PLoS ONE: Effektiviteten af ​​histondeacetylaseinhibitoren (S) -2 mod LNCaP og PC3 Menneskelig Prostata Cancer Cells

Abstrakt

histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) repræsenterer en lovende klasse af epigenetiske agenter med kræft egenskaber. Her rapporterer vi, at (S) -2, et hidtil ukendt hydroxamat-baserede HDACi, tidligere vist at være effektiv mod akut myeloid leukæmi-celler, var også en potent inducer af apoptose /differentiering i humane prostata LNCaP og PC3 cancerceller. I LNCaP-celler (S) -2 var stand til at udløse H3 /H4 histonacetylering, H2AX phosphorylering som en markør for DNA-skader og producerer G

0 /G

1 cellecyklusstandsning. Konsekvent, (S) -2 førte til forøget ekspression af begge protein og mRNA p21 niveauer i LNCaP celler, men i modsætning til SAHA, ikke i normale ikke-tumorigene prostata PNT1A celler. Mekanistiske undersøgelser viste, at (S) -2-induceret apoptose i LNCaP-celler udvikles gennem spaltning af pro-caspase 9 og 3 og af poly (ADP-ribose) -polymerase ledsaget af den dosisafhængige tab af mitochondriemembranpotential. Faktisk tilsætningen af ​​den pan-caspase inhibitor Z-VAD-fmk stærkt reduceret drug-medieret apoptose medens antioxidant

N

acetyl-cystein var næsten ineffektive. Vigtigere, foreløbige data med nøgne mus xenotransplanteret med LNCaP-celler viste, at (S) -2 bedt et fald i tumorvolumen og en stigning i H2AX phosphorylering inden kræftcellerne. Desuden er de meget metastatisk prostatacancer PC3-celler var også følsomme over for (S) -2, at: i) induceret vækststandsning og moderat apoptose; ii) styrende celler mod differentiering og neutralt lipid akkumulering; iii) reduceret celle invasionsevne potentiale ved at nedsætte mængden af ​​MMP-9-aktivitet og opregulere TIMP-1-ekspression; og iv) hæmmede celle motilitet og migration gennem Matrigel. Samlet, (S) -2 har vist sig at være en kraftfuld HDACi stand til at inducere vækststandsning, celledød og /eller differentiering af LNCaP og PC3 prostatacancerceller og på grund af dets lave toksicitet og virkning

in vivo

, kan også være af klinisk interesse at støtte konventionel prostatakræft terapi

Henvisning:. Laurenzana A, Balliu M, Cellai C, Romanelli MN, Paoletti F (2013) Effektiviteten af ​​histondeacetylaseinhibitoren (S) -2 mod LNCaP og PC3 menneskelige prostata cancer celler. PLoS ONE 8 (3): e58267. doi: 10,1371 /journal.pone.0058267

Redaktør: Chunhong Yan, Albany Medical College, USA

Modtaget: 16. april, 2012; Accepteret: 5 feb 2013; Udgivet: 4 mar 2013

Copyright: © 2013 Laurenzana et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra MIUR (Undervisningsministeriet, universiteter og forskning PRIN 2006 til FP, # 200.606.139), University of Florence, Italien (tidligere 60% 2009 og 2010 til FP og MNR), Ente Cassa di Risparmio di Firenze 2007- 9 (Firenze, Italien; # 2007,1019 til FP) og Associazione Italiana contro le Leucemie, Linfomi e Mieloma (AIL) sezione di Firenze til FP. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epigenetisk ændringer er reversible kromatin omlejringer stand til at modulere genekspression i cellen uden at ændre DNA-sekvens. Acetylering er den mest undersøgte post-translationel modifikation af histonproteiner [1] på grund af den afbalancerede aktivitet af to familier af enzymer, nemlig histonacetyltransferaser (hat) og histondeacetylaser (HDAC), der katalyserer acetylering /deacetylering af histoner, henholdsvis og derved modificere chromatin konformation og DNA tilgængelighed til transskriptionsfaktorer [2], [3], [4]. Desuden, hatte og HDAC bidrager til modulerende genekspression ved direkte interaktion med nonhistone vigtige regulatoriske proteiner [5] som p53, GATA1, GATA2, retinsyrereceptor, NF-kB og cytoskeletproteiner som α-tubulin [6], [7], [8]. Det er ikke overraskende, derfor, at afvigende aktiviteter af disse enzymer kan undertrykke transskription af specifikke kræftpsykologisk suppressor gener og bly i sidste ende til tumordannelse [9], [10]. Og ja, histon hypoacetylation, på grund af overekspression af HDAC, har en anerkendt rolle i tumorigenese forskellige kræftformer, der påvirker mave [11], kolon [12], [13], bryst [14] og prostata [15], [ ,,,0],16], [17].

