PLoS ONE: Udtømning af kinesin 5B Påvirker Lysosomal Distribution og stabilitet og inducerer Peri-Nuclear Ophobning af Autophagosomes i Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Forbedret lysosomale menneskehandel er forbundet med metastatisk cancer. I et forsøg på at opdage kræft relevant lysosomale motordrevne proteiner, sammenlignede vi lysosomale proteomer fra parentale MCF-7 brystcancerceller med dem fra højt invasive MCF-7-celler, der udtrykker en aktiv form af ErbB2 (AN-ErbB2).

Metode /vigtigste resultater Salg

massespektrometrianalyse identificeret kinesin tunge kæde protein KIF5B som den eneste mikrotubulus motor forbundet med lysosomerne i MCF-7-celler, og ektopisk AN-ErbB2 styrket sin lysosomal association. KIF5B forbundet med lysosomer også i HeLa cervix carcinomaceller som analyseret ved subcellulær fraktionering. Nedbrydningen af ​​KIF5B udløste perifere sammenlægninger af lysosomer efterfulgt af lysosomale destabilisering, og celledød i HeLa-celler. Lysosomal exocytose i afhængighed af plasma skader membran samt væskefase endocytose fungerede dog normalt i disse celler. Både HeLa- og MCF-7-celler syntes at udtrykke samme indhold af KIF5B isoformen men døden fænotypen var svagere i KIF5B-depleteret MCF-7-celler. Overraskende KIF5B udtømning inhiberede rapamycin-induceret akkumulering af autophagosomes i MCF-7-celler. I KIF5B-udtømte celler de autophagosomes dannes og akkumuleres i nærheden til Golgi apparatet, mens der i kontrolcellerne de optrådte jævnt fordelt i cytoplasmaet.

Konklusioner /Betydning

Vores data identificerer KIF5B som kræft relevant lysosomalt motor protein med ekstra funktioner i autophagosome dannelse

Henvisning:. Cardoso CMP, Groth-Pedersen L, Høyer-Hansen M, Kirkegaard T, Corcelle E, Andersen JS, et al. (2009) Udtømning af kinesin 5B Påvirker Lysosomal Distribution og stabilitet og inducerer Peri-Nuclear Ophobning af Autophagosomes i kræftceller. PLoS ONE 4 (2): e4424. doi: 10,1371 /journal.pone.0004424

Redaktør: Andreas Bergmann, UT MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: November 3, 2008; Accepteret: 18. december 2008; Publiceret: 10. februar, 2009

Copyright: © 2009 Cardoso et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. CMP Cardoso var en modtager af et tilskud fra den portugisiske Foundation for Videnskab og Teknologi (SFRH /BPD /14448/2003). Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den danske Kræftens Bekæmpelse (MJ), Dansk Grundforskningsfond (MJ), Dansk Sundhedsvidenskabelige Forskningsråd (JN og MJ), Meyer Foundation (MJ), den M.L. JÃ? Rgensen og Gunnar Hansens Fond (MJ), Novo Fonden (MJ og MHH), Vilhelm Pedersen Foundation (JN og MJ), Dansk Cancer Research Foundation (MJ) og Europa-Kommissionen FP7 APO-SYS-konsortiet (MJ og JSA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lysosomer er membranbundne dynamiske organeller, der repræsenterer den endelige destination for endocytiske, sekretorisk og autophagic veje [1]. Den fysiologiske betydning af lysosomer er fremhævet af en række sygdomme som følge af defekter i det lysosomale biogenese og funktion [2]. Tværtimod den forbedrede syntese, menneskehandel og ekstracellulær frigivelse af lysosomale proteaser (cathepsin), er vigtige kendetegn for malignitet og associerede med den invasive og metastatiske kapacitet af kræftceller [3], [4]. Interessant, lysosomale ændringer i forbindelse med immortalisering og transformation af kræftceller også bevidstgøre kræftceller til programmeret celledød veje involverer lysosomale membranpermeabilisering [5], [6]. Når udløst, lysosomal membranpermeabilisering resulterer i frigivelse af cathepsiner og andre lysosomale hydrolaser til cytosolen, hvor de kan udløse den mitokondriske ydre membran permeabilisering efterfulgt af caspase-medieret apoptose [7], [8] eller mediere caspase-uafhængig programmeret celledød [9]. Således forekommer inhibering af lysosomal trafficking /exocytose som et lovende mål for cancerterapi. Det ville ikke kun inhibere cathepsin-medieret invasion men også hindrer generelle handel og muligvis resultere i akkumulering af lysosomer bestemt til sekretion og derfor er yderligere sensibilisere cancerceller for lysosomal celledødsveje. Denne hypotese understøttes af data, der viser, at vincristin, et mikrotubuli-destabiliserende anti-cancer stof, ikke kun hæmmer lysosom menneskehandel, men også inducerer en hurtig stigning i mængden af ​​det lysosomale rum efterfulgt af lysosomale lækage og cathepsin-afhængig celledød [10] .

