PLoS ONE: Amygdalin Blocks blærekræft Cell Growth in vitro ved at mindske cyclin A og cdk2

Abstrakt

Amygdalin, en naturlig forbindelse, er blevet brugt af mange kræftpatienter som en alternativ metode til at behandle deres sygdom. Men hvorvidt dette stof virkelig udøver, en anti-tumor effekt er aldrig blevet afgjort. En in vitro-undersøgelse blev indledt for at undersøge indflydelsen af ​​amygdalin (1,25-10 mg /ml) på væksten af ​​et panel af blærekræft cellelinier (UMUC-3, RT112 og TCCSUP). Tumorvækst, spredning, klonal vækst og cellecyklusprogression blev undersøgt. Cellecyklussen regulerer proteiner CDK1, CDK2, CDK4, cyclin A, cyclin B, cyclin D1, p19, p27 samt mammalian target of rapamycin (mTOR) relateret signaler phosphoAkt, phosphoRaptor og phosphoRictor blev undersøgt. Amygdalin dosisafhængigt reduceret vækst og proliferation i alle tre blærekræft cellelinjer, hvilket afspejles i en betydelig forsinkelse i cellecyklusprogression og G0 /G1 anholdelse. Molekylær evaluering afslørede formindsket phosphoAkt, phosphoRictor og tab af Cdk og cyclin komponenter. Eftersom de mest fremragende virkninger af amygdalin blev observeret på cdk2-cyclin A akse, siRNA vælte blev udført, afslører en positiv korrelation mellem cdk2 /cyclin A ekspressionsniveauet og tumorvækst. Amygdalin, derfor kan blokere tumorvækst ved ned-modulerende cdk2 og cyclin A. In vivo undersøgelse skal følge for at vurdere amygdalin praktiske værdi som en anti-tumor narkotika

Henvisning:. Makarević J, Rutz J, Juengel E , Kaulfuss S, Reiter M, Tsaur I, et al. (2014) amygdalin Blocks blærekræft Cell Growth

In Vitro

ved at mindske cyclin A og cdk2. PLoS ONE 9 (8): e105590. doi: 10,1371 /journal.pone.0105590

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget den 22. april 2014 Accepteret: 23, 2014 Udgivet: 19 August, 2014

Copyright: © 2014 Makarevic et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af “Brigitta und Norbert Muth Stiftung” (https://www.muth-stiftung.de) og “Freunde und Förderer der Goethe -Universität Frankfurt “(https://www2.uni-frankfurt.de). Finansieringen blev modtaget af RAB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blære karcinom er den anden mest almindelige malignitet af urogenitale kanal i de vestlige lande, med en incidens på 37,9 /100.000 om året for mænd og 9,6 /100.000 om året for kvinder [1]. Ca. 70% af oprindelig diagnosticerede tumorer er overfladisk og kan behandles ved transuretral resektion, hvorved blæren bevares. De resterende 30% af tumorer bliver muskel invasive og er forbundet med en høj risiko for metastase [2]. For de patienter med lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom, kemoterapi er en behandlingsmulighed. Men prognosen for patienter med metastaser forbliver fattige, med en median overlevelse på 14 måneder og en 5-års overlevelse på 15% [3].

Mere end 50% af kræftpatienter i Europa anvender supplerende /alternativ medicin (CAM) i stedet for, eller kombineres med konventionel behandling [4]. Utilfredshed med konventionel behandling og nedbringelse af kemoterapeutiske bivirkninger er de mest almindelige årsager til brug af CAM [5], [6]. Men selv om CAM forbrug er populær blandt kræftpatienter, er evidensbaseret fordel fra naturligt baserede forbindelser mangler. Forskellen mellem brug af et naturprodukt og viden om dens anti-tumor egenskaber er især afspejlet i tilfælde af amygdalin. Amygdalin (D-mandelonitril-β-gentiobioside) er en cyanogene diglucosid stede i pitten af ​​mange frugter og i talrige planter tilhørende Rosaceae familien såsom Prunus persica (fersken), Prunus armeniaca (abrikos) og Prunus amygdalus amara (bitter mandel ). Udtrykket “Laetrile” bruges ofte som et synonym for amygdalin. Men Laetrile er strukturelt forskellig fra moderen forbindelse, amygdalin, og er et akronym (venstredrejende og mandelonitril) til et oprenset, semi-syntetisk form af amygdalin. Nærværende undersøgelse beskæftiger “amygdalin”.

