PLoS ONE: Cervikal microbiome og Cytokine profil på forskellige stadier af livmoderhalskræft: en pilotundersøgelse

abstrakt

Livmoderhalskræft (CC) er forårsaget af højrisiko human papillomavirus persistens grundet immunosuppressiv tumormikromiljøet medieret af cytokiner. Vaginal mikrobiota bestemmer tilstedeværelsen af ​​visse cytokiner lokalt. Vi vurderede associering mellem cervical mikroflora mangfoldighed og histopatologisk diagnose af hvert trin i CC, og vi evaluerede mRNA cervikal ekspressionsniveauer af IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α og IFN-γ på tværs den histopatologiske diagnoser og specifikke bakterielle klynger. Vi bestemmes livmoderhalsen mikrobiota af high throughput sekventering af 16S rDNA amplikoner og klassificeret det i fællesskab state typer (CST). Betyde forskellen analyser mellem alfa-diversitet og histopatologisk diagnose blev udført, samt en β-mangfoldighed analyse i histologisk diagnose. Cervikal cytokin-mRNA-ekspression blev analyseret på tværs af de fælles sikkerhedsmål og de histopatologiske diagnoser. Vi fandt en signifikant forskel i mikrobiota mangfoldighed i NCL-HPV negative kvinder vs dem med squamous intraepithelial læsioner (SIL) og CC (p = 0,006, p = 0,036) .Når β-diversitet blev evalueret, viste CC prøver den højeste variation inden grupper (p 0,0006) og den største afstand i forhold til NCL-HPV negative (p 0,00001). De dominerende bakterier hos kvinder med normal cytologi var

L

.

crispatus

og

L

.

iners

, mens der for SIL, var det

Sneathia spp

. og for CC,

Fusobacterium spp

. Vi fandt højere median cervikale niveauer af IL-4 og TGF-β1 mRNA i CST domineret af

Fusobacterium spp

. Disse resultater antyder, at den cervikale mikrobiota kan være impliceret i livmoderhalskræft patologi. Yderligere kohortestudier er nødvendige for at validere disse resultater

Henvisning:. Audirac-Chalifour A, Torres-Poveda K, Bahena-Román M, Tellez-Sosa J, Martínez-Barnetche J, Cortina-Ceballos B, et al . (2016) Livmoderhalskræft microbiome og Cytokine profil på forskellige stadier af livmoderhalskræft: en pilotundersøgelse. PLoS ONE 11 (4): e0153274. doi: 10,1371 /journal.pone.0153274

Redaktør: Maria Lina Tornesello, Istituto Nazionale Tumori, ITALIEN

Modtaget: December 4, 2015; Accepteret: 25 Mar 2016; Udgivet: 26 April, 2016

Copyright: © 2016 Audirac-Chalifour et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Instituto Nacional de Salud Pública, Mexico og tilskud fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (MX) (CONACYT) Fondo september CB -2011-01-169552, CONACYT-Fondo E0013 Apoyo COMPLEMENTARIO CATEDRAS-2014-C01-245520 og CONACYT-FONSEC SSA /IMSS /ISSSTE-2014-C01-234149, Mexico. Audirac-Chalifour takker Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) for kandidatuddannelsen fællesskab 2976418945. K Torres Poveda er CONACYT Research Fellow-Instituto Nacional de Salud Pública (INSP), Cuernavaca, Morelos, Mexico.

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft (CC) er den fjerde mest almindelige kræftform hos kvinder, og den syvende samlede verdensmarked, med en anslået 485 000 nye. tilfælde og 236 000 dødsfald i 2013. CC forårsaget 6,9 millioner disability-adjusted life-år (DALYs) i 2013 [1], og det var den næstmest almindelige dødsårsag ved kræft blandt mexicanske kvinder i 2011 (10,4%) [2 ]. CC er forårsaget af en vedvarende infektion med human papillomavirus høj-risiko (HR-HPV). Imidlertid er en HR-HPV-infektion betragtes som en nødvendig, men ikke en tilstrækkelig grund til CC udvikling [3]. Mekaniske faktorer, såsom vaginal udskylning eller samleje, og biologiske faktorer, som bakteriel vaginose (VB) [4, 5], eller seksuelt overførte infektioner (SOI) [6] ændre den vaginale mikromiljø og er blevet identificeret som cofaktorer i den vedvarende en HPV-infektion [7].

