PLoS ONE: miR-30b, nedreguleret i gastrisk kræft, Fremmer Apoptose og undertrykker tumorvækst ved Målretning plasminogenaktivatorinhibitor-1

Abstrakt

Baggrund

mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme på verdensplan. Emerging beviser har vist, at microRNA (miRNA) er forbundet med tumor udvikling og progression. Vores tidligere undersøgelser har vist, at

H. pylori

infektion var i stand til at inducere ændret ekspression af MIR-30b i gastriske epitelceller. Men lidt om den potentielle rolle for miR-30b i mavekræft.

Metoder

Vi analyserede udtryk for miR-30b i gastrisk cancer cellelinjer og humane mavekræft væv. Vi undersøgte virkningen af ​​MIR-30b efterligner på apoptose af gastriske cancerceller in vitro ved flowcytometri (FCM) og caspase-3/7 Aktivitetsmenutast assays. Nøgne mus xenograft model blev anvendt til at bestemme, om MIR-30b er involveret i tumorigenese af gastrisk cancer. Målet for miR-30b blev identificeret af bioinformatik analyse, luciferaseanalyse og Western blot. Endelig har vi foretaget korrelationsanalysen mellem miR-30b og dets mål udtryk i mavekræft.

Resultater

MIR-30b var signifikant nedreguleret i gastriske kræftceller og humane mavekræft væv. Tvungen ekspression af MIR-30b fremmet apoptose af gastriske cancerceller in vitro, og MIR-30b kunne signifikant inhibere tumorigenicitet af gastrisk cancer ved at øge apoptose andel af cancerceller in vivo. Desuden blev plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1) identificeret som potentielle mål for MIR-30b, og MIR-30b-niveauet blev omvendt korreleret med PAI-1 ekspression i gastrisk cancer. Desuden inaktivering af PAI-1 var i stand til at phenocopy virkningen af ​​MIR-30b overekspression på apoptose regulering af cancerceller, og overekspression af PAI-1 kunne undertrykte virkning at fremme celle apoptose med MIR-30b, hvilket indikerer PAI-1 er potentielt involveret i mIR-30b-induceret apoptose på cancerceller.

Konklusion

mIR-30b kan fungere som en hidtil ukendt tumorsuppressorgen i gastrisk cancer ved at målrette PAI-1 og regulere apoptose af cancerceller. miR-30b kunne tjene som en potentiel biomarkør og terapeutisk target mod mavekræft

Henvisning:. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) miR-30b, nedreguleret i gastrisk kræft, Fremmer Apoptose og undertrykker tumorvækst ved Målretning plasminogenaktivatorinhibitor-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10,1371 /journal.pone.0106049

Redaktør: Gerolama Condorelli, Federico II Universitetet i Napoli, Italien, Italien

Modtaget: May 7, 2014 Accepteret: 28 juli 2014; Udgivet: 29 August, 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.202.310), videnskabelig innovation Research Foundation of Third Military Medical University (nr 2009XQN20). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft forårsager omkring 738 tusind dødsfald på verdensplan om året, og det er blevet anerkendt som den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald hos mænd [1]. Tidlig diagnose og behandling har ført til gode forventninger til langsigtet overlevelse og god prognose, mens udsigterne for patienter med fremskreden mavekræft forbliver fattige. Ligesom andre kræftformer, er udviklingen af ​​gastrisk cancer menes at være multifaktoriel.

Helicobacter pylori (H. Pylori)

infektion er blevet anerkendt for at være en vigtig udløsende faktor for mavekræft [2]. Selv om der er rapporteret mange genetiske og epigenetiske ændringer i mavekræft, den molekylære mekanisme ligger til grund for udviklingen af ​​mavekræft er fortsat uklart.