Amygdalin var en af ​​de mest populære, ikke-konventionelle, anti-cancer behandlinger i 1970’erne. I 1978 havde 70.000 amerikanske kræftpatienter brugt amygdalin til at behandle deres kræft [7]. Stadig, evidensbaseret forskning om amygdalin er sparsom og dens fordel kontroversielle. Fortalere overveje amygdalin en naturlig kræft kur, mens modstanderne advarer om, at amygdalin er ineffektiv og endda giftige. Selv om det er blevet hævdet, at amygdalin er usikre, har ingen alvorlige akut toksicitet er stødt. Det er også blevet konkluderet, at amygdalin har nogen anti-tumor potentiale, men fra 368 kræftpatienter, der er anført i en bedømmelse, 12,5% oplevede en komplet eller delvis respons, 6,8% havde stabil sygdom og 22,9% viste symptomatisk gavn af amygdalin [8]. For at få indblik i, hvordan amygdalin kan fungere, blev et in vitro indledt for at fastslå dens indflydelse på væksten blærekræft og spredning. Derudover blev cellecyklusprogression og cellecyklus regulering proteiner evalueret i amygdalin behandlede og ikke-behandlede celler. siRNA vælte undersøgelser blev udført for at undersøge proteiner ændres ved amygdalin, som kan have klinisk relevans.

In vitro data, der præsenteres her, peger på en betydelig vækst og spredning blokerende virkning af amygdalin, sandsynligvis fremkaldt af et fald i cellecyklus regulerer proteiner cdk2 og cyclin A.

Materialer og metoder

Cell kultur

RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Tyskland) og TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) blærecarcinomceller blev dyrket og subdyrket i RPMI 1640, 10% føtalt kalveserum (FCS), 20 mM HEPES-puffer, 1% Glutamax og 1% penicillin /streptomycin (alle: Gibco /Invitrogen; Karlsruhe , Tyskland). RT112 er en invasiv (patologisk stadie T2) moderat differentierede (grad 2/3) model af menneskelig blærekræft, mens TCCSUP er en overgangsordning celle karcinom, klasse 4. UMUC-3 repræsenterer en høj grad 3, invasiv blærekræft. Subkulturer fra passager 7-24 blev anvendt.

Amygdalin behandling

Amygdalin fra abrikoskerner (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) var frisk opløst i celledyrkningsmedium og tilsat til tumorceller i koncentrationer i området fra 1.25-10 mg /ml. Kontroller forblev ubehandlet. I alle eksperimenter blev behandlet tumor cellekulturer sammenlignet med ikke-behandlede kulturer. Til vurdering af toksiske virkninger af amygdalin blev cellelevedygtigheden bestemt ved trypanblåt (Gibco /Invitrogen). For apoptose evaluering ekspressionen af ​​Annexin V /propidiumiodid (PI) blev bestemt under anvendelse af Annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (BD Pharmingen, Heidelberg, Tyskland). Tumorceller blev vasket to gange med PBS og derefter inkuberet med 5 pi Annexin V-FITC og 5 pi PI i mørke i 15 minutter ved stuetemperatur. Celler blev analyseret på en FACScalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Procentdelen af ​​apoptotiske celler (tidlig og sen) i hver kvadrant blev beregnet ved hjælp af CellQuest software (BD Biosciences).

Måling af tumorcellevækst og spredning

Cell vækst blev vurderet ved hjælp af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) reduktion farvestof-assay (Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland). Tumorceller (100 pi, 1 x 10

4 celler /ml) blev podet på 96-brønds vævskulturplader. Efter 24, 48 og 72 h blev MTT (0,5 mg /ml) tilsat i yderligere 4 timer. Derefter blev celler lyseret i en puffer indeholdende 10% SDS i 0,01 M HCI. Pladerne blev derefter inkuberet natten over ved 37 ° C, 5% CO

2. Absorbans ved 570 nm blev målt for hver brønd med en mikroplade ELISA-læser. Hvert eksperiment blev udført tre gange. Efter fradrag baggrundsabsorbansen blev resultaterne udtrykt som middel celleantal.