langt størstedelen af ​​HR-HPV-inficerede kvinder aldrig udvikle CC fordi et tilstrækkeligt immunrespons er i stand til at styre infektion og forhindre dens progression til præcancer læsion [8]. Dette antyder, at yderligere faktorer handle i forbindelse med HPV at påvirke risikoen for CC udvikling. Hidtil har følgende determinant medfaktorer blevet associeret til udseendet af CC: socio-miljømæssige faktorer (kulturelle barrierer, ekstrem fattigdom, dårlige sanitære områder, og begrænset adgang til sundhedspleje) [9], epidemiologiske faktorer (multiparity, brug af p-piller i mere end fem år, flere seksuelle partnere og rygning) [10, 11], og genetiske faktorer relateret til værten (polymorfier i immunrespons gener, der bestemmer en mangelfuld immunrespons og lokal immunosuppression) [12- 14] . Derfor CC er en kompleks multifaktoriel sygdom, og der er behov for yderligere forskning for at forbedre vores forståelse af dens ætiologi.

Det er blevet foreslået for nylig, at unormal vaginal mikrobiota spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​livmoderhalskræft neoplasma [15] . En epidemiologisk undersøgelse identificeret

Chlamydia trachomatis

som en co-faktor for CC udvikling [16]. Tilsvarende andre undersøgelser viser, at nogle bakterielle arter synes at være forbundet med udviklingen af ​​andre kræftformer, såsom coloncancer; disse undersøgelser tyder også på, at forskellige bakteriearter fortrinsvis bebor tumorsites [17, 18].

Der er stadig flere huller i viden om sammenhængen mellem vaginale og cervikale microbiomes og CC udvikling [19]. Bakteriel kultur-baserede data viser, at nogle potentielle pro-onkogene patogener, som kan være medlemmer af kommensale mikrobiota, bidrager til tumor initiering og udvikling [20, 21].

CC er en mangeårig sygdom, og der er stadier tidligere til det hvorunder betingelserne for livmoderhalskræft og vaginale miljø er modificeret, herunder vaginal surhedsgrad og cytokin mønster, der fører til en lokal immunosuppression tilstand. Tilstedeværelsen af ​​Lactobacilli, en lav vaginal pH ( 4,5) og antimikrobielle peptider er en del af de forsvarsmekanismer til stede i vaginal mikromiljø [22]. Når en ubalance af forsvarssystemet sker, opstår fysisk-kemiske ændringer og producere histologiske ændringer af den vaginale slimhinde og det cervikale epitel, som alle betingelser en selektivt tryk på mikrobiota [23]. I en CC mikromiljø, tilstedeværelsen af ​​immunosuppressive cytokiner (TGF-SS1, IL-10) begunstiger persistenceof HPV-infektion [24, 25, 26, 27]. De fleste studier af kvindelige kønsorganer microbiome er blevet udført ved den vaginale niveau og få undersøgelser inddrager de cervikale mikrobiota og cytokinprofiler. En sammenlignende genomisk analyse af vaginale microbiome har identificeret ændringer i mikrobiota mangfoldighed blandt kvinder med genital human immundefekt virus (HIV) infektion, med eller uden bakteriel vaginose (BV) [28], og i gravide kvinder [29]. Derudover er det blevet foreslået, at den vaginale mikrobielle økosystem og cytokinprofilen spille en rolle i at fremme cervikal dysplasi [30], da en unormal vaginal mikrobiota er blevet forbundet med erhvervelse af en HPV-infektion [31]. Imidlertid har kun få undersøgelser blevet udført på den cervikale microbiome som en modifikator af HPV naturlige historie med hensyn til udviklingen af ​​cervikale læsioner og cervix-neoplasi [32].

I betragtning af at det er bevist, at specifikke arter af cervicovaginal mikrobiota modulere den inflammatoriske immunreaktion i kvindelige kønsorganer af sunde sorte sydafrikanske kvinder [33], er det muligt, at den cervikale microbiome er involveret i at fremme ekspressionen af ​​immunosuppressive cytokiner [34] .Vi har opstillet den hypotese, at HPV-infektion og udvikling af SIL og CC er forbundet med ændringer i mikrobiota diversitet og med cytokin ekspressionsmønstre på den cervikale niveau. Vores undersøgelse undersøgte sammenhængen mellem livmoderhalskræft mikrobiota diversitet og sammensætning, ifølge en histopatologisk diagnose af hver fase af den naturlige historie af CC, og cervikale ekspressionsniveauer af IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF -α og IFN-γ mRNA.