med særlig hensyn til prostatakræft, dette er den hyppigst diagnosticerede non-kutant malignitet og den tredje hyppigste årsag til kræft dødsfald blandt mænd i den vestlige verden. Selv om en række behandlingsmuligheder er tilgængelige for tidlig prostatacancer hos patienter tilbagefald fra primær behandling med kirurgi og /eller strålebehandling, eller præsentere metastatisk sygdom, androgen deprivation stadig grundpillen i behandlingen. Men på trods af androgen ablation, stort set alle tumorer med tiden fremskridt med kastrationsresistent sygdomme [18], [19], [20], som skal behandles med konventionelle cytotoksiske eller epigenetiske midler såsom HDAC-hæmmere (HDACi). Sidstnævnte er dukket op som en ny klasse af kraftige anticancermidler stand til at fremkalde tumorcellevækst anholdelse, differentiering og /eller apoptose [16], [17]

in vitro

og fungerer som strålingssensibiliserende i cancerceller ved ned -regulating DNA-reparation aktivitet [21], [22], [23]. Nogle af disse HDACi viste imidlertid flere begrænsninger

in vivo

grund af deres høje toksicitet, lav opløselighed, og korte halveringstider [24], [25]. Derfor udvikler roman HDACi med anticancer egenskaber og lav-toksiske profiler er et afgørende mål for translationel forskning.

Vi har tidligere rapporteret et nyt sæt af potente hydroxamat-baserede HDACi karakteriseret ved en 1,4-benzodiazepin ring ( BDZ) anvendt som hætten og forbundet, via en tredobbelt binding forbindelsesenhed, til en lineær alkylkæde bærer en hydroxamsyre funktion som Zn

++ – chelaterende gruppe [26]. Blandt disse hybrider, en i særdeleshed, MC133 (S) -2 [herefter (S)

– Kreis 2] viste sig at være en meget effektiv pro-apoptotisk middel mod forskellige kulturperler og primær akut myeloid leukæmi (AML) celler

in vitro

ex vivo

, og var næsten sikkert at mus

in vivo

op til 150 mg /kg /uge [27].

i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi antitumor potentiale af (S) -2 i to af de mest undersøgte humane epiteliale prostatakræft-cellelinier, nemlig androgen-sensitive LNCaP og androgen-ufølsomme og stærkt metastatisk PC3, ved anvendelse af det humane tumorigen PNT1A prostata epitelceller som kontrol. (S) -2 hæmmede prostatakræft celleproliferation, inducerede en større apoptotisk respons sammenlignet med SAHA (eller Vorinostat; en af ​​de bedst præsterende HDACi godkendt af FDA til behandling af kutant T-celle lymfekræft) [28], [29] i LNCaP-celler og i mindre grad også i stærkt metastatiske PC3 celler, hvis migration og invasionsevne egenskaber blev drastisk reduceret med lægemidlet. I modsætning hertil normale epitel prostata PNT1A celler var næsten lægemiddel ufølsomme. Vigtigere er det, (S) -2-induceret apoptose i LNCaP celler udvikles gennem en caspase-afhængig mekanisme.

Materialer og metoder

Cell Kultur og behandlinger

nonnmetastatisk LNCaP og metastatisk PC3 prostatacancerceller, og de menneskelige tumorigen prostata epitelceller PNT1A celler en slags gave fra P. Chiarugi (afd Biokemiske Sciences, University of Florence), som opnåede de cellelinjer fra European Collection of Cell Cultures [30]. Humane prostata celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). Celler blev holdt ved 37C ° i 5% CO

2 fugtig atmosfære. (S) -2 og SAHA (eller Vorinostat; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [28], [29] blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO; Sigma-Aldrich) ved 0,1 M koncentration og lagret i mørke ved stuetemperatur (RT). Arbejdsdage lægemiddelopløsninger blev opnået ved passende fortynding af stamopløsningen med dyrkningsmediet. DMSO blev anvendt som vehikel til en endelig dosis på ≤0.1% (v /v) i kultur i både (S) -2 og SAHA. I caspase inhiberingseksperimenter Z-VAD-fmk (R Sigma-Aldrich) blev tilsat i kultur 2 timer før (S) -2 tilføjelse.