Celleproliferation blev målt ved anvendelse af et BrdU celleproliferation enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) kit (Calbiochem /Merck Biosciences, Darmstadt, Tyskland). Tumorceller, podet på 96-brønds mikrotiterplader, blev inkuberet med 20 pi BrdU-mærkning opløsning per brønd i 8 timer, fikseret og detekteret ved anvendelse af anti-BrdU-mAb ifølge producentens anvisninger. Absorbans blev målt ved 450 nm.

klongenicitetsassayet

Tumorceller, forbehandlet med amygdalin i 2 uger, blev overført til plader med 6 brønde ved 300 celler per brønd. Følgende 10 dages inkubation, hvorunder cellerne enten blev eksponeret for amygdalin eller ikke blev kolonier fikseret og talt. Kolonier af mindst 50 celler blev talt som én.

Cell cyklus analyse

Cell cyklus analyse blev udført med subkonfluente tumorceller. Tumorcellepopulationer blev farvet med propidiumiodid under anvendelse af en cyklus TEST PLUS DNA Reagent Kit (BD Pharmingen) og derefter underkastet flowcytometri med et FACScan flowcytometer (Becton Dickinson). 10.000 hændelser blev indsamlet for hver prøve. Dataopsamling blev udført under anvendelse Cell-Quest software og cellecyklusfordeling blev beregnet under anvendelse af ModFit software (BD Biosciences). Antallet af gated celler i G1, er G2 /M eller S-fasen præsenteret som%.

Western blotting

For at undersøge proteiner involveret i reguleringen af ​​cellevækst, tumor cellelysater blev anvendt til en 7% polyacrylamidgel og elektroforesebehandlet i 90 minutter ved 100 V. proteinet blev derefter overført til nitrocellulosemembraner. Efter blokering med fedtfri tørmælk i 1 time, blev membranerne inkuberet natten over med monoklonale antistoffer rettet mod de cellecyklusproteiner: Cdk1 (IgG1, klon 1), cdk2 (IgG2a, klon 55), cdk4 (IgG1, klon 97), cyclin A (lgG1, klon 25), cyclin B (lgG1, klon 18), cyclin D1 (lgG1, klon G124-326), p19 (lgG1, klon 52 /p19), p27 (lgG1, klon 57; alt: BD Pharmingen ). Den pattedyr mål for rapamycin (mTOR) pathway blev undersøgt ved hjælp af følgende monoklonale antistoffer: anti phospho Rictor (pRictor, IgG, Thr1135, klon D30A3), anti phospho Raptor (pRaptor, IgG, Ser792, begge: New England Biolabs, Frankfurt am Main, Tyskland), anti phospho Akt (Pakt, IgG1, Ser472 /Ser473, klon 104A282; BD Pharmingen). Epigenetisk graduering blev undersøgt ved anti acetyleret H3 (ah3, IgG, Lys9, klon C5B11) og anti acetyleret H4 (AH4, Lys8, polyklonale, IgG, både: New England Biolabs).

HRP-konjugeret gede-anti -mouse IgG (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA; fortynding 1:5.000) tjente som det sekundære antistof. Membranerne blev kortvarigt inkuberet med ECL detektionsreagens (ECLTM, Amersham /GE Healthcare, München, Tyskland) for at visualisere proteiner og derefter analyseret af Fusion FX7 systemet (Peqlab, Erlangen, Tyskland). β-actin (1:1000, Sigma, Taufenkirchen, Tyskland). tjente som intern kontrol

Gimp 2.8 software blev anvendt til at udføre pixeltæthed analyse af proteinbåndene. Forholdet mellem intensiteten af ​​hver undersøgte protein /intensiteten af ​​β-actin blev beregnet, og intensitetsværdier blev derefter udtrykt i procent, i forhold til kontrol sat til 100%.

