PLoS ONE: Molekylær Ændringer i Pre-metastatisk lymfeknuder for kræft i spiserøret Patients

Abstrakt

lymfeknudemetastase angiver dårlig prognose i kræft i spiserøret. For at forstå de underliggende mekanismer, de fleste undersøgelser hidtil fokuseret på at undersøge tumorerne selv og /eller invaderet lymfeknuder. Men de har forsømt de potentielle begivenheder i metastatisk niche, som går forud invasion. Her rapporterer vi den første beskrivelse af disse regler i patienter på transskription niveau. Vi bestemt transkriptom profiler af stadig metastase-fri regionale lymfeknuder i to patientgrupper: patienter klassificeret som PN1 (n = 9, findes metastatiske knuder) eller PN0 (n = 5, der ikke metastatiske knuder). Alle undersøgte lymfeknuder, også dem fra PN1 patienter, var stadig metastase-fri. Resultaterne viser, at regionale lymfeknuder fra PN1 patienter afgørende anderledes fra dem i PN0 patienter – endnu før metastase har fundet sted. I PN0 gruppe blev observeret tydelige immunrespons mønstre. I modsætning hertil lymfeknuder PN1 udviste en klar profil af svækket immunforsvar og reduceret proliferation, men øget apoptose, forstærket hypoplasi og morfologiske omdannelsesprocesser. DKK1 var den mest betydningsfulde gen associeret med de molekylære mekanismer, der finder sted i lymfeknuder fra patienter med metastase (PN1). Vi antager, at de to molekylære profiler observeret udgør forskellige stadier af en progressiv sygdom. Endelig foreslår vi, at DKK1 kunne spille en vigtig rolle i de mekanismer, der fører til lymfeknude metastaser

Henvisning:. Otto B, Koenig AM, Tolstonog GV, Jeschke A, Klaetschke K, Vashist YK, et al. (2014) Molekylær Ændringer i Pre-metastatisk lymfeknuder for kræft i spiserøret Patienter. PLoS ONE 9 (7): e102552. doi: 10,1371 /journal.pone.0102552

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: April 8, 2014 Accepteret: 20 Juni 2014; Udgivet: 21 Jul 2014

Copyright: © 2014 Otto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle microarray data er blevet deponeret i NCBI GEO offentlige arkiv og er tilgængelige under tiltrædelsen nummer GSE51021

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Stiftung für Pathobiochemie und Molekulare Diagnostik, Deutsche Vereinte Gesellschaft für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

I kræft i spiserøret (ESC), er lymfeknude metastaser forbundet med dårlig prognose. Under migreringen af ​​tumorceller gennem lymfekar og under deres homing i lymfeknuder, disse tumorceller kommer i tæt kontakt til endotelceller og lymfeknude sinus. Tumor ekspansion danner i øjeblikket det vigtigste grundlag for valg af terapi. Men på trods af den høje prognostiske relevans lymphogenic metastaser, de molekylære mekanismer bag denne metastatisk vej er stadig mest ukendte

En række undersøgelser undersøgte de molekylære profiler af tumorer [1] -. [4] og /eller . metastatiske lymfeknuder [5] Yderligere undersøgelser undersøgt lymphogenic metastaser i sammenhæng med lymfe angiogenese [6] – [9] og chemokin forbundet [10] – [12] migration. Det blev antaget, instrueret migration af esophageal carcinomaceller kan styres af lokalt udtrykte kemokiner. [12] Og baseret på disse resultater ville det være tænkeligt, at målsøgende processen i lymfeknuderne kan blive bistået af lectin-glycan-interaktioner mellem tumoren celler og lymfeknuder endotelceller. Hirakawa et al. [13] viste, at i mus selv før metastaserende, primære tumorer (hudkræft) kan stimulere skildvagtslymfekirtel lymfangiogenese. De foreslog, at primære tumorer kunne være i stand til at forberede deres fremtidige metastatisk niche ved at producere lymfangiogene faktorer, der kan mægle deres effektiv transport til skildvagtslymfekirtel.