mikroRNA (miRNA) er små ikke-kodende RNA, der posttranscriptionally regulerer genekspression. Modne miRNA specifikt kan binde til 3’UTR’er af target cellulært mRNA efter tur udløser mRNA nedbrydning eller inhibering af translation [3], [4]. miRNA fungere som nøgleregulatorer i en lang række biologiske processer, herunder udvikling, celledifferentiering, apoptose, metabolisme og signaltransduktion [5], [6]. Det er blevet påvist, at 50% af miRNA ofte placeret ved cancerassocierede genomiske regioner eller i skrøbelige sites [7]. Voksende beviser har vist, at afvigende miRNA ekspression korrelerer med forskellige humane cancere og indikerer, at miRNA kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [8] – [10]. For nylig, et stort antal deregulerede miRNA herunder MIR-106b-25 klynge, MIR-21, MIR-218, MIR-7, og MIR-335 er blevet identificeret som modulatorer af cellevækst, apoptose, migration, eller invasion i gastrisk cancer udvikling [11] – [15]. Disse fund tyder de miRNA kan spille en afgørende rolle i patogenesen af ​​gastrisk cancer.

Vores tidligere undersøgelser har vist, at

H. pylori

infektion var i stand til at fremkalde den ændrede udtryk for miRNA i gastriske epitelceller herunder miR-155, miR-146a og miR-30b, kan miRNA fungere som nye negative regulatorer at finjustere

H. pylori

induceret inflammation [16], [17]. Desuden har vi demonstreret, at MIR-146a kan spille potentielle rolle i udviklingen af ​​gastrisk cancer ved at modulere proliferation og apoptose af gastriske cancerceller [18]. Især fandt vi også miR-30b kunne regulere autophagy proces under

H. pylori

fortsætter infektion og dermed bidrage til den fortsatte eksistens af

H. pylori

infektioner [19]. Imidlertid rolle MIR-30b i mavekræft er stadig ukendte.

plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1) er det vigtigste serinproteaseinhibitor af vævstype (t-PA) og urokinase-type ( u-PA) plasminogenaktivator og derfor spiller en vigtig rolle i plasminogen-plasmin-systemet [20]. Tidligere undersøgelser har vist PAI-1 er en dårlig prognostisk faktor i flere almindelige tumorer, og er associeret med cancer invasion og metastase [21]. For nylig, også mange grupper har fundet, at PAI-1 kan fremme tumorvækst ved inhibering af celle apoptose. For eksempel tilsætning af en stabil vildtype PAI-1 til den humane prostatacancer-cellelinie PC-3, den humane promyelocyt leukæmi-cellelinje HL-60 og selv ikke-tumorale celler, resulterede i en signifikant inhibering af apoptose [22] . Når de injiceres subkutant i nøgne mus med PAI-1 overekspression murine fibrosarcomceller, blev tumorerne hurtigt etableret, mens PAI-1-deficiente celler havde en undertrykt tumorgenicitet [23]. En anden rapport viste, genetiske og farmakologiske inhibering af PAI-1 i humane tumorcellelinjer (HT-1080, A549, HCT-116 og MDA-MB-231) øget spontan apoptose, og interessant nok implanteret PAI-1 knockdown HT 1080 celler til PAI-1 knockout mus resulterede i lavere tumorigenese og forlænget overlevelse sammenlignet med kontrol mus [24]. Disse undersøgelser giver vigtige beviser for, at PAI-1 udøver en beskyttende rolle mod tumorceller apoptose.

I aktuelle undersøgelse fandt vi, at miR-30b var signifikant nedreguleret i gastriske cancerceller og tumorvæv. Ektopisk ekspression af MIR-30b kan fremme apoptose af gastrisk cancer celle in vitro, og MIR-30b kunne signifikant inhibere tumorigenicitet af gastriske cancere i nøgne mus xenograftmodel. Desuden blev PAI-1 identificeret som potentielle mål for MIR-30b, og MIR-30b kan inducere apoptose og undertrykke tumorvækst ved at undertrykke ekspressionen af ​​PAI-1. Vores resultater antyder, at MIR-30b kan fungere som en hidtil ukendt tumorsuppressorgen i gastrisk cancer og kan være en potentiel terapi mål for mavekræft.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal etiske og Eksperimentel Komité tredje Military Medical University. Alle dyr operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Undersøgelsen involverer vævsprøver blev godkendt af den etiske Review Board på Third Military Medical University, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter før deltagelse.