Cdk2 og cyclin En sammenklappelig

Tumorceller (3 × 10

5/6-brønd) blev transficeret med lille interfererende RNA (siRNA) rettet mod CDK2 (gen ID: 1017 målsekvens: AGGTGGTGGCGCTTAAGAAAA) eller cyclin A (gen ID: 890, målsekvens : GCCAGCTGTCAGGATAATAAA; Qiagen, Hilden, Tyskland), med en siRNA /transfektionsreagens (HiPerFect transfektionsreagens; Qiagen) forhold på 01:06. Ikke-behandlede celler og celler behandlet med 5 nM kontrol siRNA (Alle stjerner negativ kontrol siRNA; Qiagen) tjente som kontroller. Efterfølgende blev tumorcellevækst analyseret som anført ovenfor.

Statistik

Alle eksperimenter blev udført 3-6 gange. Statistisk signifikans blev vurderet ved ikke-parametriske Wilcoxon-Mann-Whitney-U-test til eksperimenter gentaget 6 gange. Forsøg udført 3 gange blev statistisk evalueret af den parametriske t-test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på ap værdi mindre end 0,05.

Resultater

Dosis-respons analyse

udsættes tumorcellerne til amygdalin (enkeltdosis ansøgning) førte til en koncentration -afhængig reduktion i tumoren celleantal, med den mest fremtrædende virkning tydelig i TCCSUP cellelinje (fig. 1, 24 h ansøgning). Ingen tegn på toksicitet blev vist ved trypan udelukkelse test blå. Da den stærkeste reduktion celle blev set med 10 mg /ml amygdalin, blev denne koncentration anvendes til alle følgende undersøgelse. Langtidsbehandling består af 10 mg /ml amygdalin tilføjet til tumorceller tre gange om ugen over en periode på to uger viste, at cellevækst blev formindsket i et lignende omfang som den, der mødte med protokollen kortvarig behandling (fig. 1, 2 uge ansøgning).

Controls forblev ubehandlet. Ned: Tumor cellevækst efter 2 ugers behandling med 10 mg /ml amygdalin. Hvert eksperiment blev udført tre gange og gentages 5 gange. Data fra et repræsentativt forsøg er vist. * Angiver signifikant forskel kontrol (p = 0,0022).

Controls forblev ubehandlet. Den øverste højre kvadrant viser procentdelen af ​​celler i sen apoptose, nederste højre kvadrant procentdelen af ​​celler i tidlig apoptose (én repræsentant fra 3 forsøg, SD

intra-assay 10%).

apoptose

Kortsigtede anvendelse af amygdalin i 24 timer ikke inducere apoptose (data ikke vist). Men andelen af ​​tumorceller undergår tidligt apoptose omtrent fordoblet efter to uger amygdalin eksponering i alle tre cellelinjer: p = 0,0026 (UMUC-3), p = 0,0145 (TCCSUP) og p = 0,0208 (RT112). Derudover en fordobling i slutningen apoptose fandt sted i UMUC-3 cellelinie (fig 2;. P = 0,0230)

Tumor celledeling og klonal cellevækst

spredning i alle tre cellelinjer. blev signifikant nedsat, uanset om amygdalin blev anvendt i 24 timer eller 2 uger (figur 3, til venstre). Efter 2 uger amygdalin udsættelse for subsammenflydende celler, blev klonal vækst vurderes derefter, hvorved amygdalin blev enten tilsat i en efterfølgende periode på 10 dage ( “amygdalin B”) eller ej ( “amygdalin A”). Antallet af RT112 kloner blev betydeligt formindsket ved 10 dage amygdalin eksponering under klonal dannelse, og ingen TCCSUP kloner var synlige (fig. 3, højre). Når amygdalin ikke blev anvendt i klonal dannelse, blev antallet af RT112 og TCCSUP kloner også reduceret, men ikke så stærkt som blev set i “amygdalin B” regime (fig. 3, højre). Den UMUC-3 cellelinie ikke danne kolonier og blev derfor ikke evalueret

Til højre:. Klonogen vækst TCCSUP og RT112 celler (efterfølgende til to uger subkonfluerende kultur med 10 mg /ml amygdalin) uden (kontrol ) og med amygdalin. Amygdalin A = 10 dage amygdalin fri inkubation under klonogene vækst. Amygdalin B = 10 dage klonogene vækst med 10 mg /ml amygdalin. Eksperimenter blev udført tre gange og gentages 5 gange. * Angiver signifikant forskel kontrol (p = 0,0022).