Materiale og metoder

undersøgelse design og befolkningens

en tværsnitsundersøgelse blev udført ved hjælp af prøver fra et biologisk bank bygget mellem 2008 og 2011 fra nydiagnosticerede tilfælde af planocellulære intraepithelial læsioner (SIL) (n = 268 HPV-positive prøver); kvinder med negativ Papanicolaou og en normal kolposkopi som kontroller (n = 205, 81 HPV-negative og 124 HPV-positive prøver), rekrutteret fra kvindernes sundhedscenter i staten Morelos (

Centro de Atención para la Salud de la Mujer del Estado de Morelos

) i Mexico mellem juni 2008 og november 2011 og fra cervikale pladecellekræft tilfælde (n = 171 HPV-positive prøver), rekrutteret fra Gynækologi service på National Cancer Institute (Inka) i Mexico City, fra september 2010 og december 2011. Bioetik og forskningsudvalg på Inka (referencenummer. inka /CC /326 /10CB /609) og ved Statens Institut for Folkesundhed (

Instituto Nacional de Salud Pública

-INSP; referencenummer: CI814) godkendt referenceundersøgelse i hvilken den biologiske bank blev bygget. Desuden alle deltagere gav deres informerede samtykke til at bruge deres biologiske prøver til yderligere undersøgelser. Hver emne blev interviewet til livsstil, at socio-demografiske og reproduktive faktorer kendt være forbundet med øget risiko for CC [12].

For metodisk bekvemmelighed, valgte vi 32 sager til denne undersøgelse, ikke-cervikale læsioner (NCL : n = 10 HPV-negative n = 10 HPV-positive), SIL (n = 4 HPV-positiv) og CC (n = 8 HPV-positive). Inklusionskriterier for delprøve valg relateret til den medicinske historie var: patientens rekruttering på samme dag af menstruationen (syv postretirement menstruation dage), den manglende brug af douches og ingen seksuel aktivitet i tidligere dage af prøveudtagningen. Også, ikke at have registreringer af antibiotika eller svampedræbende brug i de sidste 30 dage forud for prøveudtagning. Andre inklusionskriterier inkluderet: molekylær HPV + diagnose; DNA og RNA renhed og integritet egnet til sekventering og kvantificere mRNA ved QRT-PCR, og at være mexicanske med mexicanske forældre og bedsteforældre til at sikre lignende afstamning. eneste kriterium Udelukkelsen var ikke at have tilstrækkelig læser. “Vi overvejede en 000 som tærskel, efter udførelse af bioinformatik sekvensanalyse. Den undersøgte befolkningens sociodemografiske og reproduktiv-kønskarakterer er præsenteret i tabel 1. Alle forsøgspersonerne var mexicanske kvinder, hvis alder varierede fra 22 til 61 år. Der var en signifikant forskel mellem grupperne med hensyn til præventionsmetode og den positive HPV-test. CC patienter rapporterede ingen brug af svangerskabsforebyggende metoder oftere end NCL patienterne. Med hensyn til SIL sager, de mest almindelige HPV genotyper var HR-HPV (ikke-HPV 16 eller 18), mens blandt CC patienter den mest udbredte genotype var HPV 16.