Vævsprøver

I alt, gastrisk kræft væv og tilstødende ikke-tumorvæv blev opnået fra patienter med primær gastrisk cancer undergår radikal gastrektomi på Southwest Hospital, tredje Military Medical University, Kina, og de clinicopathologic karakteristika mavecancerpatienter er opsummeret i tabel 1. Efter kirurgisk fjernelse blev vævene fryses straks i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske gennemgang bord på Third Military Medical University, og informeret samtykke blev opnået fra alle patienter før deltagelse.

cellelinjer og cellekultur

Alle cellelinier anvendt i denne undersøgelse blev opnået fra Shanghai Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), de humane gastriske cancercellelinier AGS blev dyrket i Hams F12 (Hyclone) medium med 10% føtalt bovint serum (FBS), andre gastrisk cancer cellelinier MKN45, HGC-27, BGC-823, SGC-7901 og human embryonisk nyre (HEK) 293-celler blev dyrket i DMEM (Hyclone) med 10% FBS, blev de alle holdt i en befugtet inkubator indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C som tidligere beskrevet.

Kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med Trizol-reagens (Invitrogen), efterfulgt af en revers transkription under anvendelse af TaqMan miRNA assays (Ambion), med U6 lille nukleare RNA som en intern normaliseret reference. QRT-PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af følgende parametre: 95 ° C i 2 min efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 s. QRT-PCR-analyser for mRNA’et af PAI-1 blev udført ved anvendelse PrimeScript RT-PCR kit (Takara), som de følgende parametre: 95 ° C i 30 s efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 5 s og 72 ° C i 30 s. MRNA-niveauet af β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Sekvenserne af anvendte primere er vist i tabel 2.

Northern blot

små RNA’er blev isoleret ved anvendelse af Mirvana RNA Isolation Kit (Ambion). Tre par kliniske prøver blev tilfældigt udvalgt fra de 21 patienter til efterfølgende Northern blot-analyse. Northern blot blev udført ifølge standarden procedure som descried tidligere [17]. De DNA oligonukleotid antisense-prober anvendes til påvisning af MIR-30b og U6 snRNA var som følger: MIR-30b (5’AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ‘) og U6 (5′-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3’)

Cell transfektion. Salg

mIR-30b efterligner, krypteret miR-kontrol, kemisk modificeret miR-30b duplex (agomir), kemisk modificeret scrambled miR-kontrol, PAI-1 siRNA, eller siRNA negative kontrol blev købt fra GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., Kina). PAI-1 (Serpine1) humant cDNA ORF klon blev købt fra Origene (Origene Technologies, Beijing, Kina). Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokol.

Cell apoptose assayet ved FCM

SGC-7901 eller HGC-27-celler blev podet i 12-brønds plade ved en egnet densitet og dyrket til 30% sammenflydning efter 24 timer. Derefter celler blev transficeret med MIR-30b efterligner eller MIR-kontrol, og mediet blev erstattet med serumfrit DMEM i 48 timer. For co-transfektion eksperiment med miR-30b og PAI-1 udtrykker vektor, blev SGC-7901-celler transficeret med miR-kontrol eller miR-30b efterligner, og derefter med PAI-1 Den menneskelige cDNA ORF klon vektor (indikeret som PAI-1) eller tom vektor 24 timer senere. 24 timer efter transfektion vektor blev mediet erstattet med serumfrit DMEM i yderligere 24 timer. Endelig blev cellerne påført apoptose analyse. For FCM-analyse, en Annexin V-FITC Apoptose Detektion Kit I (BD Pharmingen) blev anvendt, derefter analyseret ved flowcytometri (BD FACSCantoTM II).

Caspase-Glo 3/7 Assay

aktiviteten af ​​caspase-3/7 blev påvist under anvendelse af caspase-Glo 3/7 assay (Promega). Tilsæt 100 pi caspase-Glo 3/7 reagens til 96-brønds plade hvid-walled, bland forsigtigt indholdet i brøndene, og derefter inkubere brøndene ved stuetemperatur i 30 min. Luminescensen blev påvist under anvendelse af GloMax-96 Microplate Luminometer (Promega).

tumorigenicitet assays i nøgne mus Salg

Musene anvendt i dette eksperiment blev opretholdt under specifikke patogenfrie betingelser. Levedygtig MIR-30b mimics- og MIR-kontrol-transficerede SGC-7901 celler (1 x 10