#indicates væsentlig forskel for amygdalin A (p = 0,0022).

cellecyklusprogression

Amygdalin moduleret cellecyklusprogression, afhængigt af tumor cellelinje (fig. 4 ). Kortsigtet amygdalin applikation (24 timer) til UMUC-3 øget antallet af G0 /G1-celler (p = 0,0169) og reduceret antallet af S-fase celler (p = 0,0138). I TCCSUP celler kortvarig behandling øget antallet af G0 /G1-fase celler (p = 0,0121), men reducerede antallet af celler i G2 /M-fasen (p = 0,0406). I RT112 celler kortvarig amygdalin eksponering forårsaget G2 /M-fase-reduktion (p = 0,0039) og en S-fase-stigning (p = 0,0040). To uger amygdalin eksponering sænkede G2 /M-fase (p

UMUC-3 = 0,0036; p

TCCSUP = 0,0080; p

RT112 = 0,0015) og øgede G0 /G1-fasen i al tumorcelle linjer (p

UMUC-3 = 0,0019, p

TCCSUP = 0,0143, p

RT112 = 0,0018). Antallet af S-fase celler var også signifikant formindsket efter to ugers behandling i UMUC-3 (p = 0,0093) og RT112 celler (p = 0,0032) sammenlignet med kontroller.

cellepopulationen udtrykkes som procent af de samlede celler analyseret. Et repræsentativt eksperiment af tre er vist.

Cell cyklus regulerer proteinekspression

Da amygdalin påvirket cellevækst og cellecyklus progression, kan forventes ændringer af cellecyklus kontrollerende proteiner. Ekspressionen af ​​CDK1 og CDK2 (alle cellelinier) og cdk4 (TCCSUP, RT112) blev formindsket 24 timer efter amygdalin ansøgning (fig. 5). P-værdier var som følger for CDK1 (p

UMUC-3 = 0,0029, p

TCCSUP = 0,0052, p

RT112 = 0,0007), for cdk2 (p

UMUC-3 = 0,0001, s

TCCSUP = 0,0006, p

RT112 = 0,0001), for CDK4 (p

TCCSUP = 0,0006, p

RT112 = 0,0001), for cyklin A (p

UMUC-3 = 0,0001, p

TCCSUP = 0,0001, p

RT112 = 0,0002), for cyklin B (p

TCCSUP = 0,001, p

RT112 = 0,0001) og for cyclin D1 (p

UMUC-3 = 0,0001, p

TCCSUP = 0,0001, p

RT112 = 0,0001). P19 blev styrket i UMUC-3 (p = 0,0013) og RT112 (p = 0,0012), men reduceret i TCCSUP (p = 0,0001), mens p27 blev reduceret i alle cellelinjer (p

UMUC-3 = 0,0013, s

TCCSUP = 0,0001, p

RT112 = 0,0001). Pakt samt pRictor (men ikke pRaptor) fra mTOR pathway, blev deaktiveret i alle tre cellelinier. P-værdier var som følger for Pakt (p

UMUC-3 = 0,0002, p

TCCSUP = 0,0004, p

RT112 = 0,0082) og for pRictor (p

UMUC-3 = 0,0015, s

TCCSUP = 0,0017, p

RT112 = 0,0001). pRaptor blev kun reduceret i TCCSUP (p = 0,0024).

Tumorceller blev forbehandlet med amygdalin i 24 timer eller 2 uger (kontroller forblev ubehandlet). p-actin tjente som den interne kontrol. En repræsentant for tre separate forsøg er vist. Højre panel i figur 5 viser pixeltæthed værdierne i procent relateret til kontrollen ikke er behandlet med amygdalin. * Angiver signifikant forskel til kontrollen.