Karakteristik af den biologiske prøver bank

Der blev taget prøver fra kvindernes livmoderhalsen syv dage efter menstruation tilbagetrækning. Den biologiske bank anvendt til denne undersøgelse er sammensat af DNA-prøver og cDNA ekstraheret fra cervikale epitel skrabning podninger fra kvinder diagnosticeret med NCL og fra friske celler biopsier fra kvinder diagnosticeret med SIL og CC. Genomisk DNA blev ekstraheret fra cervikale epitel afskrabninger og biopsier tidligere fordøjet med proteinase K, under anvendelse af genomisk DNA Purification Kit (Fermentas Life Sciences, Vilnius). blev truffet alle mulige foranstaltninger for at undgå krydskontaminering af prøver under DNA-ekstraktion. DNA-koncentration og renhed blev vurderet ved Thermo Scientific NanoDropTM 1000 spektrofotometer (260/280) og DNA integritet blev bestemt ved elektroforese i agarosegeler ved 1%. Totalt RNA blev isoleret fra cervikale prøver under anvendelse af Trizol-reagens fra Invitrogen. cDNA-syntese blev udført i nærvær af 200 U af M-MLV revers transkriptase og 2,5 ug af total RNA under anvendelse af standardbetingelser. PCR reaktioner blev udført i et reaktionsvolumen på 25 pi indeholdende 1 pi cDNA, 0,2 mM dNTP’er, 15 pmol af hver primer, 2,5 pi reaktionspuffer and1U af Taq-DNA-polymerase rekombinant. Primere til den humane husholdning glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase GAPDH (450 pb) blev anvendt til at verificere cDNA integritet.

Cervikale prøver blev tidligere testet for HPV. Virale DNA-fragmenter fra prøverne blev amplificeret ved PCR under anvendelse konsensus primerne MY09 /MY11 [35], LIC1 /LIC2 [36], og GP5 /GP6 [37], som flankerer L1-regionen af ​​HPV capsidet. PCR-amplifikation af GAPDH (556pb) blev anvendt som en intern kontrol for DNA kvalitet. Cellelinjer, der udtrykker HPV-16 (SiHa) og HPV-18 (HeLa) blev anvendt som positive kontroller. Deioniseret H

2O tjente som en negativ kontrol. Alle produkter blev analyseret ved elektroforese i acrylamidgeler på 6%. Positive prøver blev visualiseret i en agarosegel på 1,5%. DNA-båndet opnået blev ekstraheret og oprenset med MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og sekventeret ved anvendelse af Sanger-metoden. De HPV-sekvenser blev analyseret ved BLAST. HPV blev kategoriseret i henhold til dens fylogenetiske mønstre i lav- og højrisiko typer: HPV16 og HPV18. HPV status blev bekræftet med Anyplex

TM II HPV HR påvisningsassay fra Seegene

®, baseret på multiplex real-time PCR, TOCE og DPO primerpar teknologi, ifølge leverandørens anvisninger. [38]

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev foretaget i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Den blev godkendt af Research, etik og biosikkerhed udvalg på INSP (CI: 1143). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere

Analyse af livmoderhalskræft cytokin mRNA-ekspression

En QRT-PCR-amplifikation blev udført i to eksemplarer til genekspression analyse med følgende TaqMan prober:. GAPDH (ID -Hs99999905_mL), IL-4 (ID-Hs00174122_mL), IL-6 (ID-Hs00174131_mL), IL-10 (ID-Hs00961622_mL), TGF-β1 (ID-Hs00961622_mL), TNF-α (ID-Hs00174128_mL) og IFN -γ (ID-Hs00174143_mL). Amplificeringsblandingen blev fremstillet ved tilsætning af 100 ng af hver cDNA prøve til en endelig reaktionsblanding af 10 pi indeholdende 5 pi TaqMan PCR Master Mix til ekspression, 0,5 pi probe og 3,5 pi DNase-frit vand af molekylærbiologisk kvalitet. De amplifikationscykler (udført på en StepOnePlus ™ fra Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) var som følger: 94 ° C i 10 minutter, 40 cykler ved 94 ° C i et minut, 54 ° C i et minut, 72 ° C i et minut og 30 sekunder, efterfulgt af 72 ° C i 15 minutter. GAPDH blev anvendt til at normalisere mængden af ​​IL-4, IL-6, IL-10, TGF-p1, TNF-a og IFN-y-mRNA er til stede i hver prøve [39]. Perifert blod mononukleære celler stimuleret med phytohæmagglutinin i 72 timer blev anvendt til bestemmelse dynamikområdet kurver af IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α og IFN-γ-ekspression; alle standard kurver blev realiseret i tre eksemplarer. Ekspressionsniveauet af mRNA for hvert cytokin estudied blev beregnet under anvendelse relative kvantificering med den sammenlignende Ct (2-ACt) metoden under GAPDH som det endogene gen. Prøverne blev analyseret dobbelt.