Fordi lægemidler, der forstyrrer mikrotubulære netværk viser høj generel toksicitet, vi spekuleret på, at en mere specifik forstyrrelse lysosom handel kan resultere i anti-cancer strategier med færre bivirkninger. Derfor ønskede vi at identificere og karakterisere motor proteiner er vigtige for lysosomer transport i kræftceller. Motordrevne proteiner anvender cytoskelettet som substrat bevægelse er opdelt i myosin motorer, der bevæger sig langs actin mikrofilamenter og kinesin /dynein motorer, der anvender mikrotubuli gennem interaktion med tubulin for deres bevægelse [11]. Motor proteiner er drevet af hydrolyse af ATP og konvertere kemisk energi til mekanisk arbejde gør dem i stand til at flytte fragt (vesikler, proteiner og lipider) over lange afstande. Mikrotubulus specifikke motorer består af to grundlæggende typer af mikrotubuli motorer:. Plus-ende motorer og minus-end motorer, afhængigt af den retning, i hvilken de bevæger sig langs filamenterne i cellen [12]

trunkeret form af ErbB2-receptoren findes ofte overudtrykt i brystkræft og dets ekspression og aktivitet korrelerer med øget invasivitet, motilitet og dårlig prognose [13]. Følgelig ektopisk ekspression af AN-ErbB2 i MCF-7 brystcancerceller gør dem meget mobile og invasive [14] (Vores upubliceret observation). Foranlediget af konstateringen af, at AN-ErbB2-induceret invasiv fænotype var forbundet med ændret lysosomale menneskehandel og en flere fold stigning i ekspressionen og aktiviteten af ​​lysosomale proteaser, vi valgte denne model system til at søge efter kræft relevant lysosomale motor proteiner. Vi anvendte en kvantitativ proteomisk analyse på oprensede lysosomer fra AN-ErbB2 MCF-7 og kontrol celler, der viser, at nogle motoriske protein niveauer var signifikant opreguleret efter AN-ErbB2 induktion. Interessant fandt vi, at AN-ErbB2 forøgede ekspressionen af ​​kinesin 5B (KIF5B), en motor protein impliceret i lysosomal og mitokondriel transport [15], [16]. I tråd med dette har KIF5B mRNA blevet rapporteret at være opreguleret i flere typer af kræft væv, herunder blærekræft (GDS1479 record), avanceret gastrisk cancer (GDS1210 record), planocellulært karcinom (GDS2200 record), sporadisk basal-lignende bryst cancer og BRCA1-associeret brystcancer (GDS2250 record) (data fra NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez; Gene Expression Omnibus). KIF5B er en N-kinesin (Plus-end motor), der tilhører superfamilien af ​​kinesin-1 molekylære motor proteiner, sammen med cytoplasmatisk dynein er ansvarlig for mikrotubulus-afhængig transport af gods i eukaryote celler [17]. For at belyse den rolle KIF5B i kræftceller, vi undersøgte dens funktion i forskellige lysosomale veje herunder lysosomale celledød vej, det genlukkelige respons efter plasmamembranen skader (exocytose) og macroautophagy.

Materialer og Metoder

Cell kultur og behandlinger

MCF-7, HeLa og U2OS celler stammer fra menneskelig brystcarcinoma, cervix carcinom og osteosarkom, respectivly. MCF-7-eGFP-LC3 cellelinie er en enkelt celle klon af MCF-7-celler, der udtrykker et fusionsprotein bestående af et forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP) og rotte LC3 [18]. MCF-7-ΔNErbB2 og MCF-7-pTRE cellelinier er encellede kloner af MCF-7, der udtrykker tetracyclintransaktivatoren transficeret med pTRE-ΔNErbB2 og pTRE henholdsvis [14]. HeLa-LIMP1-eGFP celler er HeLa-celler, der udtrykker eGFP-mærkede lysosomer integreret membranprotein-1 (LIMP-1) [19] (venligst stillet til rådighed af Dr. J. P. Luzio, University of Cambridge). Cancercellerne og deres transficerede varianter blev opformeret i RPMI 1640 (Invitrogen) suppleret med 6% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS; Biological Industries) og penicillin-streptomycin. Mediet af MCF-7-ΔNErbB2 og MCF-7-pTRE blev yderligere suppleret med 5 pg /ml tetracyclin. At inducere AN-ErbB2-ekspression, tetracyclin (5 ug /ml) blev fjernet, og cellerne blev vasket 5 gange i PBS før udpladning. Alle celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig luft atmosfære ved 5% CO

2.