Men til forfatternes bedste viden er der ingen offentliggjorte arbejde specifikt undersøge de tidlige molekylære mekanismer i denne metastatisk niche i patienter -. mekanismer inden for de ikke-berørte lymfeknuder, som kunne udbreder eller undertrykke tidlig metastaser hos patienter med ESC

Formålet med denne undersøgelse var derfor at specifikt undersøge disse tidlige ændringer i lymfeknuder før histopatologisk påviselig metastase. Arbejdet har været drevet af den hypotese, at før tumorceller metastaserer til regionale lymfeknuder, skal allerede taget vigtige forandringer sted formerings eller undertrykke målsøgende proces. For at få indsigt i denne proces, vi samlet tumor regionale og fjernt lymfeknuder fra patienter, der lider af ESC iscenesat som PN0 (der ikke metastatiske knuder) eller PN1 (findes metastatiske lymfeknuder). Alle lymfeknuder indgår i analysen var metastase-fri – uanset patientens iscenesættelse. Vi udførte microarray-analyser og undersøgt de mekanismer knyttet til generne udtrykkes forskelligt mellem regionale og fjernt lymfeknuder af den samme patient.

Nøglen til vores arbejde her er to funktioner. Først bliver alle analyserede lymfeknuder uden undtagelse, selv de af de PN1 patienter, var stadig fri for metastaser. For det andet, vi brugte prøver af patienter, der ikke undergår nogen neoadjuverende radio-kemoterapi og etablerede yderligere procedurer, der sikrede meget høj prøve kvalitet.

Materialer og metoder

Generel analyse arbejdsproces

de inkluderede patienter led af kræft i spiserøret og gennemgik en radikal thoraco-abdominal en-bloc esophagectomy herunder lymfeknude dissektion af den øvre og nedre mediastinum (R0 resektion) uden neoadjuverende radio-kemoterapi. Vi inkluderede kun lymfeknuder fra patienter iscenesat som PN0 (regional lymfeknuder fri for metastaser) eller PN1 (regionale lymfeknuder metastase til stede) og verificeret ved histopatologi, at lymfeknuder udvalgt til vores analyse var alle tumorceller gratis. Vi har også bekræftet ved immunohistologi at disse lymfeknuder var fri for mikro-metastase. Vi isoleret fra hver lymfeknude total RNA for microarray ekspressionsanalyse. En parret t-test blev anvendt til identifikation af gener, som blev differentielt udtrykte mellem regionale og fjerne lymfeknuder og udførtes en funktionel berigelse og netværk analyse. Efterfølgende store kandidater blev valideret via real time PCR og DKK1 valideret ud via immunohistologisk farvning.

Experiment design

Formålet med arbejdet præsenteres her var at identificere potentielle faktorer letter og kørsel metastaser i lymfeknuder fra patienter, der lider esophageal carcinoma. For at muliggøre en sådan forståelse eksperimentet design (fig. 1), indarbejdet to variabler af interesse.

Lymfeknuder af to forskellige patientgrupper, der lider (PN1) eller ikke lider (PN0) fra lymfeknude metastaser blev undersøgt. Fra hver patient regionale lymfeknuder (støder op til tumoren) blev sammenlignet med fjerne lymfeknuder (reference som baseline). Nøglen til forsøget er, at

alle

undersøgte lymfeknuder, herunder PN1 patienter blev sørget for at være stadig fri for metastaser samt mikro-metastaser.

Først prøver blev klassificeret i henhold til den primære status af patienterne udviser (PN1 gruppe) eller ikke-udstille (PN0 gruppe) metastaser i de regionale lymfeknuder. Sammenligningen af ​​PN1 og PN0 patienter bør fremhæve de generelle forskelle i regler, der kan medføre eller forhindre fra metastaser.

For det andet, to lymfeknuder node prøver blev indsamlet fra hver patient, en knude placeret tæt på tumor (regionale ) og det andet knudepunkt fjernt til tumoren. Mens de fjerne knuder tjente som reference prøve de regionale knudepunkter blev undersøgt for transkriptionelle regler. Den parvise sammenligning af tumor fjerne prøver med patienten specifikke regionale knudepunkter skal afsløre de tidlige regler potentielt følge af beliggenhed tæt på tumoren. I denne publikation udtrykket “opregulering” anvendes til disse gener og funktioner, der udviser en højere ekspression i de regionale lymfeknuder i sammenligning med de fjerntliggende lymfeknuder. Omvendt er de gener og funktioner, som faldt i de regionale lymfeknuder kaldes “nedreguleret”.