High-throughput sekventering af 16S rDNA amplikoner

Amplikoner af ~ 456 bp indeholder V3-V4 variable regioner fra 16S rRNA-generne blev opnået for DNA biblioteker forberedelse. Primere 347F fremadrettet 5′-GGAGGCAGCAGTRRGGAAT-3 ‘og 803R bagside 5′-CTACCRGGGTATCTAATCC-3’, beskrevet af Nossa, blev anvendt [40]. En første PCR blev udført med følgende betingelser: 50 ng skabelon fra hver DNA-prøve blev tilsat til en endelig reaktionsblanding af 30 pi indeholdende 1X reaktionsbuffer, 2,5 mM MgSO

4, 1 mM dNTP, 0,2 U Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen) og 5 pmol /pl af primerne. Amplifikationen program var følgende: 94 ° C i 3 minutter, derefter 30 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder, 68 ° C i 30 sekunder efterfulgt af 68 ° C i 5 minutter. Amplikoner blev visualiseret ved elektroforese i agarosegel ved 1%. DNA-båndene opnåede oprenset ved MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland).

Amplikoner blev re-amplificeret og behandles med de samme primere i tilknytning til adapter A i 454 sekventering protokol efterfulgt af en 6- mer multiplex identifikator og af primeren 347F. Den reverse primer var den samme for alle de bivirkninger i forbindelse med adapteren B i 454 sekventering protokol. Reaktionsbetingelserne var som følger: 0,0625 ng af hver DNA-prøve til en endelig reaktionsblanding af 30 pi indeholdende 1X reaktionsbuffer, 2,5 mM MgSO

4, 1 mM dNTP, 0,2 U Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) og 5 pmol /pi primere 347F og 803R. Amplifikationscykler var følgende: 94 ° C i 3 minutter, derefter 15 cyklusser ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder, 68 ° C i 30 sekunder efterfulgt af 68 ° C i 5 minutter. Gelelektroforese blev udført i agarose gel ved 1,5% for at visualisere integriteten af ​​de amplificerede produkter. DNA-fragmenter blev oprenset ved MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og bagefter kvantificeret og vurderet. Amplikoner blev samlet i otte biblioteker og blandes i en ækvimolær måde. Efterfølgende blev bibliotekerne oprenset med Ampurebeads XP (Beckman Coulter, Inc.). Emulsion PCR titrering og udbytte beregning blev derefter udført for at bestemme mængden af ​​perler til at indlæse i sekventering plader. Efterfølgende blev massiv sekventering udført på Genome Sequencer Titanium Roche-454 (AppliedScience) platform.

Bioinformatik analyse

De rå sekvenser af V3-V4-regionen fra 16SrRNA genet genereret for hver amplikon blev behandlet med Roche-454 supplerende software, og * .sff filer blev genereret. Høj kvalitet læser blev udvalgt med følgende kriterier: læser med mere end fem på hinanden følgende baser med scoringer under 20 på Qphred skalaen på en 30 baser vinduet bevæger blev kasseret. Kvalitetskontrol (QC) blev overvåget med Thomas Girke R script, der bruger en fastq Quality.R bibliotek til at plotte fordelingen af ​​ratingen for hver base i henhold til sin holdning til Qphred logaritmisk skala [41]. Når kvalitet filer og sekvenser blev opnået separat fra * .sff raw filer blev demultipleksing udføres i QIIME at identificere sekvenserne tilhører hver prøve efter deres molekylære identifikator (MID) [42].

Sekvenserne var grupperet i operationelle taksonomiske enheder (Otus) ved hjælp af PyNAST algoritme til sekvens alignment. Alle sekvenser, som havde en lighed på 99% eller mere blev betragtet som en enkelt OTU [43]. En repræsentativ sekvens af hver OTU blev valgt til senere taksonomisk identifikation. Taxa blev tildelt med Uclust algoritmen [44], ved hjælp af den grønne Gener databasen (99% frigivelse i maj 2013) som reference, således at enhver repræsentativ sekvens på linje med en 99% lighed med en reference sekvens ville blive tillagt samme artsnavn på [ ,,,0],45].