Cell Cycle Analysis

Prostata celler blev behandlet i 24 timer uden /med 2,5 pM stof, resuspenderes derefter i en propidiumiodid /RNase opløsning (BD PharMingen, San Diego, CA) og inkuberet ved stuetemperatur i mørke i 15-30 min. Procentdelen af ​​celler i forhold til G

0 /G

1, G

2 /M, og S-fasen blev bestemt ved hjælp af Becton Dickinson FACSCalibur System.

Western blotting

Høstede celler blev resuspenderet i 20 mM RIPA-buffer (pH 7,4) indeholdende en cocktail af proteinaseinhibitorer (Calbiochem, Merck, Darmstadt, Tyskland) og behandlet ved lydbehandling (Microson XL-2000 Minisonix, Farmingdale, NY, USA) . Proteiner blev analyseret ved BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), analyseret ved SDS-PAGE og western blotting som rapporteret andetsteds [31]. Membraner blev probet med primære antistoffer mod: acetyl-H3, acetyl-H4, og H4 (Upstate Biotechnology, Millipore, Bilerica, MA, USA); PARP, γ-H2AX, H2AX, H3 og Caspase 9 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); α-tubulin og acetyleret α-tubulin (Sigma-Aldrich), caspase 3 og p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Egnede peroxidasekonjugerede IgG præparater (Sigma-Aldrich) er blevet anvendt som sekundære antistoffer; ECL procedure blev anvendt til udvikling.

Kvantificering af mitokondrie Membrane Potential

For at bestemme ændringer i narkotika-induceret transmembrane mitokondrie membranpotentiale (A ^ m), er cellerne blevet farvet med JC-1 (Invitrogen , Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), en kationisk farvestof, der udviser potentiale-afhængig akkumulering i mitokondrier, indikeret ved en fluorescensemission skift fra grøn (525 ± 10 nm) til rød (610 ± 10 nm). LNCaP-celler (0,5 x 10

6) blev behandlet uden /med 2,5 og 5 uM (S) -2 i 72 timer og derefter resuspenderet i RPMI 1640 indeholdende 15 ug /ml JC-1 farvestof i 30 min ved stuetemperatur i mørket; efter at cellerne blev vasket, og fluorescensen blev målt ved flowcytometri. Mitokondrier depolarisering er specifikt angivet ved et fald i rød til grøn fluorescens intensitet forholdet [32].

Caspase 3 Aktivering Assay

Prostata kræftceller (10

5 celler /ml) var inkuberet med 2,5 uM (S) -2 i 48 timer og derefter underkastet den carboxyfluorescein FLICA Apoptose Detection Kit Caspase-assay (caspase 3 FLICA, Immunochemistry Technology, Bloomington, MN, USA). Celler blev farvet med FAM-DEVD-FMK FLICA reagens opløst i PBS i 1 time ved 37 ° C, og vasket to gange i PBS før udførelse af cytofluorimetrisk assay.

gelzymografi

Analyse af gelatinase (MMP-9) aktivitet blev udført som tidligere beskrevet [33]. Kort fortalt blev PC3-celler udsået i 6-brønds plader og behandlet med stigende mængde af (S) -2 i serum-frit medium i 24 timer. Alikvoter af konditionerede medier (CM) blev blandet med 4 x (v /v) prøvebuffer (0,25 mol /l Tris-HCI, pH 6,8, 0,4% SDS, 40% glycerol og bromphenolblåt), derefter sat på en 10% SDS gel indeholdende 1 mg /ml gelatine (Sigma-Aldrich) og kørt under ikke-reducerende betingelser ved konstant spænding på 125 V. efter elektroforese blev gelen inkuberet i renaturering buffer (2,5% Triton X-100) ved stuetemperatur i 30 minutter , vasket to gange med destilleret vand (10 min hver gang) og derefter inkuberet med det udviklende buffer (50 mmol /l Tris, pH 8,0, 5 mmol /l CaCh

2, 0,2 mol /l NaCl og 0,02% Brij-35 ) ved 37 ° C ° natten over, farvedes i 0,5% Coomassie Blue-opløsning i 2 timer og affarvet med en opløsning [5% eddikesyre, 10% methanol (vol /vol) i destilleret vand], indtil bånd af gelatinolytisk aktivitet blev visualiseret og derefter målt ved densitometrisk analyse med Image J software.