Det er vigtigt at bemærke, at alle knuder undersøgte blev sørget for at være stadig metastaser fri, uafhængig af patienterne ‘PN1 /PN0 klassificering og placering i forhold til tumoren. Dette skulle gøre det muligt at identificere tidlige forandringer

før

for metastaser homing

Etik udvalg godkendelse patienter samtykke

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med de gældende regler og blev godkendt af Hamburg etiske komité, Tyskland, under afstemning nummer PV3548. Patienter skriftlige samtykke til at deltage i undersøgelsen blev indsamlet i overensstemmelse med de gældende regler.

Prøvemateriale

Alt i alt prøver fra 22 patienter med spiserøret karcinom blev analyseret, hvoraf 14 prøvepar udviste en passende stikprøve kvalitet. For hver patientprøve par af tumor tæt og tumor fjernt lymfeknuder blev indsamlet for at reducere inter-individuelle forskelle, der måtte opstå som følge af divergerende genetiske baggrund. Lymfeknuder blev straks dissekeret efter ekstraktion i operationsstuen. De segmenter, der var dedikeret til microarray ekspressionsanalyse blev transporteret direkte i flydende nitrogen til laboratoriet til RNA-ekstraktion. Den anden del af lymfeknuder blev indlejret i paraffin for klassificering og diagnosticering.

Operation procedure

Efter histologisk diagnose af en esophageal carcinoma, patienter med tidlige stadie læsioner (pT1a) blev henvist til operation enten hvis endoskopisk resektion var ufuldstændige eller tumoren blev iscenesat som pT1b. Patienterne blev direkte henvist til kirurgi, hvis den præoperative iscenesættelse var mistænkelige til enten muskuløs væg involvering (CT2) eller lymfeknude involvering (CN1). Ingen patient blev forelagt neoadjuverende terapi.

Alle patienter gennemgik median T-formet laparatomi og højresidig torakotomi. For patienter med krave anastomose blev udført en ekstra venstre-sidet cervicotomy til krave anastomose. Hver patient modtog en gruppe en bloc esophagectomy med resektion af spiserøret, ductus thoracicus, azygos vene, ipsilaterale lungehinden, og alle periesophageal væv i den bageste mediastinum. Genopbygning blev udført ved gastrisk rør eller colon indskydning sædvanligvis med en høj intratorakal eller cervikal anastomose.

Derudover en standardiseret to-field lymphadenectomy blev udført. Alle lymfeknuder blev systematisk indsamlet fra otte steder: regional mediastinale, både i nærheden af ​​tumoren og fjernt fra det; infraclavicular; diafragma (lavere mediastinal); perigastric lymfeknuder (også venstre og højre perikardial); fælles hepatiske arterie lymfeknuder; og lymfeknuder ved cøliaki stammen. Alle knuder blev kortlagt af kirurgen efter ordningen af ​​American Thoracic Society som modificeret af Casson et al. [14] Alle resektion prøver blev vurderet af en højtstående patolog.

Postoperativ opfølgning blev udført som del af den sædvanlige efterbehandling. Patienterne blev set på ambulatoriet på 3 til intervaller 4 måneder for de første 2 år og 6 måneders intervaller derefter. Opfølgning evaluering omfattede fysisk undersøgelse, almindelig brystet røntgen, abdominal ultralyd, endoskopi, endosonography, CT af brystet og maven, med PET-CT efter januar 2006 udvalgte tilfælde, CEA og CA 19-9 tumormarkør undersøgelser, og knogleskanninger . Når tilbagefald var mistænkt, ekstra radiologisk, endoskopisk eller histologisk bekræftelse søgt.