6) blev suspenderet i 100 pi PBS og derefter injiceret subkutant i hver side af den bageste flanke af samme BALB /c athymiske nøgen mus på 4 til 6 uger gamle, som tidligere [25] beskrevne. Tumorvækst og tilstanden herunder den generelle sundhed og musenes adfærd blev undersøgt hver tredje dag i 4 uger. Tumor beared mus viste ikke tegn på smerte eller angst såsom vægttab eller adfærdsændringer, så alle mus blev aflivet ved CO

2-kvælning på dag 28 efter injektion. Tumorvolumen (V) blev overvåget ved måling af længden (L) og bredde (W) med passere og beregnet med formlen (L × B

2) × 0,5.

TUNEL-farvning

tumorerne blev høstet efter 26 dage, og fikseret i 10% formaldehyd-opløsning og derefter indlejret i paraffin. Sektioner (5 um tykke), der var blevet deparaffinerede og rehydrerede blev farvet med hematoxylin og eosin. Apoptotiske tumorceller blev farvet ved in situ terminal deoxynucleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) fremgangsmåde under anvendelse af en in situ-påvisning celledød kit (POD; Roche Diagnostics Co.). Negativ kontrol blev underkastet den samme farvning for TUNEL uden TdT. Billeder blev indsamlet ved hjælp af mikroskop med × 200 forstørrelse.

Konstruktion af plasmider

Opførelsen af ​​forskellige luciferase rapport vektorer for miR-30b mål blev udført som tidligere beskrevet [16], [26] , og konstruktet indeholdende mutant frø region blev genereret som kontrol. Sekvenserne af oligonukleotider anvendt er vist i tabel 2. Salg

Luciferase assay og GFP undertrykkelse eksperimenter

HEK-293-celler blev podet i 96-brønds plade ved 5000 celler per brønd dagen før transfektion. Cellerne blev transficeret med hver ildflueluciferase reporter vektor, Renilla luciferase styrevektor, pRL-TK (Promega), og MIR-30b efterligner eller MIR-kontrol (GenePharma). Luciferase-assayet blev udført ved anvendelse af den dobbelte luciferase reporter assaysystem (Promega).

I GFP undertrykkelse eksperimenter blev HEK-293-celler podet i 12-brønds plade ved 1 x 10

5 pr godt dagen før transfektion og derefter blev cotransficeret med miR-30b efterligner eller miR-kontrol med forskellige GFP reporter vektorer. Cellerne blev udsat for flowcytometrianalyse, og data blev analyseret ved anvendelse af CellQuest Pro software.

Western blot-

Behandlede celler var vasket med iskoldt PBS og derefter lyseret ved en celle lysis buffer (Gennembore). Efter centrifugering ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C blev proteinkoncentrationen målt ved BCA-proteinassay-kit (Pierce). Celle proteinlysater blev adskilt i 12% SDS denatureret polyacrylamidgel og derefter overført til en polyvinylidendifluoridmembran. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i Tris-saltvand, pH 7,4, indeholdende 0,05% Tween 20, og blev inkuberet med primære antistoffer for PAI-1 (1:1000, Abcam) og β-actin (1:1000 , Santa Cruz) ved 4 ° C henholdsvis natten over. Membraner blev vasket og inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (1:5000, Santa Cruz) ifølge producentens anvisninger. Proteinet af interesse blev visualiseret ved hjælp af ECL Western blotting substrat (Pierce) og Chemidoc XRS Gel Documentation System (BioRad).

Statistisk analyse

Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) fra mindst tre uafhængige forsøg. Students t-test blev anvendt til at analysere forskellene mellem grupperne. Forholdet mellem MIR-30b niveau og PAI-1expression blev analyseret ved anvendelse Pearsons korrelation. Statistisk analyse blev udført med SPSS-software (version 17). Statistiske forskelle blev erklæret signifikant på

P

0,05 niveau. Statistisk signifikante data er angivet med asterisk (

P

0,05 (*),

P

. 0,01 (**)