Sekvenser, der ikke tilpasse til referencen blev udtrukket til en anden fil til

de novo

samling og skal overvejes i mangfoldigheden calculus. For at bestemme om mikrobiota præparat var i stand til at klynge prøver ved diagnose, blev et uovervåget hierarkisk clustering baseret på Bray Curtis forskel mellem OTU overflod af hver prøve (S1 Table) udført med R pakker og afbildet som en Heatmap. Alpha mangfoldighed blev beskrevet ved hjælp af et fylogenetisk mangfoldighed (PD) hele træet og en Shannon mangfoldighed indeks (H’) beregning og deres fortynding. En afstand matrix og hovedkomponenter (PC) blev beregnet med UniFrac at definere beta mangfoldighed [46]. Desuden blev et koordinatsystem analyse (PCoA) afbildet med QIIME scripts og visualiseres i kejser [47].

Vi klassificeret mikrobiota præparat ifølge fællesskabet state type (CST) baseret på den dominerende taxa fundet i prøverne. En cervikal CST er en klynge af lokale tilstande (arter sammensætning og tæthed af en cervikal samfund), der kan sidestilles med hensyn til de former og relative mængder af de observerede phylotypes [48]. Den gruppering af community stater blev udført ved hjælp af en hierarkisk klyngedannelse baseret på Bray Curtis forskel mellem alle par af community stater og en gennemsnitlig kobling.

Statistisk analyse

Relevante variabler blev sammenlignet mellem NCL vs SIL og NCL vs CC, bruge

χ

2 og Kruskal-Wallis test for kategoriske og kontinuerte variable, henholdsvis. T-student test blev udført for at bestemme den gennemsnitlige forskel mellem Shannon mangfoldighed indeks eller det fylogenetiske mangfoldighed hele træet og histopatologisk diagnose. Logistiske regressionsmodeller blev anvendt til at bestemme associationen mellem den histopatologiske diagnoser og Shannon mangfoldighed indeks og den histopatologiske diagnoser (NCL uafhængigt af HPV status og SIL /CC) og PD hele træet, tilpasning efter alder, paritet, svangerskabsforebyggende fremgangsmåde og HPV-genotype .

Vi skønnede risiko alfa mangfoldighed som en odds ratio (OR) med 95% konfidensinterval (CI). Den estimerede gennemsnitlige forskel på bits enheder (Shannon mangfoldighed indeks) i livmoderhalsen mellem SIL eller CC og NCL uafhængigt af HPV-status blev vurderet ved en lineær regressionsanalyse justering efter alder, prævention og HPV-genotype. Vi evaluerede variationen af ​​vægtede UniFrac afstande ved hjælp af en Kruskal-Wallis test for at tjekke beta mangfoldighed inden for hver histopatologisk diagnose gruppe. En Wilcoxon Mann-Whitney-test blev udført for at evaluere den statistiske signifikans af vægtede UniFrac afstande mellem SIL /CC vs NCL-HPV negative.

Cervikal ekspression af IL-4, IL-6, IL-10, TGF -β1, TNF-α og IFN-γ-mRNA blev analyseret ved histopatologisk diagnose (NCL vs SIL og NCL vs CC) under anvendelse af Wilcoxon Mann-Whitney-test. Cervikal ekspression af IL-4, blev IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α og IFN-γ-mRNA analyseres tværs CST klynger ved hjælp af Kruskall Wallis test. Endelig udførte vi direkte korrelation analyser mellem Shannon mangfoldighed indeks og den cervikale ekspression af IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β1, TNF-α og IFN-γ-mRNA. Vi udførte alle de statistiske analyser ved hjælp af Stata statistisk software version 13.0 (StataCorp, Collage Station, TX, USA).

Resultater

Generelt mønster af de cervikale samfund stikprøven

efter QC, var der 311.863 høj kvalitet læser ujævnt fordelt gennem prøverne. For at løse dette problem, blev 1000 tilfældige delprøver indhentet fra de rå data for hver prøve, og de blev brugt til yderligere bioinformatik analyse. Alpha mangfoldighed fortynding kurver (Fig A i S1-fil) viser, at efter beregning H’in mere end 400 læser, har delprøve mangfoldighed ikke stige; derfor, 1000 sekvenser haft tilstrækkelig sekventering dybde til denne undersøgelse. På den ukontrollerede Heatmap (figur 1), prøver fra NCL klynge sammen og uafhængigt af HPV-status, viste, at HPV-negative kvinder havde en højere andel af

Lactobacillus crispatus Hotel (46%) og en mindre en af

Lactobacillus iners

(14,9%), mens HPV-positive kvinder havde proportioner af 13,3% og 2,1%, henholdsvis. Interessant nok syntes disse andele at skifte med tilstedeværelsen af ​​HPV. Desuden

L

.

crispatus

blev fundet i mindre andele i SIL (14,4%) og CC (1,3%), mens

L

.

iners

faldt til 2,1% i SIL og blev ikke påvist i CC.