Gentagelse blev diagnosticeret, hvis bevist ved biopsi eller ved utvetydige beviser for tumor masse (nyligt vises metastaser eller lokalt recidiv) med en tendens til at vokse i løbet af yderligere opfølgning og /eller opfølgning indtil døden. Tilbagevendende sygdom blev defineret som enten locoregional (forekommer i det øvre abdomen eller mediastinum) eller som fjernmetastase.

mikrometastase farvning

Hematoxylin og eosin-farvning blev anvendt til tumorcelle detektion i et første diagnostisk trin . Histologisk “tumor-fri” lymfeknuder blev derefter screenet immunohistokemisk anvendelse af anti-cytokeratin-antistof AE1 /AE3 (Dako, Glostrup, Danmark) fortyndet 1:50 (v /v) af biotin-streptavidin fremgangsmåde som tidligere beskrevet. [15] AE1 /AE3 er en cocktail af to antistoffer, som genkender basiske og sure CK er på overfladen og i cytoplasmaet af alle epitelceller (undtagen parietalcellerne, hepatocytter og de overfladiske lag af pladeepitel). Antistofferne reagerer ikke med mesenkymvæv, herunder lymfevæv [16].

formalin-fikserede og paraffin-indlejrede sektioner af 5 til 6 um tykkelse blev skåret på tre forskellige niveauer i hvert knudepunkt og deparaffineret ifølge standard histologiske teknikker og overført på objektglas behandlet med 3-triethoxysilylpropylamin (Merck, Darmstadt, Tyskland). En sektion af prøve opnået på hvert niveau blev farvet under anvendelse af alkalisk phosphatase-anti-alkalisk phosphatase teknik kombineret med den nye fuchsin farvning (Sena, Heidelberg, Tyskland) til visualisering reaktionen [17]. Salg

Dele af normal colon mucosa tjente som positiv farvning kontrol og isotype-matchet, irrelevante murine monoklonale antistoffer tjente som negative kontroller (oprenset immunoglobulin muse myelom-protein til IgG1, Sigma, Deisenhofen, Tyskland).

objektglassene blev evalueret i et blindet procedure af to uafhængige undersøgere. I tilfælde af inkongruente fund tredjedel investigator blev hørt, og en konsensus beslutning blev taget. Minimal tumorcelle involvering i en lymfeknude, der blev anset for at være tumor-fri ved konventionel histologisk farvning blev defineret som tilstedeværelse af en til ti positive celler i kroppen for knuden.

Prøveforberedelse og oprensning

Isolering af totalt RNA fra flydende nitrogen frosset lymfeknude prøver blev udført med Trizol fra Invitrogen ifølge producentens protokol (Rev. dato 12. juni 2007) og blev oprenset bagefter med Qiagen RNeasy-Mini-Kit. Koncentrationer blev bestemt med en PeqLab NanoDrop fotometer og RNA kvalitet ved kapillarelektroforese under anvendelse af en Agilent Bioanalyzer 2100 System. Ud af de 22 prøvepar 9 par patienter med observeret langt metastase og 5 prøve par patienter uden langt metastase observeret viste en tilstrækkelig for den følgende analyse RNA kvalitet.

microarray analyse

Microarray eksperimenter blev udført under anvendelse af Affymetrix human hele genomet GeneChips U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, USA) i overensstemmelse fabrikantens protokol. For at forberede RNA til ekspression arrays cDNA-syntese med forudgående fotometrisk bestemmelse af RNA-koncentrationen blev udført. udførtes de følgende trin under anvendelse af 250 ng af total RNA for den første streng syntese. Prøvefremstilling inkorporeret trin til cDNA-syntese, oprensning, syntese af biotin-labled cRNA, in vitro-transkription, fragmentering, hybridisering samt vask og farvning. Fremstillingen blev udført ifølge den ene cyklus protokol under anvendelse af GeneChip 3 ‘IVT Express Kit fra Affymetrix. Til hybridisering 12,5 ug fragmenteret cRNA blev anvendt. Arrayene blev inkuberet i 16 timer i Affymetrix Hybidization Ovn 640 ved 45 ° C. Vask og farvning trin blev udført halvautomatisk i Affymetrix Fluidik Station 450, de enkelte trin efter Affymetrix One Cycle Protokol til standard arrays. Efter vask og farvning af arrays blev scannet ved hjælp af Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G og softwaren kommandokonsollen ved en bølgelængde på 570 nm og en pixelstørrelse på 1,56 um.