sårheling Assay Salg

PC3 celler blev dyrket i 6-cm plader indtil konfluens og derefter monolaget blev ridset med en fin steril pipettespids til at producere en smal viklet i substratet. Mediet og debris blev aspireret væk og erstattet med frisk medium i nærvær af forskellige koncentrationer af (S) -2. Billeder blev taget før og 24 timer efter sårede ved hjælp af et Nikon E 4500 photocamera (Nikon) på et Nikon TMS-F fasekontrastmikroskop (Nikon Instruments, Firenze, Italien).

invasiv Assay

til disse eksperimenter blev anvendt Boyden-kamre, hvor de øvre og nedre brønde blev adskilt af Porus polycarbonatfiltre overtrukket med matrigel (50 ug /filter) (Becton Dickinson, BD, New Jersey, USA). Kulturer blev forbehandlet med /uden (S) -2 (2,5-5 uM) i 24 timer og derefter Alikvoter af PC3-celler (20 × 10

3) blev overført i det øvre rum af kammeret. Celle invasiv kapacitet blev evalueret efter 6 timer og udtrykt som det absolutte antal ± SD af celler til stede på filtrene; fem forskellige mikroskopiske felter for hver betingelse er blevet undersøgt.

Oil Red O Farvning for neutrale lipider

blev påvist Neutrale lipider (i) histokemisk [34] på cellemonolag der blev hurtigt fast med? -? 0 ° C methanol, farvet med Oil Red O (ORO) (Sigma-Aldrich), og (ii) spektrofotometrisk (Cary 50 Scan, Varian, Victoria, Australien) ved 510 nm ved at registrere absorbansen af ​​cellebundet ORO efter ekstraktion med isopropanol [35], [36]. ORO akkumulation blev udtrykt som relativ absorbans enhed /mg celle protein.

Kvantitative Real Time-PCR analyse

QRT-PCR blev udført med omvendt transskriberet cDNA af ubehandlet og behandlede celler ved hjælp af Applied Biosystems 7500HT ifølge standardprotokoller. Fold af p21, MMP-9 og TIMP-1-induktion blev beregnet ved ændringerne af p21 eller MMP-9 eller TIMP-1 Ct-værdier i behandlede

versus Salg ubehandlede celler og blev normaliseret til den 18S rRNA Ct Amplifikation var udført med standard PCR indstilling: 40 cykler af 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 60 sek ved anvendelse af en SYBR Green baseret detektion (SYBR Green Master mix; Applied Biosystems) og de følgende primere: til p21, frem 5 ‘ -CTGCCCAAGCTCTACCTTCC-3 ‘? og revers 5′-CAGGTCCA CATGGTCTTCCT-3′; for MMP-9 fremadrettet 5’-GCTACCACCTCGAA CTTTGAC-3 ‘og revers 5′-TGCCGGATGCCATTCAC-3′; for TIMP-1, fremadrettet 5’-CCAACAG TGTAGGTCTTGGTGAAG-3 ‘og revers 5′-CTGTGGCTCCCTGGAACA-3’; og for 18S rRNA, frem 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 ‘? og omvendt 5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’.

Indledende

in vivo

Forsøg med et Murine xenograftmodel

protokollen og resultater vedrørende denne indledende tilgang til

in vivo

eksperiment er blevet rapporteret under afsnittet på supplerende oplysninger (Figur S1).

Statistisk analyse

den studerendes

t

-test eller envejs variansanalyse blev anvendt til at vurdere den statistiske signifikans af resultaterne. Forskellen mellem de værdier, blev betragtet som signifikant på

P

≤ 0,05.

