelinje OVCAR3 til disse eksperimenter, som det mangler enhver påviselig SFRP4 ekspression og er tidligere blevet rapporteret at udvise konstitutiv Wnt signalering (som påvist ved akkumuleringen /tilstedeværelse af nuklear β-catenin, [23]). Stimulering af OVCAR3 celler med rekombinant Wnt3a (rWnt3a) resulterede i en signifikant stigning i β-catenin afhængig Wnt signalering som målt via TOP /FOP FLASH luciferase Wnt reporter assay (figur 1A), hvilket bekræfter, at det faktisk var en Wnt responsiv cellelinie. Vi derefter testet stigende koncentrationer af rSFRP4, og fandt, at 5 pg /ml af rSFRP4 var forpligtet signifikant at hæmme β-catenin afhængige Wnt signalering (figur 1A). Denne koncentration af rSFRP4 blev også vist at inhibere protein-niveauer af β-catenin i kernen (figur 1B). Denne koncentration blev derefter anvendt til alle efterfølgende eksperimenter.

(A) OVCAR3 celler blev co-transficeret med pRL-TK (Renilla) og enten TOPflash eller FOPflash ekspressionsplasmider. Celler blev efterfølgende behandlet med stigende doser af rSFRP4 og /eller rekombinant Wnt3 a (rWnt3a 0,1 ug /ml) i 48 timer før luciferaseaktiviteter der måles under anvendelse af en Glomax 96 Microplate luminometer. Gennemsnitlig aktivitet og standardafvigelser blev afledt fra octopulate transfekterede prøver. Resultaterne repræsenterer gennemsnittet af 3 eksperimenter og bjælker repræsenterer standardafvigelsen (S. D.) af middelværdien. *

P

0,05. (B) Repræsentative immunoblots viser forøget SFRP4 og nedsat nukleare β-catenin proteinekspression i OVCAR3 celler efter 72 timers behandling med rSFRP4 (5 ug /ml). Top panel SFRP4 udtryk (SFRP4, ab32784, Abcam, Cambridge, UK), andet panel α-tubulin udtryk (α-tubulin # 3873, Cell Signalering Technologies, Danvers, MA, USA), tredje panel nukleare β-catenin (# sc7963, Santa Cruz Biotechnology), bundpanelet histon H3 (# 9715s, Cell Signalling). (C) Densitometrisk analyse af SFRP4 proteinekspression i 3 separate forsøg. Søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. *

P

0,05. (D) Relativ SFRP4 RNA-ekspression blev øget i OVCAR3 celler behandlet med rSFRP4 (5 ug /ml) i 48 timer. QRT-PCR blev udført tre gange og normaliseret til tre forskellige husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA). Resultaterne repræsenterer et gennemsnit på 6 forsøg. Søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. *

P

0,05. (E) Relativ ekspression af β-catenin afhængige Wnt målgener blev reduceret i OVCAR3 celler behandlet med rSFRP4 (5 ug /ml) i 48 timer. QRT-PCR blev udført tre gange og normaliseret til tre forskellige husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA) Ekspression af AXIN2, MYC og CCND1 blev reduceret i rSFP4 behandlede celler, i sammenligning med kontrolgruppen. Resultaterne repræsenterer et gennemsnit på 4 eksperimenter og søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. *

P

0,05. (F) Relativ ekspression af β-catenin uafhængige Wnt målgener var uændret i OVCAR3 celler behandlet med rSFRP4 (5 ug /ml) i 48 timer. QRT-PCR blev udført tre gange og normaliseret til tre forskellige husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA) Ekspression af JNK, RhoA, Rac1 og PRK2A var uændrede i rSFP4 behandlede celler i sammenligning med kontrolgruppen. Resultaterne repræsenterer et gennemsnit af 3 eksperimenter og søjler repræsenterer sd af middelværdien.

Otteogfyrre timers behandling med rSFRP4 (5 ug /ml) medføre en omtrentlig fordobling i SFRP4 mRNA og protein som tilsætning af ekstracellulære rekombinante Wnt proteiner forøger endogen proteinproduktion. (Figur 1B-D). Udtrykket af tre nedstrøms Wnt målgener CyclinD1 (CCND1), C-myc (MYC) og Axin2 (AXIN2) blev nedsat efter rSFRP4 behandling (figur 1E). Men af ​​disse 3 gener, blev kun AXIN2 udtryk reduceret væsentligt (