Resultater

Nedsat miR-30b udtryk i humane gastrisk cancer cellelinjer og GC vævsprøver

for at fastlægge den rolle, miR-30b i patogenesen af ​​mavekræft, vi analyserede miR-30b-niveauer i forskellige gastriske kræftceller, herunder HGC-27, AGS, BGC-823 og SGC-7901. Som vist i figur 1A, ekspressionen af ​​mIR-30b var signifikant nedreguleret i fire cellelinjer sammenlignet med en pulje af fem ikke-tumor gastriske væv (

P

. 0,01)

(A) Sammenligning af ekspressionsniveauet for miR-30b mellem normale maveslimhinden vævsprøver og gastrisk cancer cellelinjer HGC-27, SGC-7901, BGC-823 og AGS . **

P

. . 0,01, sammenlignet med normale væv (B) Relativ udtryk for miR-30b i 21 mavekræft væv sammenlignet med matchede tilstødende ikke-tumor gastriske væv (C) sammenligning af den gennemsnitlige ekspression af mIR-30b i to grupper af B. data repræsenterer middelværdier ± SD **

P

0,01, sammenlignet med den normale maveslimhinden. (D) Analyse af MIR-30b-ekspression ved hjælp af Northern blotting. Totalt RNA blev ekstraheret fra tre parret gastrisk cancer (T) og tilstødende ikke-kræft gastriske væv (N), som var tilfældigt udvalgt fra alle patienter. RNA’er blev hybridiseret sekventielt med miR-30b og U6 probe og U6 blev anvendt som en kontrol for RNA belastning.

Ekspressionen af ​​MIR-30b blev undersøgt yderligere i 21 parrede GC og tilstødende ikke-tumor gastriske væv gennem TaqMan kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR). Som det fremgår af figur 1B, blev nedgangen i miR-30b fundet i 18 ud af 21 patienter (85,7%) sammenlignet med de tilsvarende ikke-tumorvæv. Desuden viste scatter diagram, at miR-30b var signifikant nedreguleret i gastriske prøver kræft versus normal maveslimhinden, med en gennemsnitlig 6,28 gange fald (

P

= 0,002) (figur 1C). For at validere udtrykket data indhentet fra QRT-PCR, 3 i alle 21 par prøver var valgt tilfældigt at bestemme niveauet af miR-30b hjælp nordlige bolt. Vi fandt også konsekvent reduceret ekspression af MIR-30b i gastrisk cancer sammenlignet med ikke-tumor gastriske væv (figur 1D). Disse resultater antyder, at MIR-30b-ekspression er ofte nedreguleret i gastrisk cancer og måske involveret i udviklingen af ​​mavekræft.

Overekspression af MIR-30b forøger apoptose af gastriske cancerceller

En af kendetegnende for kræft er dens evne til at unddrage apoptose [27], så vi undersøgte virkningen af ​​mIR-30b på gastrisk cancerceller apoptose. SGC-7901 eller HGC-27 celler blev transficeret med miR-30b efterligner eller krypteret miR-kontrol, og gyldigheden af ​​miR-30b ektopisk ekspression blev bekræftet ved QRT-PCR (figur 2A). Så effekten af ​​MIR-30b på apoptose af SGC-7901 eller HGC-27-celler blev vurderet med flowcytometri (FCM) analyse og caspase-3/7 Aktivitetsmenutast assays. Som vist i figur 2B og 2C, fandt vi andelen af ​​apoptotiske celler blev øget betydeligt i SGC-7901 eller HGC-27 celler transficeret med miR-30b efterligner sammenlignet med MIR-kontrol-transficerede celler (16,08%

versus

8,25% til SGC-7901 celler, og 17,83%

versus

10,87% til HGC-27 celler). Endvidere blev signifikant stigning i caspase-3/7 aktivitet findes i SGC-7901 eller HGC-27 celler transficeret med miR-30b sammenlignet med miR-kontroltransfektanter (

P

0,01, figur 2D). Ovenfor resultater viser, at overekspression af miR-30b kan fremme apoptose af mavekræft in vitro.