Statistisk analyse

Lymfeknuder fra begge patientgrupper (PN0 og PN1) blev analyseret uafhængigt af hinanden. Da fokus i dette arbejde var tidlige ændringer forud metastase, blev analyseret kun metastase gratis lymfeknuder. Tumoren fjernt lymfeknuder prøver blev anvendt som reference for de parrede regionale lymfeknuder.

Baggrund korrektion og normalisering blev udført ved hjælp af RMA procedure og fraktil normalisering. En parret t-test inden for de to grupper (PN0, PN1) blev udført, og en bootstrapping procedure blev udført for at justere for falske positive bestemmelser. Som cutoffværdier en korrigeret p-værdi på 0,05, en rå p-værdi på 0,01 og et signal-log-ratio (SLR) på ± 0,7 blev anvendt til at bestemme top regulerede gener.

Efter differentiel genekspression analyse, vi udførte gen sæt berigelse og netværksanalyse med Ingenuity Pathway Analysis software (Ingenuity Systems, versionen 162.830). Til analysen den korrigerede p-værdi cutoff blev sat til en mindre streng værdi på ± 0,1 for at muliggøre inkorporering af mere subtile ændringer.

Validering via RT-PCR

Tolv af det fastslåede kandidatgener blev valideret via RT-PCR ved hjælp af tre tekniske replikater per prøve. RT-PCR blev udført med 96-brønds plader på StepOne Plus real time PCR System fra Applied Biosystems. For hver prøve 2 pi med en koncentration på 5 ng /pl blev anvendt. For at tage højde for udsving i koncentrationen prøve Beta-2-mikroglobulin (B2M) blev taget som husholdning reference. Til bestemmelse af reglerne om ekspressionsniveauet middelværdien af ​​de tre tekniske gentagelser ‘delta-Ct-værdier blev beregnet. Betydningen af ​​ændringerne blev bestemt ved anvendelse af en parret t-test mellem tumor tætte og tumor fjerne gennemsnitlige delta-Ct-værdier inden for hver gruppe (PN0, PN1).

DKK1 Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført på paraffinsnit af de undersøgte lymfeknuder hjælp polyklonale antistof mod DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034). Til immunohistokemisk påvisning snit blev deparaffineret, rehydreret, og forbehandlet med 0,1% pronase, i 10 minutter til enzymatisk antigen demaskering. Efter inkubering i 3% hydrogenperoxid i 15 min for at blokere endogen peroxidaseaktivitet og inkubering med 5% BSA i 30 minutter for at blokere ikke-specifik antistofbinding primært antistof blev anvendt. Immunhistokemisk farvning blev udført natten over ved 4 ° C. Et biotinyleret sekundært ged anti-kanin IgG (1:200, Dako Cytomation) blev anvendt, efterfulgt af inkubation med et streptavidin /HRP (1:200, Dako Cytomation) som et tredje antistof. Peroxidase aktivitet blev påvist under anvendelse af DAB som kromogent substrat (Dako Cytomation). Snit blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret, og monteret. Billeder blev opsamlet på en Zeiss Mirax MIDI slide scanner (Zeiss) og billeder blev taget med Pannoramic Viewer-softwaren.

Resultater

Metastase-fri regionale lymfeknuder forskellige mellem PN1 og PN0 patienter på transkriptom niveau

Vi spurgte, om a) den metastatisk niche i lymfeknuder kan være påvirket, selv før metastaser har fundet sted, og hvis b) stadig metastase-fri lymfeknuder i PN1 patienter kan være mere på randen af ​​metastatisk invasion end disse af PN0 patienter og hvis c) derfor disse “PN1” lymfeknuder kan udvise særskilte transkriptionelle deregulering forbundet med niche forberedelse

Vi inkluderet tumor regionale lymfeknuder fra 14 esophageal carcinoma patienter (n = 9 PN1 patienter.; n = 5 PN0 patienter) for at undersøge genekspression i den potentielle metastatisk niche. Desuden indsamles vi en parret tumor fjernt lymfeknude fra hver patient for at tjene som reference for de regionale lymfeknuder (fig. 1). Bagefter blev de analyseret på transkriptom niveau ved microarray-teknologi.