Unsupervised Heatmap af den relative forekomst af mikrobiel taxa findes i de cervikale mikrobielle samfund af 29 fag, baseret på Bray Curtis forskellighed metrisk. De arter, der findes i relativ overflod af 1% i mindst én prøve, er vist på X-aksen. Den første bar på venstre side repræsenterer behandlingen som følger: rød-HPV-negative uden læsion; blå-HPV-positive uden læsion; orange-squamous intraepithelial cervikal læsion; grøn-livmoderhalskræft. CST er afbildet i den anden venstre barside; pink-CST III, domineret af

Pseudomonas oleovorans

; cyan-CST II domineret af

L

.

iners

; orange-CST jeg domineret af

L

.

crispatus

; grøn-CST IV domineret af

Sneathia

; blå-CST V domineret af

G

.

vaginalis

; gul-CST VIII domineret af

Fusobacterium spp

.; rød-CST VI domineret af

S

.

agalactiae

, og lilla-CST VII domineret af

Fusobacterium necrophorum

. Sample navne vises i højre side af grafen. De kladogram øverst navne arten angiver de omtrentlige evolutionære relationer mellem arterne. CST: Community State Type. Dx:. Histopatologisk diagnose

Andre arter af

Lactobacillus

,

L

.

jensenii

og

L

.

vaginalis

fandtes kun i prøver fra kvinder med NCL.

Gardnerella vaginalis

blev fundet primært i HPV-negative kvinder med NCL (11,5%), og det faldt gradvist over HPV-positive (6,9%), SIL (8,1%) og CC (3,3%) grupper.

S

.

agalactiae

udgjorde mere end 90% af mikrobiota sammensætning af to af prøverne.

Pseudomonas oleovorans

blev observeret i en relativ overflod af 19% kun blandt HPV-positive kvinder med NCL. Bakterier fra

Fusobacteriales

ordre fandtes kun i SIL og CC grupper. I SIL gruppen,

Fusobacterium spp

. vises en relativ overflod af 6,3%;

Sneathia spp

, 26,6%.;

Shuttleworhia satelles

, 8,7%; og

Megasphaera elsdenii

, 10,4%; mens den relative forekomst af de samme mikroorganismer i CC gruppe var som følger: 14%, 12,9%, 0%, og 2,2%, henholdsvis.

Fusobacterium necrophorum

blev kun observeret i CC-gruppen (14,2%). Dette peger på, at mikrobiota mangfoldighed og sammensætning er anderledes blandt de analyserede grupper. For at bekræfte dette, blev alfa og beta mangfoldighed analyseret.

cervikale samfund blev klassificeret i otte fælles sikkerhedsmål ifølge de dominerende bakterier, som vist i tabel 2. CST jeg isdominated af

L

.

crispatus Hotel (21%), CST II af

L

.

iners Hotel (17%), CST III af

Pseudomonas oleovorans Hotel (10%), CST IV af

Sneathia spp

. (17%), CST V af

G

.

vaginalis Hotel (7%), CST VI af

Streptococcus agalactiae Hotel (7%), CST VII af

F

.

necrophorum Hotel (7%), og CST VIII af

Fusobacterium spp

. (14%). Bortset fra CST VI blev alle prøverne grupperet efter den histopatologiske diagnose. CST Jeg bestod hovedsageligt af HPV-negative kvinder med NCL; CST II og III blev overvejende består af HPV-positive kvinder med NCL; CST IV blev overvejende består af SIL tilfælde; CST V bestod hovedsageligt af kvinder med NCL uanset deres HPV-status; CST VIII bestod overvejende af CC sager, og CST VII omfattede kun tilfælde af CC (figur 2).

Bar diagram af relative forekomst af arter pr gruppe.