Små forskelle var tydeligt efter 2 uger i modsætning til 24 timer amygdalin eksponering. CDK1 men ikke cdk2 blev nedreguleret i UMUC-3 (p = 0,0001). 24 timer aftagende indflydelse amygdalin på p27-ekspression i UMUC-3 og TCCSUP celler blev tabt efter 2 uger, og pRaptor steg efter 2 uger i TCCSUP celler (p = 0,0019), i modsætning til 24 timer aftagende effekt (fig. 5 ).

Cdk2 /cyclin A knockdown

Da amygdalin stærkt modificeret cdk2 og cyclin A i alle tumorcellelinier og disse proteiner regulerer indtræden i mitotiske cyklus, rolle af disse proteiner i tumorvækst blev evalueret ved siRNA knock-down. Inkubation af UMUC-3, RT112 og TCCSUP celler med siRNA mod cdk2 eller cyclin A tydeligt formindsket proteinindholdet (fig. 6, nederst til højre) og blev ledsaget af en betydelig vækst blokade i alle tre cellelinjer (fig. 6).

UMUC-3, blev TCCSUP og RT112-celler transficeret med cdk2 eller cyclin A siRNA og banke ned blev kontrolleret af western blot (nederst til højre). En repræsentant fra 6 forsøg er vist. * Angiver signifikant forskel kontrol (p = 0,0022).

Diskussion

Beviser præsenteres her viser, at amygdalin undertrykker vækst og proliferation i tre blærekræft cellelinjer. Antallet af tumorceller undergår tidligt apoptose let øget efter langvarig amygdalin eksponering, men ikke efter kortvarig eksponering og denne hæmning af proliferativ aktivitet ikke var forårsaget af en toksisk effekt af amygdalin. Andre forskere har også vist tegn på apoptotosis induceret af amygdalin. Hurtig aktivering af caspase-3 sammen med nedregulering af Bcl-2 og opregulering af Bax i nærvær af 0,1 mg /ml amygdalin er blevet demonstreret i DU145 og LNCaP prostatacancerceller [9]. Apoptotisk celledød er også blevet fremkaldt af amygdalin i den cervikale cancercellelinie HeLa [10] og i human promyelocytisk leukæmi (HL-60) celler [11]. Tilsammen disse rapporter viser, at amygdalin kan tegne sig for apoptotiske begivenheder i forskellige cancerceller, herunder fra blæren, og bidrage til reduceret tumorvækst.

Amygdalin stærkt ændret cellecyklusprogression i alle tre blære kræft cellelinjer. Under kortvarig behandling, UMUC-3 og TCCSUP akkumuleret i G0 /G1, mens RT112 blev arresteret i S-fasen. Mitose er derfor påvirket på en anden måde i forskellige cellelinier ved amygdalin. En anden forskel var, at P19 steg i RT112 men faldt i TCCSUP. Rictor blev deaktiveret og CDK4 blev undertrykt i RT112 men ikke i UMUC-3. Cdk4 inhibering og p19 stigning er for nylig blevet påvist at drive tumorceller i S-fasen [12]. Da både Cdk4 hæmning og p19 i kombination, forekom kun i RT112 celler, kan dette forklare, hvorfor RT112 akkumuleret i S-fasen, snarere end i G0 /G1-fasen. Faktisk blev CDK4 ikke reduceret efter 2 uger amygdalin ansøgning, og RT112 celler blev derefter anholdt ved G0 /G1. Ikke desto mindre er S-fase post ikke udelukkende kontrolleret af cdk4 og p19. Tværtimod er en kohorte af cellecyklusproteiner involveret i at drive celledeling fremad. Amygdalin synes derfor at blande sig i en cellelinie afhængig måde med flere kontrolpunkt molekyler, forstyrre finjusteret mitotisk maskiner. Vækst blokade er det endelige resultat.