Resultater

(S) -2 Beder LNCaP Celler til G

0 /G

1 cellecyklusstop og ændringer i morfologi

LNCaP celler, dyrket uden /med stigende (s) -2 koncentrationer (1, 2,5 og 5 uM) op til 72 timer, undergik en dosis- og tidsafhængig vækststandsning at nå 50% af inhibering efter to dages inkubation med 1-2,5 uM (S) -2; henviser i kulturer behandlet med 5 pM antallet af levedygtige celler faldt betydeligt til niveauer langt under den begyndende udpladningsdensitet (figur 1A). Virkningen af ​​(S) -2 på LNCaP cellecyklusprogression som målt ved flowcytometri viste, at en 24 h-eksponering for 2,5 uM lægemiddel steget betydeligt procentdelen af ​​celler i G

0 /G

1 (fra 59 til 93%) og lavere cellepopulation i S-fase (fra 29 til 2%) (figur 1B, øverst). I addittion, efter behandling, den typiske morfologi af LNCaP-celler ændret til en spindel-formet, temmelig forstørret fænotype til opnåelse monolag, der blev karakteriseret ved en delvis celletab og reduceret kontakter blandt resterende celler (Figur 1B, midten). Konsekvent, cellecyklus-inhibitor p21 protein – rapporteret at være op-moduleret af HDACi [37] – augmented i en tidsafhængig måde som respons på 2,5 uM (S) -2; proteinet blev påvist ud fra 6 timers behandling, steg efter 15 timer og toppede ved 24 timer (figur 1B, nederst)

(A) -. Celler (10

5) blev podet i 6- brønds plader og fastgøres natten. Den næste dag (S) -2 blev tilsat i de angivne koncentrationer (0-5 um) og levedygtige celler (trypan blu-negativ) blev talt ved hjælp af et Burker kammer langs de følgende tre dage. (B, øverst) – (S) -2 induceret G

0 /G

1 cellecyklusstop og forøget p21 udtryk. LNCaP-celler (2 x 10

5) blev behandlet med 2,5 uM lægemiddel i 24 timer, derefter blev løsnet og alikvoter af cellesuspensioner blev inkuberet med en propidiumiodid (PI) opløsning i 30 minutter og efterfølgende analyseret ved flowcytometri (DNA beløb, X-aksen, alt hændelser, Y-akse). Procentdelen af ​​celler i de forskellige faser af cellecyklussen blev beregnet ved ModFit program og vist i hvert panel. (B, midten) – Fase kontrast billeder af følgesvend kulturer viste, at (S) -2 inducerede morfologiske ændringer og et markant fald i celletæthed. (B, nederst) – Celler blev behandlet med 2,5 uM lægemiddel for de angivne tidspunkter og p21 proteinniveauer blev overvåget ved immunoblotting; GAPDH blev også undersøgt for at sikre lige belastning af prøver i hver bane. (C) – LNCaP-vækststandsning var ikke strengt afhængige af kontinuerlig tilstedeværelse af lægemiddel. Celler er blevet podet i 6-brønds plader (10

5 celler /brønd) og lodes binde natten over. Dagen efter kulturer blev tilsat uden /med 2,5-5 uM (S) -2 til 3d og derefter erstattet med medikamentfrit medium for yderligere 3d og sammenlignet med kulturer, hvor lægemidlet blev støt holdes op til 6d når levedygtige celler blev talt. Hver søjle repræsenterer middelværdien opnået fra tredobbelte brønde ± SD.

Endvidere vækststandsning af LNCaP udsat for (S) -2 var ikke strengt afhængige af kontinuerlig tilstedeværelse af lægemiddel. Denne antagelse stammer fra overvågning celleantal i kulturer behandlet uden /med 2,5 eller 5 uM (S) -2 til 3d og derefter erstattet med medikamentfrit medium for yderligere 3d, mens hos selskabsdyr kulturer lægemidlet blev støt opretholdt i 6d. Celler forblev praktisk standset selv efter stoffri medium udskiftning gav værdier som lignede dem af kulturer stadighed udsat for lægemidlet (figur 1C).

(S) -2-induceret apoptose i LNCaP celler afhænger af Aktivering af Caspase Cascade og Nedbrydning af mitokondriel Integritet

Blandt de tidlige HDACi-inducerede begivenheder på DNA-niveau der var dannelsen af ​​dobbeltstrengede brud (DSB) og phosphorylering af H2AX at give γ-H2AX der hjælper i DNA-skader reparation [38]. Svaret fra LNCaP-celler til (S) -2 som bestemt ved immunfarvning viste, at 2,5 uM lægemiddel signifikant forøgede γ-H2AX signal inden 6 timer, og disse niveauer blev temmelig opretholdt op til 24 timer ved at følge et mønster svarende til den i lægemiddel- induceret acetyl-H4 (figur 2A, top). Endvidere indtræden af ​​apoptose, som markeret ved spaltning af caspase substrat poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), blev påvist fra 15 timers behandling og steg støt i op til 48 timer (figur 2A, nederst), når ca. 80% af LNCaP-celler viste: (i) lægemiddel-medieret aktivering af caspase 3 (figur 2B) og (ii) dosisafhængig forskydning i JC-1 rød /grøn fluorescens-forhold til at betegne en gradvis spredning af det mitokondrielle transmembranpotentiale (a ^ m ) (figur 2C)