(A) Relativ udtryk for miR-30b i AGS, HGC-27, og SGC-7901-celler transficeret med miR- 30b efterligner eller miR-kontrol i 48 timer. Data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse. fra tre uafhængige forsøg, ***

P

0,001. (B) Virkningen af ​​miR-30b på apoptose blev undersøgt af FCM-analyse. SGC-7901 eller HGC-27 celler blev transficeret med MIR-30b efterligner eller MIR-kontrol, og derefter blev mediet udskiftet med serumfrit DMEM i 48 timer blev cellerne analyseret for apoptotisk sats efter farvning med Annexin V-FITC og PI . Data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse. fra fire uafhængige forsøg, **

P

0,01. vises (C) En repræsentant FCM-analyse i B. (D) SGC-7901 eller HGC-27 celler blev transficeret med miR-30b efterligner eller miR-kontrol i 48 timer. Aktiviteten af ​​caspase-3 og caspase-7 blev påvist under anvendelse af Caspase-Glo 3/7 Assay. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse af 6 gentagelser fra fire uafhængige forsøg, **

P

. 0,01

miR-30b undertrykker tumorigenicitet og fremmer celle apoptose in vivo

For yderligere at bestemme hvorvidt mIR-30b er involveret i tumorigenese af gastrisk cancer, blev nøgne mus xenograftmodel anvendes. Fordi vi fandt, at miR-30b spillet en større rolle i at fremme SGC-7901 celler apoptose end HGC-27 celler in vitro, vi udforske den rolle, miR-30b i tumorigenese af mavekræft hjælp SGC-7901 celler. MIR-kontrol- og MIR-30b-transficeret SGC-7901-celler blev injiceret subkutant i enten bageste flanke af de samme nøgne mus. Musene blev fulgt i observation af xenograft vækst i 4 uger. Det konstateredes, at indførelsen af ​​MIR-30b i SGC-7901 celler førte til en signifikant reduktion i størrelsen af ​​tumorvolumen (figur 3A og 3B), og tumorer afledt af MIR-30b behandlet SGC-7901 celler voksede langsommere sammenlignet med kontrollen gruppe under hele tumorvækst periode (figur 3C, venstre panel). Når tumorer blev høstet, den gennemsnitlige mængde af tumorer afledt af miR-30b efterligner gruppe var kun 27,87% af det i miR-kontrolgruppen (figur 3C, højre panel,

P

0,01). Tumorerne blev høstet efter 26 dage fra to sider af den bageste flanke af samme mus, blev apoptose in situ målt ved TUNEL. Som vist i figur 3D, tumorsnit fra MIR-30b efterligner behandlede xenotransplantater udviser signifikant stigning i TUNEL-positive celler. Disse resultater kraftigt antydet, at indførelsen af ​​MIR-30b kunne hæmme gastrisk cancer vækst ved at fremme apoptose af cancerceller.

(A) Effekt ofmiR-30b på tumordannelse in vivo xenograft mode. MIR-kontrol- og MIR-30b-transficerede SGC-7901 (1 × 10

6) blev suspenderet i 100 pi PBS og derefter injiceret subkutant i hver side af den bageste flanke af samme BALB /c athymiske nøgne mus. To repræsentative tumorbærende mus efter 4 uger inokulation blev vist. (B) De betydelige forskelle i tumor volumen mellem miR-kontrolgruppe og miR-30b gruppe fra 6 mus. (C) Den tumorvolumen blev målt hver tredje dag efter injektion af SGC-7901 celler med behandling som beskrevet i A, og kurve tumorvæksten blev vist. Forskellen på tumorstørrelse mellem miR-kontrolgruppe og miR-30b gruppen var statistisk signifikant, ** P 0,01. (D) Tumorerne blev høstet efter 26 dage fra to sider af den bageste flanke af samme mus, blev apoptose in situ målt ved TUNEL. Alle data ovenfor, er repræsentative mindst tre uafhængige forsøg.