Nøglen til det arbejde, der præsenteres her, er, at alle knuder undersøgte blev bekræftet at være histopatologisk og immunhistologisk metastase og mikrometastase-fri, uafhængig af patienternes PN1 /PN0 klassificering og af placeringen i forhold til tumoren. Dette skulle gøre det muligt at identificere tidlige ændringer forekommende

før

til metastaser målsøgende. Information om patienters alder, køn, histologi eller klassifikationer findes i tabel S1.

For at identificere de potentielle præ-invasive ændringer, vi sammenlignede de regionale lymfeknuder med de fjerne lymfeknuder ved hjælp af en parret T-test inden for to grupper (PN0, PN1). Tumoren fjernt lymfeknuder tjente som reference for de regionale knudepunkter, således at op-regler skildrer disse gener med et højere udtryk niveau i de regionale knudepunkter og ned-regler henholdsvis disse gener med et lavere udtryk niveau. T-test blev efterfulgt af en bootstrapping at tage højde for multipel testning. Som cutoffværdier en korrigeret p-værdi på 0,05, en rå p-værdi på 0,01 og et signal-log-ratio (SLR) på ± 0,7 blev anvendt til at bestemme top regulerede gener. De væsentligste kandidater identificeret er vist i tabel 1, er fuldstændige statistikker i tabel S2.

Anvendelse af disse tærskler, vi identificerede 173 udskrifter (128 gener) betydeligt reguleres mellem regionale og fjernt lymfeknuder af pN0- klassificerede patienter. Adskillige af disse gener var forbundet med immunrespons (såsom CD64, CD32,

FPR1

FPR2

, [18]

IGHG1

,

IL1R2

,

CCL23

,

MSR1

,

C5AR1

,

LILRA5

, [19] eller

LILRB2

[20]). Interessant et par kræft og metastase tilhørende gener blev dereguleret samt (såsom

L1CAM

(CD171), [21]

ereg

, [22], [23]

NOVA1

,

HPR

, [24] eller

LAMC2

[25], [26]). Epiregulin, fx er en angiogen faktor, der kan udbrede metastaser ved at aktivere tumorceller at bryde lunge endotel barrierer og til gengæld ved at frigive dem i omløb systemet [22], [23].

I modsætning identificerede vi 134 dysregulerede udskrifter (109 gener, herunder

IGF1

,

DKK1

,

PRIMA1

og

LTF

) i de regionale lymfeknuder i PN1-klassificerede patienter. Blandt de gener pro-proliferative og anti-apoptotiske molekyler blev nedreguleret – såsom

IGF1

LTF

der virker gennem regulering af AKT signalvejen [27] og ERK1 /2-vejen [28] hhv. PRIMA1 modulerer CXCR4 udtryk [29] -. Et molekyle, der allerede er blevet beskrevet at korrelere stærkt med øget lymfatisk metastaser [11], [12], [29]

Især

DKK1

udstillet mest betydelige deregulering (2-gange ændring; p-værdi på 0,0029). Genet blev klart nedreguleret i de regionale lymfeknuder fra PN1 patienter. DKK1 er en WNT pathway inhibitor, der har vist sig at være af prognostisk betydning i forskellige tumor-enheder såsom brystcancer, lungecancer, myeloma, men også i esophageal carcinoma [30] – [38]. Desuden DKK1 blev rapporteret at være forhøjet i serum fra ESC patienter [37].

Vi valideret 12 af de mest betydningsfulde gener via RT-PCR (fig. 2). For fem af disse gener (

ISL1

,

LAMC2

,

NOVA1

,

ereg

,

L1CAM

) Forordningen tendenser og styrker blev bekræftet selvom p-værdier bestemt i PCR-analyse varierede mellem 0,08 og 0,15, sandsynligvis på grund af den lille stikprøve. Syv gener (

IGF1

,

IGFBP5

,

DKK1

,

LTF

,

TBX3

,

FOXG1

,

LILRA

) kunne valideres med succes viser en signifikant p-værdi under 0,05. Højeste signifikans (p-værdi på 3 * 10e-4) blev observeret igen til

DKK1

(se tabel S3).