(A) -. Celler blev inkuberet med lægemidlet (2,5, 5 uM) for de angivne tidspunkter. Helcelle-ekstrakter blev analyseret ved Western immunblot til at påvise: phospho-H2AX, at den udløses efter DNA beskadigelse; PARP og dens spaltede fragment til at betegne apoptotisk activaction; og acetyl-h4 på grund af hæmning af HDAC-aktivitet. GAPDH og α-tubulin blev anvendt som indlæsning kontroller. (B) – Ubehandlede eller lægemiddelbehandlede celler (2,5 uM i 48 timer) blev inkuberet under de sidste 60 min med FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine, derefter skyllet to gange med PBS og deres grønne fluorescens blev målt ved flowcytometri. Frekvensen histogram af antallet af hændelser (Y-akse)

versus

fluorescein intensitet (X-akse) viste to toppe: caspase-negative celler (umærkede celler) var på venstre side af P2-område; mens caspase-positive celler, som blev mærket med Flica fundet sted inden for P2-regionen. (C) – Behandling med (S) -2 førte til en dosisafhængig mitokondrisk transmembranpotentiale (ΔΨ) dissipation. Denne virkning blev vurderet ved hjælp af JC-1 farvestof, der aggregerer i normale mitokondrier og udsender rød fluorescens, men det kan ikke ophobes i mitokondrier, som har mistet deres transmembranpotentiale, og udsender derfor en diffus cytoplasmatisk grøn signal i døde celler. Mitokondrie depolarisering er angivet med et fald i det rød /grøn (R /G) fluorescensintensitet forholdet [32]. Værdier er blevet normaliseret ved hjælp af styresignalet (kun køretøjet) som en arbitrær værdi på 100%. Hver søjle er gennemsnittet af to uafhængige forsøg udført in triplo. (D) – LNCaP-celler blev behandlet med (S) -2 (2,5-5 uM) eller med (S) -2 (5 uM) plus 15 mM N-acetylcystein (NAC) påført 2 timer før narkotikamisbrug. Aktivering af apoptose blev påvist ved spaltning af PARP og phosphorylering af H2AX og disse begivenheder samt den lægemiddel-medieret α-tubulin acetylering blev ikke kontrasteret af NAC. GAPDH blev brugt som reference protein. (E) – Z-VAD-fmk forhindrede lægemiddelinduceret spaltning af PARP og phosphoryleringen af ​​H2AX. LNCaP-celler blev behandlet som ovenfor, men i stedet for NAC blev kulturer præinkuberet med 30 pM Z-VAD-fmk i 2 timer før blive behandlet i 24 timer med medikamentet. Cellelysater blev analyseret for spaltningen af ​​PARP, aktiveringen af ​​caspase 3 og 9, H2AX phosphorylering samt acetylering af H4 og α-tubulin; α-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol.

Desuden at undersøge mekanismen af ​​(S) -2-induceret apoptose i LNCaP-celler, virkningerne af antioxidanten N-acetyl-cystein ( NAC) og af den pan-caspaseinhibitoren Z-VAD-FMK blev undersøgt hver for sig. Til forskel fra det rapporterede for AML-celler [27], tilstedeværelsen af ​​15 mM NAC i dyrkningsmediet var ikke stand til at formindske lægemiddelinduceret spaltning af PARP således udelukke en væsentlig rolle af reaktive oxygenarter (ROS) i lægemiddel-medieret apoptose (Figur 2D). I stedet eksperimenter udføres uden /med 30 pM pan-caspaseinhibitor Z-VAD-fmk afslørede, at denne forbindelse var i stand til at forhindre lægemiddel-medieret aktivering af caspase 9 og 3 samt af spaltningen af ​​PARP og stigning i γ-H2AX [ ,,,0],39], hvilket antyder, at (S) -2-induceret apoptose i LNCaP-celler udviklet gennem en caspase-afhængig mekanisme (figur 2E). Det er værd at bemærke, at narkotika-induceret acetylering af H4 og α-tubulin ikke blev hæmmet af Z-VAD-fmk.