Relevansen af ​​P19 og P27 i blærekræft progression er ikke fuldt belyst. Begge proteiner blev kraftigt ændret efter amygdalin ansøgning i denne undersøgelse, p27 bliver nedreguleret i alle cellelinjer, p19 bliver opreguleret i UMUC-3 og RT112 men formindsket i TCCSUP. Semi-kvantitativ RT-PCR på en serie af 32 blærekræft prøver parret med tilstødende normale væv har ikke vist nogen signifikante forskelle i P19 og P27 udtryk [13]. På den anden side, prospektiv evaluering af high-grade blærecancerpatienter behandlet med radikal cystektomi demonstreret mere p27 positive end negative tumorer hos patienter med recidiv [14]. Microarray analyse har vist en positiv sammenhæng mellem p27-ekspression og avanceret blærekræft [15]. I modsætning hertil har en anden undersøgelse rapporteret en ugunstig effekt af p27 tab forbundet med blære karcinom [16]. In vitro eksperimenter har peget på et ubestemt rolle p27 i så meget som undertrykkelse af dette protein forhøjet vækst, men samtidig reduceres invasion [17] – [19]. Baseret på dette, er det ikke muligt at endelig vurdere, om p27 reduktion efter amygdalin ansøgning er knyttet til proliferation, til invasion eller til begge. For at få indsigt i invasionen proces har en ny undersøgelse er indledt koncentrere sig om virkningen af ​​amygdalin på kræftcelle sprede sig.

Amygdalin reduceret phosphorylering af Akt og af mTOR underenheden, Rictor. Akt-mTOR signalering spiller en stor rolle i blæren carcinogenese, med Akt aktivering forekommer over hele spektret af blære urotelial carcinomer [20]. Den Cancer Genome Atlas-projektet har identificeret AKT /mTOR pathway som en kritisk terapeutisk mål i blærekræft [21]. Den specifikke virkning af amygdalin på mTOR kompleks Rictor er af interesse, da de godkendte mTOR-hæmmere, everolimus og temsirolimus, målrette mTOR kompleks raptor, mens Rictor anses ufølsomme over for begge lægemidler [22]. Rictor har vist sig at være en vigtig determinant i migration blærecancer og invasion [23]. Således kan amygdalin ikke kun være et innovativt redskab til at neutralisere metastatisk spredning, men også til at supplere mTOR-inhibitor baserede regimer.

Cdk’er, sammen med cycliner, er centrale molekyler, der er ansvarlige for cellecyklusprogression og celledeling, hvorved særligt cdk’er er tilknyttet bestemte cycliner. Derfor har afvigende vækst kræftcelle blevet tilskrevet graduering i CDK-cyclin udtryk niveau. De stærkeste protein ændringer efter 24 timer amygdalin inkubation blev observeret for cdk2 og cyclin A, og kan repræsentere store mål for amygdalin. Selvom ingen efterforskere til dato har avancerede denne hypotese, er amygdalin vist sig at ændre gener involveret i cellecyklus regulering af menneskelige kolon kræftceller [24]. Den cdk2-cyclin A aksen fremmer G1 /S faseovergang, der kan forklare, hvorfor cdk2 /cyclin A ned-modulation af amygdalin blev ledsaget af en G0 /G1 fasen anholdelse i UMUC-3 og TCCSUP celler. In vitro undersøgelser af bløddelssarkom celler har vist, at cdk2 fald kombineret med p27 tab påvirker cellulære invasion programmet [25]. Da reduktion cdk2 blev modsvaret af en p27 fald i blærekræft model, forekommer det sandsynligt, at amygdalin ikke kun virker på tumorvækst, men kunne også påvirke metastatisk spredning.

Selv om cdk2-cyclin A ændres i mange solide tumorer, oplysninger om cdk2-cyclin A i blærekræft er sparsom. Protein og mRNA analyser af blære karcinom væv har indikeret, at cdk2 er tæt forbundet med blære tumor udvikling og fremskridt [26]. Cdk2 s bindingspartner, cyklin A, er blevet korreleret med tumorklassificering og dårlig sygdomsspecifik overlevelse, dokumenteret ved immunhistokemi og cDNA-mikroarrays [27]. I den nuværende eksperimenter, vælte cdk2 eller cyclin A førte til en betydelig reduktion af tumor celle nummer, der angiver den kliniske relevans af de to proteiner til blærekræft. Eftersom cdk’er og cycliner forstærkes, når lægemiddelresistens udvikles [28], [29], modvirke denne proces kan være en potent strategi til forebyggelse eller overvinde resistens [29]. I de sidste år har flere nye terapeutiske strategier er designet til at målrette cdk’er. I øjeblikket er de i forskellige stadier af klinisk udvikling, som både enkelte midler og i kombination [30]. Amygdalin kunne være en “naturlig” alternativ, hvorved alvorlige bivirkninger forbundet med konventionelle CDK-inhibitorer kan undgås [31].