PAI-1 er en kandidat target gen af ​​miR-30b

For yderligere at vurdere funktionen af ​​miR-30b, er det vigtigt at afgøre, hvilken vært mRNA bliver reguleret af miR-30b. I vores tidligere undersøgelse undersøgte vi mRNA udtryk profil i fem par primære tumorvæv af gastrisk kræftpatienter og matches ikke-tumorvæv ved hjælp microarray. Helt, fandt vi 303 opreguleres gener (fold forandring 2,

P

0,05) i gastrisk cancer væv sammenlignet med ikke-tumorvæv (data ikke vist). I betragtning af den nedreguleret ekspressionen af ​​miR-30b i mavekræft, vi fokuserede på listen over gener, der viser en øget udtryk og udvalgt de 30 bedste øgede gener i mavekræft, bestemmes derefter, hvis disse gener var potentielle mål for miR-30b ved hjælp af forudsigelse algoritme , Targetscan. Interessant fandt vi, at PAI-1-genet, som blev opreguleret i microarray (3,83 fold,

P

= 0,04) kan være en sandsynlig målgen af ​​MIR-30b (figur 4A). Til direkte adresse, om MIR-30b binder til 3′-UTR af mål mRNA’er konstruerede vi luciferase rapport vektorer, som indeholder det formodede MIR-30b bindingssites inden 3′-UTR. Som vist i figur 4B, observerede vi en markant reduktion i luciferaseaktivitet (

P

0,01) efter contransfection af luciferase rapport vektorer og MIR-30b efterligner. I modsætning hertil blev der ingen ændring af luciferase observeret i celler transficeret med mutant 3′-UTR-konstruktioner. Dette resultat blev efterfølgende bekræftet af GFP undertrykkelse eksperimenter. Som vist i figur 4C og 4D, blev GFP-fluorescens signifikant reduceret i celler transficeret med GFP rapport vektorer indeholdende bindingssteder og MIR-30b efterligner, hvorimod der ikke var nogen ændring i GFP-fluorescens i celler transficeret med mutant vektor og MIR-30b efterligner. Endvidere overekspression af MIR-30b i AGS og HGC-27-celler resulterede i nedregulering af protein niveauer af PAI-1 (figur 4E). Taget sammen ovennævnte data tyder på, at PAI-1 er et potentielt mål for MIR-30b, og MIR-30b kan nedregulere målproteinet. Salg

(A) Sekvensalignment af MIR-30b og dens målsteder i 3′-UTR’er af PAI-1. (B) HEK293 celler blev forbigående cotransficeret med luciferase rapport vektorer, og enten miR-30b efterligner eller miR-kontrol. Luciferaseaktiviteter blev normaliseret til aktiviteten af ​​Renilla luciferase. (C og D) HEK-293-celler blev transficeret med GFP rapport vektor eller mutant vektor, og enten MIR-30b efterligner eller MIR-kontrol. GFP-fluorescens blev overvåget ved fluorescens mikroskop og FCM-analyse. (E) Western blotting-analyse for PAI-1 i AGS og HGC-27 celler transficeret med miR-30b efterligner eller miR-kontrol. Alle data ovenfor, er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg, **

P

. 0,01

Inverter korrelation mellem mir-30b og PAI-1-ekspression i gastrisk kræft væv og cancercellelinier

i betragtning af at mIR-30b er nedreguleret i gastrisk cancer, og det er blevet rapporteret, at PAI-1-protein i gastrisk cancer væv er markant højere end i de ikke-tumor-væv [28], udførte vi korrelationsanalysen mellem mIR-30b og PAI-1 ekspression i gastrisk cancer-cellelinjer og gastrisk cancer væv. Som vist i figur 5A top, PAI-1 proteinniveau var det laveste i AGS celle blandt de fem gastriske cellelinier. I modsætning hertil MIR-30b plan var den højeste i AGS, sammenlignet med andre cellelinier (figur 5A bund). Efterfølgende undersøgte vi PAI-1 og MIR-30b-ekspression i 21 sæt af mavekræft og tilstødende ikke-tumorvæv. Vi fandt, at 81% (17/21) af gastriske cancere vises højere PAI-1-mRNA sammenlignet med normale væv. I modsætning hertil miR-30b blev almindeligt nedreguleret i 18 ud af 21 tumorer. Brug Pearsons korrelationsanalyse, observerede vi en signifikant omvendt korrelation mellem miR-30b og PAI-1 mRNA (figur 5B,

R

= -0,6475,

P

= 0,0123). Disse resultater tyder på, at MIR-30b-ekspression er omvendt korreleret med PAI-1 ekspression i gastrisk cancer, og øget PAI-1 ekspression i gastrisk cancer kunne være et resultat af reduceret MIR-30b ekspression.