(S) -2 Mål LNCaP celler, men ikke Normale Prostata PNT1A Celler

Den potentielle translatoriske værdi (S) -2 blev vurderet ved at sammenligne aktiviteterne i både (S) -2 og SAHA med hensyn til induktion af apoptose og histonacetylering på LNCaP-celler og normale prostata epitelceller immortaliserede PNT1A celler. (S) -2 bedt en markant stigning i niveauet af spaltet PARP fragment, γ-H2AX og acetyl-H3 i LNCaP-celler med meget større effektivitet end SAHA (figur 3A, venstre). Endvidere (S) -2 syntes at være relativt sikker til normale PNT1A celler, der i stedet var et følsomt mål for SAHA som afsløret ved spaltning af PARP ved behandling med 5 uM lægemiddel (figur 3A, højre), mens acetyl-H3-niveauer i PNT1A celler forblev forholdsvis stabil uanset enten inducere

(A) -. LNCaP og PNT1A celler blev inkuberet i 24 timer med stigende mængder af enten (S) -2 og SAHA. Celleekstrakter blev underkastet Western immunoblotting at detektere phospho-H2AX, PARP og dens spaltede fragment og acetyl-H3; a-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) – p21 mRNA niveauer fra LNCaP og PNT1A celler inkuberet uden /med (S) -2 eller SAHA i 24 timer blev målt ved kvantitativ realtids-PCR. Normale PNT1A celler var tilsyneladende mindre følsomme over for (S) -2 sammenlignet med SAHA. Kolonner, gennemsnit af tre uafhængige prøver: barer ± SD; signifikant forskel (

P

≤0.05). (C) -. PARP-spaltning og γ-H2AX niveauer induceret i LNCaP og PNT1A celler ved en 24 h-behandling uden /med (S) -2 blev sammenlignet på samme blot

Endvidere vækst arrest i (S) -2-behandlede LNCaP-celler var associeret med en markant dosisafhængig stigning (7-13 gange) i p21-mRNA-niveauer, der også blev forstærket af SAHA men med en mindre dosisafhængig progression (Figur 3B, venstre) . Det skal bemærkes, at p21-ekspression i PNT1A celler var upåvirket af (S) -2, mens påfaldende opreguleret med 5 uM SAHA (figur 3B, højre). Endvidere resultater opnås ved at sammenligne den samme blot virkningerne af (S) -2 i LNCaP og PNT1A celler har klart vist, at LNCaP var afgjort mere følsomhed end normale PNT1A celler i form af PARP-spaltning og γ-H2AX niveauer (figur 3C) .

(S) -2 Fremkalde cellecyklusstandsning, apoptose og differentiering af PC3 celler

virkningen af ​​(S) -2 på proliferation af de stærkt metastatisk prostatacancer PC3-celler har også været evalueret. Celler dyrket i tre dage uden /med stigende mængder af (S) -2 undergik en dosisafhængig hæmning af proliferation (figur 4A) i overensstemmelse med den betydelige stigning i andelen af ​​celler standset i G

0 /G

1 fase (fra 46 til 75%) og faldet (fra 40 til 15%) af celler i S-fase (Figur 4B). Konsekvent, p21 var signifikant opreguleret ved 15 og 24 timers behandling (figur 4C). Af interesse, (S) -2-induceret acetyl-H3-niveauer blev allerede forbedret ved 24 timer og steg yderligere ved 48 timer, lige når effekten af ​​SAHA begyndte at falde (figur 4D).

(A) – Celler (10

5) blev podet i plader med 6 brønde og lodes binde natten over. Dagen efter (S) -2 blev tilsat i de angivne koncentrationer og celleantal bestemtes langs de næste tre dage. (B) – Cellerne blev inkuberet i 24 timer med 2,5 uM (S) -2 at bestemme% af PI-farvede celler i forskellige faser af cellecyklussen som bestemt ved flowcytometri. Billeder af enten ubehandlede og behandlede kulturer blev taget ved hjælp af et fasekontrast-mikroskopi. (C) – p21-mRNA-niveauer i PC3-celler fra kulturer behandlet uden /med (S) -2 blev målt ved kvantitativ realtids-PCR. (D) – Sammenlignende Western blot-analyse af acetyl-H3-niveauer i celleekstrakter fra PC3 behandlet med enten (S) -2 eller SAHA; α-tubulin blev anvendt som lastning kontrol.