Viste signal–log-forhold af de regionale lymfeknuder i sammenligning til tumor fjernt lymfeknuder (reference) for et udvalgt sæt af top regulerede gener.

på tidspunktet for opfølgende analyser fem PN1 patienter var døde samt en PN0 patient. Sidstnævnte patient havde udstillet lunge metastase i en opfølgende undersøgelse. Interessant denne patient udgør en outlier i form af

DKK1

udtryk viser en nedregulering i de regionale lymfeknuder.

Resultaterne beskrevet i dette afsnit, viser, at disse metastase-fri PN1 lymfeknuder udviser gen regler klart forskellige fra de i PN0 lymfeknuder. Desuden indikerer de, at DKK1 kan være signifikant associeret med de underliggende mekanismer.

De funktionelle mønstre i PN0 og PN1 prøver er forskellige, men tæt forbundne

Baseret på disse resultater, vi spurgte, om de observerede forordninger faktisk skildrer forskellige molekylære mekanismer – eller blot forskellige repræsentanter for de samme mekanismer. Vi udførte derfor gen sæt berigelse og netværksanalyse.

Fordi prøvestørrelse bruges i vores arbejde er temmelig lille p-værdien fordelingen påvirkes i T-test. Under hensyn til dette og for at give mulighed for indarbejdelse af mere subtile ændringer, som ikke desto mindre kan føje til det store billede, besluttede vi at bruge en mindre streng p-værdi på ± 0,1 for at identificere regulerede gener, der skal indgå i analysen.

Vores analyse viste påfaldende forskellige profiler (fig. 3), der kendetegner de tumor-tilstødende lymfeknuder i PN1 og PN0 patienter. Resultaterne viste en klar aktivering af immunrespons mekanismer i PN0 gruppen. De regulerede gener blev forbundet med øget inflammatorisk respons, antigenpræsentation, reduceret cellulær vækst, immuncelle sporing og celle-til-cellesignalering, mens proliferation og cancerassocierede mekanismer blev reduceret. Salg

vises er biologiske og molekylære funktioner og delfunktioner associeret med generne reguleret i regionale lymfeknuder i sammenligning med de fjerntliggende lymfeknuder (reference) af PN1 eller PN0 patienter. De enkelte gennemsigtige cirkler skildrer de vigtigste funktioner, den farvede (rød: aktiveret, blå: inaktiveret) kredse inden skildrer de væsentligt beriget sub-funktioner (f.eks inden PN1 celledød cirkel: “apoptose af leukæmi-cellelinjer ‘- rød eller’ celle overlevelse ‘- blå). Blå delfunktioner har en stærk forudsigelse skal inaktiveres, røde sub-funktioner, der skal aktiveres. Jo dybere farve mere pålidelig (z-score) er aktiveringen statens forudsigelse. Størrelsen af ​​cirklerne stiger med signifikans (p-værdi) af genet listen associering sub-funktioner. Analysen blev udført med Ingenuity Pathway Analysis software. Det kan tydeligt ses, at metastase-fri regionale lymfeknuder fra PN1 patienter udviser en helt anden regulering-mønster, at de af PN0 patienter.

I modsætning regionale lymfeknuder fra PN1 patienter udviste en reduktion af immun respons forbundet mekanismer (fig. 3). Desuden blev reduceret proliferation samt reduceret vævsstruktur, morfologi og udvikling observeret på den ene side – og øget apoptose og hypoplasi på den anden. Tid klogt det må forventes, at disse lymfeknuder ville være tættere på det punkt af metastatisk invasion, så det var overraskende, at immunresponset mønster blev nedreguleret.