Sammenligning af livmoderhalskræft mikrobiota mangfoldighed på tværs af CC etaper

Alpha mangfoldighed.

selvom fortynding kurver for Shannon indekset (fig a i S1 fil) viste en højere diversitet i CC og SIL grupper end blandt HPV-negative og -positive kvinder med NCL, fandt vi, at mangfoldighed i sig selv, som tegner kun for rigdom og relative rigdom, ikke er tilstrækkelig til at bestemme den fase af developmentof CC. Ikke desto mindre, når det kommer til indekser, der anser fylogenetiske målinger som PD hele træet, fandt vi en signifikant forskel med hensyn til fylogenetiske diversitet mellem HPV-negative NCL og SIL og mellem HPV-negative NCL og CC (p-værdier: 0,006 og 0,036 henholdsvis) (tabel 3). Med andre ord, sammensætningen af ​​den cervikale mikrobiota er forskellig mellem grupperne. De box plots i figur 3 viser fordelingen af ​​Shannon mangfoldighed indekset og PD hele træet på tværs histopatologiske diagnosegrupper. Shannon mangfoldighed indekset viser en stigende tendens, men det er ikke signifikant. PD hele træet viser en signifikant forskel mellem HPV-negative NCL og SIL og mellem HPV-negative NCL og CC. SIL og CC-grupper vise de mest forskelligartede cervikale mikrobiota. Vi kunne ikke finde en sammenhæng mellem den histopatologiske diagnose og Shannon mangfoldighed indeks (NCL uanset HPV status og SIL /CC), og heller ikke mellem PD hele træet og den histopatologiske diagnose ifølge den logistiske regressionsanalyse (tabel 4). Ved vurderingen af ​​sammenhængen mellem Shannon mangfoldighed indeks for de cervikale microbiome prøver og den histopatologiske diagnose, den gennemsnitlige estimerede forskel på bit enheder mellem CC og NCL var 1,11 (95% CI, 0,057-2,165, (p = 0,04) (tabel 5) . Dette bekræfter, at mikrobiota mangfoldighed i CC tilfælde er højere end i NCL gruppen.

boxplots viser fordelingen af ​​H ‘(bit enheder) og PD-værdier på tværs af alle prøverne.

β-diversitet.

PCoA resultater konsekvent viste, at den cervikale microbiome er især forskellige i alle faser af den naturlige historie af CC (figur 4A). de tre pc’er, hvor plottet i 2D for parvise sammenligning, PC1 udgjorde 33,44% af variansen mellem prøver, PC2 for 26,85% og PC3 til 10,38% tilstedeværelsen af ​​

Fusobacterium spp

,

Sneathia spp

. og

Megasphaera spp

. var relateret til PC1. tilstedeværelsen af ​​

bifidobakterier spp

. og

Pseudomonas spp

. var relateret til PC2. fraværet af

Pseudomonas-arter

.,

Fusobacterium spp

. og tilstedeværelsen af ​​bakterier fra

Bifidobacteriaceae

familie var relateret til PC3, i henhold til den beregnede faktor lastning matrix (tabel A i S1 File).

A. PCoA profil af den histopatologiske diagnose vises med vægtede UniFrac afstande. Hver tal repræsenterer en prøve farvet i henhold til dens histopatologisk diagnose. Røde cirkler repræsenterer HPV-negative NCL prøver; blå firkanter repræsenterer HPV-positive NCL prøver; appelsin trekanter repræsenterer SIL og grønne trekanter repræsenterer CC. A1. Hovedbestanddel (PC) -1 udgjorde 33,44% af variationen i sammensætningen af ​​mikrobiota på grund af tilstedeværelsen af ​​

Sneathia spp

. og

Fusobacterium spp

. A2. PC-2 udgjorde 26,85% af variationen inthe sammensætningen af ​​mikrobiota på grund af tilstedeværelsen af ​​

bifidobakterier spp

. og

Pseudomonas spp

. A3. PC-3 udgjorde 10,38% af variationen i sammensætningen af ​​mikrobiota på grund af tilstedeværelsen af ​​

Lactobacillus spp

. og

Streptococcus spp

. B. B1. Variation af vægtede UniFrac afstande inden hver histologisk diagnose gruppe. B2.