P

= 0,03). I modsætning til CCND1 og MYC, er AXIN2 godt accepteret som en specifik Wnt målgen, og til dato er ikke blevet forbundet med andre signalveje [24] – [27]. Forøget ekspression af AXIN2 blev rapporteret i alle serøse ovariecancerpatienter i en nylig undersøgelse [10], hvilket indikerer, at afvigende Wnt signalering kan være mere udbredt i epitelovariecancer end tidligere antaget. Både MYC og CCND1 er kendt for at fungere i andre afgørende signalveje impliceret i æggestokkene carcinogenese [28] – [31], som kan forklare, hvorfor de udviste svagere udtryk ændringer end AXIN2 som reaktion på SFRP4 behandling. Det er dog bemærkelsesværdigt, at tilsætningen af ​​SFRP4 i vores system var i stand til at reducere transkriptionen af ​​tre nedstrøms gener af Wnt signalvejen, men havde ingen effekt på nedstrøms mål for β-catenin uafhængig Wnt signalering (fig 1F) eller på en opstrøms receptor-vejen (FZD7) og tre uafhængige receptorer (EGFR, ErbB3, AKT, data ikke vist).

Kombineret, disse indledende forsøg viser, at tilsætningen af ​​en enkelt Wnt pathway modulator kan modulere gen transkription i en model serøs ovariecancer cellelinie. Baseret på TOP /FOP Wnt reporter assay Western blots og Wnt målgenprodukter resultater, vores data antyder også, at i tilfælde af ovariecancer, SFRP4 gør faktisk fungerer som en antagonist af den kanoniske eller β-catenin afhængig Wnt signalvej. Det fremgår også, at SFRP4 ikke handler at hæmme β-catenin uafhængig Wnt signalering, som fire målgener var upåvirket af behandling med SFRP4. Dette er af interesse, da det er uklart inden for Wnt signalering nøjagtigt som Wnt-ligander inhiberes af hvilke specifikke medlemmer af SFRP familien, og om i nogle tilfælde SFRPs kan faktisk forøge snarere end inhiberer Wnt signalering [32] – [34 ].

SFRP4 behandling faldt migration og forøget adhæsion af ovariecancerceller

SFRP4 behandling havde ingen virkning på cellulær proliferation (figur 2A), men inhiberede signifikant evne OVCAR3 celler til at migrere over en påført såret (figur 2B). Det blev også vist, at tilsætning af SFRP4 øget evne ovariecancerceller at klæbe til collagen og fibronectin overtrukne vævskulturplader (figur 2C). Disse data tyder på, at SFRP4 har evnen til at hæmme metastatiske potentiale ovariecancerceller

in vitro

, der passer med vores tidligere kliniske data rapporterer, at patienter, der udtrykker SFRP4 havde bedre progressionsfri og samlet overlevelse sammenlignet med dem, der mangler SFRP4 ekspression [18]. Det tilføjer til den voksende mængde af beviser, at Wnt signalvejen primært kan spille en rolle i cancer metastaser i stedet kræft indvielse.

(A) 24 timer rSFRP4 behandling (5 ug /ml) havde ingen effekt på celle proliferation, målt via trypan blue celletælling under anvendelse grevinden systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Resultaterne repræsenterer gennemsnittet af 3 eksperimenter og søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. (B) SFRP4 hæmmede celle migration. OVCAR3 celler podedes på IBIDI Kultur-Inserts og behandlet i 24 timer med rSFRP4 (5 ug /ml). IBIDI insertioner blev fjernet og lukningen af ​​den resulterende sår blev overvåget i løbet af de næste 24 timer. Eksperimentet blev gentaget tre gange, og resultaterne repræsenterer middelværdien procentdel af åbent sår og søjler repræsenterer s.d. **

P

0,01. (C) SFRP4 forøget adhæsion til collagen og fibronectin. SFRP4 (5 ug /ml, 48 timer) behandlede celler fik lov at adhærere i 4 timer ved 37 ° C til enten 10 ug /ml type I collagen eller 5 ug /ml fibronectin, derefter vasket, lyseret og absorbansen målt ved 595 nm ved anvendelse af den SpectraMax Plus384 Absorbans Microplate Reader. Resultaterne repræsenterer gennemsnittet af 6 eksperimenter og søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. *

P

. 0,05

SFRP4 hæmmer EMT i æggestokkene kræftceller

Da ændringer i cellulær adfærd er knyttet til EMT, vi også undersøgt, om SFRP4 ville påvirke celle morfologi og udtryk for centrale EMT markører, E-cadherin (CDH1), vimentin (VIM), og Twist1 (TWIST1). Mens ingen åbenlyse ændringer i cellemorfologi blev noteret 48 timer efter SFRP4 behandling (figur 3A), behandling med rSFRP4 forøgede ekspressionen af ​​E-cadherin (figur 3B-D), og reduceret ekspression af vimentin og Twist (figur 3B-D) ved både det transkriptionelle og translationel niveau, tyder på initiering af behandling.