Endvidere analysen forudsagde en inaktivering af β-catenin og downstream regulatorer (fig. 4a). Blandt de store β-catenin mål,

VEGFA

,

CCND1

,

MSX1

,

IGFBP5 og DKK1

udviste en nedsat udtryk på microarray. Selvom kun baseret på statistiske sandsynligheder, forudsigelsen er bemærkelsesværdig, fordi aktiv β-catenin er nødvendig for

DKK1

udtryk. [39] Den potentielle inaktivitet β-catenin derfor kunne korrelere med den observerede nedregulering af

DKK1

.

netværket blev udført ved hjælp Ingenuity Pathway Analysis software. a) Mekanismestudier netværk af β-catenin downstream regulatorer Viser forudsagt aktivering tilstand og de lovgivningsmæssige forhold (aktivering eller hæmning) mellem de enkelte regulatorer. β-catenin og en række nedstrøms regulatorer forudsiges at blive inaktiveret. b) Analysen viser en tæt sammenhæng mellem de gener, der reguleres i PN1 prøver (lysegrå noder), og dem reguleres i PN0 prøver (mørkegrå noder) forbundet af ERK1 /2 og DKK1 indlejret i netværket.

for yderligere at undersøge, hvordan relaterede de underliggende molekylære veje er, vi medtaget de genekspression regler observeret i PN1 prøver (109 gener) og i PN0 prøver (128 gener) i en fælles liste og udførte netværksanalyse. Interessant, på trods af den klare forskel i molekylære mekanisme profiler mellem PN1 og PN0 prøver, analysen viste, at flere af de involverede gener (28/128 PN0 gener, 19/109 PN1 gener) syntes at være tæt forbundet (figur 4b.) På tværs af både grupper -. med DKK1 indlejret i netværket

taget sammen disse observationer tyder på, at metastase-fri regionale lymfeknuder i PN1 patienter er allerede underlagt molekylære processer end dem af PN0 patienter – selvom metastaser endnu ikke har fundet sted i disse knudepunkter. Desuden virker mere plausibelt en inddragelse af

DKK1

regulering via WNT /β-catenin vej. Når dette er sagt, de molekylære netværk bag disse forskellige mønstre kan være tilsluttet. I ESC patienter lymfeknude metastaser er kun et spørgsmål om tid, medmindre en rettidig tumor resektion udføres. Det synes derfor sandsynligt, at de observerede transkriptionelle mønstre ikke korrelerer med to helt forskellige mekanismer, men snarere skildrer to tidspunkter af en fremadskridende proces.

DKK1 kan observeres i forskellige underlag af lymfeknude og i fartøjet endotelceller

på grund af betydningen af ​​

DKK1

i vores resultater, og fordi DKK1 allerede har vist sig at være prognostisk for udfaldet af en række maligne tumor enheder [30] – [38] fokuserede vi på dette molekyle i immunhistokemisk validering. Vi farvede paraffinsnit af de undersøgte lymfeknuder anvendelse af et polyklonalt antistof mod DKK1 og modfarvet afsnittene med hematoxylin. Den immunhistokemisk farvning afslørede en tendens DKK1 at være mindre udtrykt i regionale PN1 patienters lymfeknuder (fig. 5A). I DKK1 positive lymfeknuder dets ekspression kunne tydeligt ses i subkapsulær sinus og i nogle tilfælde strækker sig ind i formidlende sinus og trabekler (fig. 5b). Endvidere i et par prøver DKK1 udtryk kunne observeres i beholder endotelceller (fig. 5c).

Lymfeknuder blev farvet ved hjælp af et polyklonalt antistof mod DKK1 (1:100, Abcam, # ab61034) og modfarvet med hæmatoxylin. a) repræsentant DKK1 negativ lymfeknude. Målestok: 200 um. b) repræsentant DKK1 positiv lymfeknude. Den subkapsulær sinus er markeret med (I) og det mellemliggende sinus og trabekler med (II). Målestok: 200 um. c) DKK1 positive vaskulære endotelceller. Målestok:.. 100 um

Diskussion

Mens flere kræft incidensrater faldt i USA og andre vestlige lande i de seneste årtier incidensraten af ​​esophageal adenocarcinom er steget [ ,,,0],40] One parametre indikerer sygdomsprogression er tumorekspansion der i øjeblikket danner grundlag for udvælgelse terapi.