Men PC3 celler, på trods af deres følsomhed over for (S) -2-medieret cytostase, syntes at være mere modstandsdygtige end LNCaP celler til lægemiddel-induceret apoptose som fremgår af, at der kun kunne opnås en lignende mønster af spaltet PARP, γ-H2AX og acetyl-α-tubulin i de to cellelinjer ved behandling PC3-celler med to gange anvendte dosis for LNCaP-celler (figur 5A). Endvidere fluorescerende assay for caspase 3-aktivering ved 2,5 uM (S) -2 indikeret, at omkring 23% af PC3-celler undergik apoptose efter en 48 h-behandling (figur 5B)

dvs.

mindre end en tredjedel i forhold til behandlede LNCaP-celler. Desuden PC3-celler, der forbliver på fadet efter inkubation i 72 timer med stigende mængder af lægemiddel blev større i størrelse i forhold til kontroller og akkumuleret inden cytoplasmaet neutral lipiddråber, farves positivt med Oil-Red O (ORO) som følge af lægemiddel -induceret adipogenisk differentiering (figur 5C), som allerede blev rapporteret at forekomme i disse celler [40]

(A) -. prøver fra PC3 og LNCaP celler behandlet uden /med (S) -2 (2,5 og 5 uM) i 24 timer, blev analyseret ved Western blot og immunodetekteret til: PARP og dens spaltede fragment, γ-H2AX og acetyl-α-tubulin, mens α-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) – Celler enten ubehandlede eller behandlet med 2,5 uM (S) -2 i 48 timer blev inkuberet blot 1 time før høstes med FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine og derefter skyllet to gange med PBS og deres grønne fluorescens blev målt ved flow cytometri (se kommentar til punkt B i figur 2). (C) – Mikroskopisk evaluering af virkningerne af (S) -2 på akkumulering af neutrale lipiddråber inden PC3 celler behandlet i tre dage. Efter fiksering blev celler farvet med en ORO opløsning; kvantificering af ORO farvning blev udført som beskrevet i Materialer og metoder.

(S) -2 Reducerer invasivitet, migration og motilitet PC3 Cells

Matrix (MMP’er) udgivet af tumorceller i det ekstracellulære miljø er afgørende for kræft-forfremmet vævsnedbrydning og invasion sammen med metastatiske proces [41], [42], [43]. MMP-9 fra det konditionerede medium af PC3-kulturer blev underkastet gelatinezymografi og viste en dosisafhængig reduktion af MMP-9-aktivitet (figur 6A), som blev ledsaget af en svag, men ikke signifikant, fald i MMP-9-ekspression (figur 6B, venstre). I stedet ekspressionen af ​​vævet inhibitor af metalloproteinase-1 (TIMP-1) – kendt at udøve anti-metastatiske virkninger ved at sammenligne aktiviteten af ​​MMP-9 og andre MMP’er [44], [45] – blev påfaldende forbedret efter 24 timer af behandlingen (figur 6B, højre)

(A) -. Aliquoter af konditioneret medier fra PC3 kulturer inkuberet uden /med (S) -2 i fravær af FCS blev indsendt til gelatinezymografi og densitometrisk analyse af MMP -9 aktivitet (procent af kontrol). (B) – MMP-9 og TIMP-1-mRNA-niveauer fra PC3 celler behandlet uden /med (S) -2 i 24 timer blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR. (C) – (S) -2 hæmmede PC3 celle motilitet

in vitro

. Konfluente kulturer blev “såret” ved hjælp af en steril plastik tip og vedligeholdes uden /med stigende mængder af narkotika i 24 timer. Et fase-kontrast mikroskopi blev brugt til at tage billeder af monolag. (D) – (S) -2 faldt invasivitet af PC3. Kulturer blev forbehandlet med /uden (S) -2 (2,5-5 uM) i 24 timer og derefter Alikvoter af PC3-celler (20 × 10

3) blev overført i det øvre rum af kammeret. Celler migrerede gennem Matrigel på filtrene af Boyden kamre blev talt efter 6 timer og udtrykt som det absolutte celleantal ± SD; fem forskellige mikroskopiske felter (forstørrelse: x200) for hver tilstand blev undersøgt og signifikant forskel mellem prøverne blev etableret i

P

≤0.05

Desuden resultaterne af “sårheling”.