(A) SFRP4 behandling (5 mg /ml, 48 timer) ikke forårsage nogen tydelige ændringer i cellens morfologi serøs ovariecancer cellelinje , OVCAR3 (10 ganges forstørrelse). (B) E-cadherin (CDH1) udtryk blev signifikant forøget, og vimentin og Twist faldt i SFRP4 (5 mg /ml, 48 timer) behandlede OVCAR3 celler. QRT-PCR blev udført tre gange og normaliseret til tre forskellige husholdningsgener (SDHA, HSPCB, YWHZA). Resultaterne repræsenterer et gennemsnit på 6 eksperimenter og søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. **

P

0,01, ***

P

0,001. (C) Repræsentative immunoblots viser forøget CDH1, og nedsat VIM og TWIST1 proteinekspression i OVCAR3 celler efter 72 timers behandling med rSFRP4 (5 ug /ml). Top panel CDH1 udtryk (# 3195, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), andet panel VIM udtryk (# 5741, Cell Signaling Technology), tredje panel TWIST1 udtryk (# sc15393, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA ), og bundpanelet α-tubulin ekspression (α-tubulin # 3873, Cell Signalling Technology). (D) Densitometrisk analyse af CDH1, VIM og TWIST1 proteinekspression i 3 separate forsøg. Søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. **

P

0,01, *

P

. 0,05

EMT, ligesom Wnt vej, er stærkest knyttet til udvikling, men for nylig har modtaget udbredt interesse i sit potentiale som et mål for kræftbehandling. Generelle processer, der foregår i alle cancerceller er en attraktiv vej til cancerterapi, som potentielle behandlinger vil have udbredt anvendelighed. Derudover har afvigende Wnt signalering været stærkt knyttet til kræft med en dårlig prognose [12], [35], så yderligere belysning af den rolle, denne vej, og dens naturlige dørvogtere vil give vigtig indsigt i human sygdom. Det har været kendt i mange år, at Wnt signalering kan påvirke kræft cellevandring og adhæsion, og denne undersøgelse giver nogle beviser for, at disse virkninger kan rettes gennem processen med EMT. Vores resultater yde støtte til en nylig undersøgelse forbinder AXIN2 og EMT i kolorektal cancer [27]. Desuden har vi hypotese, at SFRP4 hæmmer evnen af ​​specifikke Wnt-ligander til at binde til Frizzled receptorer. Baseret på to tidligere undersøgelser, den ene angiver, at Wnt7a er overudtrykt i ovariecancer [11], og man antyder SFRP4 kan hæmme Wnt7a binding til Fzd5 i endometriecancer [36], vi spekulere, at under normale forhold SFRP4 binder og isolerer væk Wnt7a. Men i epitelial ovariecancer er SFRP4 tavshed, så Wnt7a at binde Fzd5 og aktivere β-catenin afhængig Wnt signalering, og drev TCF /LEF medieret transskription af Wnt reportergener såsom AXIN2, MYC og CCND1.

Wnt signalvej er et meget komplekst og forbundet pathway forbundet med mange humane sygdomme. Da vejen er hovedsageligt involveret i embryogenese og voksent væv reparation, er lægemidler målrettet mod denne vej ikke forventes at forårsage betydelige bivirkninger eller toksicitet [37]. Men forsøg på at målrette Wnt signalvejen i cancer har været stort set mislykket, med nogen klinisk godkendte lægemidler til dato. Dette kan skyldes valget af lægemiddelmål bosiddende længere nedstrøms i Wnt signalvejen (for nylig revideret i [38]). Talrige undersøgelser har nu rapporteret inaktivering af opstrøms komponenter i Wnt-vejen i cancer, herunder medlemmer af SFRP og familier DKK, hvilket indikerer en vigtig rolle for disse gatekeeper proteiner i onkogenese [14] – [17], [34], [39] . Disse ekstracellulære proteiner har også stort potentiale som lægemiddelmål som følge af deres opstrøms position i forløbet. Dette papir viser potentialet af opstrøms pathway modulation anvendelse af en enkelt Wnt antagonist. Da der er mindst ti ekstracellulære antagonister af Wnt-vejen aktuelt fastlagt, kombinationer af disse kan give endnu stærkere virkninger [40] og fortjener yderligere udforskning.