Små forskelle mellem kortsigtet og langsigtet amygdalin ansøgning blev observeret, især i den UMUC-3 cellelinie. Cdk2 blev ikke længere formindsket efter 2 uger, men CDK1 blev kraftigere reduceret end efter 24 timer amygdalin ansøgning. Årsagen til denne kontakt over efter langtidsanvendelse er ikke klart. Cdk2 akkumuleres ved G1 /S fase grænse, mens CDK1 drev celler i mitose [32]. De forskellige mekanismer CDK1 og cdk2 er blevet reflekteret af cellecyklus assay demonstrerer yderligere anholdelse af UMUC-3 i G2 /M efter 2 uger amygdalin eksponering. Siden UMUC-3 vækst og proliferation tilsvarende blev ændret i 24 timer og 2 uger amygdalin ansøgning, kan cdk2 blevet ufølsomme over for amygdalin undertrykkelse, men dette blev opvejet af en undertrykkelse af CDK1. Faktisk har CDK1 blevet rapporteret at kompensere for cdk2 ved at omdirigere CDK1 i cyclin A pathway, som er normalt begrænset til cdk2 [33].

Dette er den første undersøgelse med information om amygdalin indflydelse på blærekræft celle linier in vitro. Sådanne in vitro-undersøgelser kan ikke gøre mere end at fremsætte en forudsigelse af amygdalin s effekt hos patienter. Kliniske forsøg med amygdalin er ikke blevet veldokumenteret og randomiserede kontrollerede studier er aldrig blevet gennemført. En retrospektiv analyse af 67 tumor patienter, som havde taget amygdalin rapporteret to komplette og 4 partielle responser [34]. En fase II-forsøg blev gennemført i 1982, hvorved patienterne fik også vitaminer og pancreas enzymer. Terapi blev stoppet, når blodet cyanid niveauer steget, og det blev konkluderet, at Laetrile ikke var en effektiv kræftbehandling [35]. Andre rapporter tyder amygdalin at være en klar fordel hos cancerpatienter [8]. Imidlertid blev udtrykket “fordel” ikke klart angivet. Ambivalens er også blevet afspejlet i case-rapporter, hvor amygdalin var ineffektive i fem og effektivt i fire tilfælde [8].

Det er stadig ikke klart, om amygdalin også kan virke på normale, fysiologisk intakte epitelceller. Da primære ikke-immortaliserede epitelceller ikke viser mitotisk aktivitet eller hurtigt miste mitotisk aktivitet in vitro, kan disse celler ikke underkastes MTT vækst assay. Men amygdalin er for nylig blevet påvist, at blokere væksten af ​​endotelceller [36]. Hvorvidt dette fænomen kan overføres til andre celler forbliver åben. Ikke desto mindre, blokering af endotelcellevækst ved amygdalin indikerer, at amygdalin kan undertrykke tumor-induceret angiogenese.

Risikoen for at udvikle cyanidforgiftning er heller ikke blevet løst. I denne henseende administrationsvej (oral eller intravenøs), vil mængden og kvaliteten sikkert påvirke risk-benefit-forholdet. Da kliniske rapporter om amygdalin behandling er mere end 30 år [8], og i denne periode forståelsen af ​​molekylære mekanismer kræft i høj grad har udviklet sig, det ville være umagen værd at afprøve in vitro formodninger præsenteres her i en vivo model. Veltilrettelagt, kontrollerede kliniske forsøg til kritisk test amygdalin bør derefter overvejes.

Generelt amygdalin er blevet vist at blokere væksten af ​​blærekræft celler in vitro. Undertrykkelse af cdk2 og cyclin A kan være en relevant mekanisme der definerer, hvordan amygdalin kan arrestere eller formindske tumor spredning.

Tak

Vi vil gerne takke Karen Nelson for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af “Brigitta und Norbert Muth Stiftung” og “Freunde und Förderer der Goethe-Universität Frankfurt”.