(A) udtryk for mir-30b og PAI-1 i gastrisk cancer cellelinjer MKN45, MGC-823, SGC-7901, AGS og HGC-27. Top, western blot-analyse af PAI-1 proteinniveauer; bund, QRT-PCR-analyse af MIR-30b niveauer. Data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse. fra tre uafhængige forsøg. (B) MIR-30b og PAI-1-mRNA-niveauer i gastrisk cancer væv blev analyseret ved QRT-PCR. Det indsatte graf indikerede en statistisk signifikant omvendt korrelation (

R

= -0,6475,

P

= 0,0123). U6 og β-actin tjente som interne normaliserede referencer for miR-30b og PAI-1 mRNA hhv.

PAI-1 er potentielt involveret i miR-30b-induceret apoptose

for yderligere at undersøge, om PAI-1 er involveret i miR-30b-forfremmet apoptose, vi først testet, hvis lyddæmpning af PAI-1-ekspression kan have den samme apoptose-fremmende effekt som miR-30b overekspression. SGC-7901-celler blev transficeret med PAI-1 siRNA eller negativ kontrol-RNA (NC) i 48 timer, som vist i figur 6A, kan mRNA-niveauer af PAI-1 reduceres betydeligt ved dens siRNA. Efterfølgende PAI-1 siRNA viste tydelige stigninger i apoptotiske sats i SGC-7901 celler (figur 6B, 6C), sammenlignet med miR-kontrol. Især PAI-1 siRNA kunne phenocopy virkningen af ​​MIR-30b overekspression på apoptose regulering af cancer celle (figur 6B, 6C). Et repræsentativt eksempel på punktdiagram blev vist i figur 6D. Dernæst undersøgte vi også, om PAI-1 kunne ophæve virkning at fremme apoptose af miR-30b. SGC-7901-celler blev transficeret med MIR-kontrol eller MIR-30b efterligner i 24 timer, og efterfulgt af transfektion med PAI-1 humane cDNA ORF Klon vektor (indikeret som PAI-1) eller tom vektor. Som vist i figur 6E-G, det overekspression af PAI-1 resulterede i åbenlyse undertrykkelse af virkningen af ​​MIR-30b-induceret apoptose. Tilsammen vores resultater antyder, at PAI-1 potentielt er involveret i MIR-30b-fremmet apoptose.

(A) PAI-1 siRNA inhiberer ekspressionen af ​​PAI-1 effektivt på mRNA-niveauer. RT-PCR blev anvendt til at overvåge ekspressionen af ​​PAI-1 48 timer efter transfektion med siRNA for PAI-1 eller negativ kontrol-RNA, β-actin tjente som en intern kontrol. Data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse. fra tre uafhængige forsøg, **

P

0,01. (B) SGC-7901-celler blev transficeret med MIR-kontrol, MIR-30b eller PAI-1 siRNA, og mediet blev erstattet med serumfrit DMEM i 48 timer, aktiviteten af ​​caspase-3 og caspase-7 blev påvist under anvendelse Caspase-Glo 3/7 analysen. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse af 6 gentagelser fra tre uafhængige forsøg, **

P

0,01. (C) SGC-7901-celler blev behandlet som (B), og derefter blev cellerne analyseret for apoptotisk sats efter farvning med Annexin V-FITC og PI. Data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse. fra tre uafhængige forsøg, **

P

0,01. (D) en repræsentant FCM-analyse i (C) blev vist. (E) SGC-7901 celler blev først transficeret med MIR-kontrol eller MIR-30b efterligner, og derefter med PAI-1 humane cDNA ORF Klon vektor (indikeret som PAI-1) eller tom vektor 24 timer senere. 24 timer efter transfektion vektor blev mediet erstattet med serumfrit DMEM i yderligere 24 timer, endelig aktiviteten af ​​caspase-3 og caspase-7 blev påvist under anvendelse af Caspase-Glo 3/7 Assay. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse af 6 gentagelser fra tre uafhængige forsøg, **

P

0,01. (F) SGC-7901-celler blev behandlet som (E), endelig blev cellerne analyseret for apoptotisk sats efter farvning med Annexin V-FITC og PI. Data repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse. fra tre uafhængige forsøg, **

P

0,01.