Analyse af lysosom-associerede proteiner ved massespektrometri med stabil isotop mærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC)

MCF-7-ΔNErbB2 og MCF-7-pTRE blev dyrket i custom-syntetiseret RPMI 1640-medium med enten normal lysin 12C614N2 (Lys0) eller isotop mærkede L-lysin 13C615N2 (Lys8) (Sigma-Isotec, St . Louis, MO) suppleret med 10% dialyseret føtalt kalveserum (Invitrogen) i mindst 5 celledelinger til fuldt ud at inkorporere de mærkede aminosyrer. Lysosomer blev renset ved Iron-Dextran (FEDEX) fraktionering ifølge en protokol tidligere publiceret [20]. Kort beskrevet blev celler (80-90 × 10

6 i alt) præinkuberet med FedEx (8 h) lyseret mekanisk i en Dounce homogenisator og lyset membranfraktion blev sat på en MiniMachs søjle fastgjort til en magnet (MACS Separator systemet, Miltenyi Biotec). Lysosomer fanget på søjlen blev elueret i saccharose ekstraktionsbuffer (250 mM sucrose, 20 mM Hepes, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA og 1 mM Pefabloc, pH 7,5) ved at fjerne kolonnen fra magneten og skylle ud lysosomer med et stempel. Lysosomer blev opløst og proteiner separeret ved elektroforese på NuPAGE Bis-Tris 4-12% gradientgeler (Invitrogen) og farvet med Comassie blå. Gelskiver blev skåret i små stykker og inkuberet med 12,5 ng /pl trypsin ved 37 ° C natten over. De resulterende peptider blev analyseret ved væskekromatografi (Agilent HP1100) kombineret med tandem massespektrometri (LC MS /MS) under anvendelse af en lineær ion-trap Fourier-transform ion-cyklotron-resonans massespektrometer (LTQ-FT-ICR, Thermo-Finnigan). Peak liste blev udvundet ved hjælp af en in-house udviklede scripts (DTA-supercharge), kombineret for hver gel slides, og anvendes til protein databasesøgninger. Strenge kriterier var nødvendige for protein identifikation i den internationale Protein Index database ved hjælp af Mascot-programmet (Matrix Science): mindst to matchende peptider per protein, en masse nøjagtighed inden for 3 ppm, en Mascot score for individuelle peptider er bedre end 20, og en delta score på bedre end 5. MS-Quant (https://msquant.sourceforge.net/), blev et internt udviklet software program, der bruges til at beregne peptid overflod forholdet og at evaluere sikkerhed i peptid identifikation.

siRNA’er og transfektioner

Tre siRNA’er blev designet til at målrette KIF5B mRNA: 5′-CCAUCAUCAUACAAUGAGUCUGAAA-3 ‘(KIF5B-1), 5′-CGGCGACAAGUACAUCGCCAAGUUU-3′ (KIF5B-2), og 5’- CAUCUACCAGAAGGGAUCAAGACAA-3 ‘(KIF5B-3). Alle siRNA’er blev købt hos Invitrogen. I hvert siRNA eksperimentere en kontrolprøve behandlet med transfektion middel alene og /eller en KIF5B mismatch oligo, 5’-CGGAACACAUGGCUAAACCGGCUUU-3 ‘(MM), blev medtaget. MCF-7 og HeLa-celler blev transficeret med 25 nM siRNA anvende oligofectamine (Invitrogen) som transfektion middel.

Måling af cellelevedygtighed og mikroskopisk analyse

Levedygtige celler blev målt ved deres evne til reducere tetrazoliumsaltet 3- (4,5-dimethylthiazol-2-y) -2,5-diphenyltetrasodiumbromide (MTT, Sigma) til en formazan farvestof detekteres ved spektrofotometrisk analyse i en VersaMax mikropladelæser (Molecular Devices Ltd., Wokingham, United Kingdom) som beskrevet tidligere [9]. Fasekontrast billeder af cellelinier blev taget med et omvendt Olympus IX-70-mikroskop forbundet til et Olympus DP70 digitalkamera. Time lapse mikroskopi blev udført med et Carl Zeiss Axiovert 200M fluorescensmikroskop under anvendelse MetaMorph software.

Analyse af GFP-LC3 translokation

Autophagy blev induceret ved inkubation af MCF-7-LC3-eGFP-celler med 2,5 pM rapamycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 24 timer. Procentdelen af ​​celler med eGFP-LC3 translokation i prikker (mindst 100 celler /prøve) blev talt i eGFP-LC3 udtrykkende celler fastsat i 3,7% formaldehyd og 0,19% picrinsyre (vol /vol) anvende Zeiss Axiovert 100 M Confocal Laser scanning Microscope. Celler med ≥5 grønne cytosoliske vesikler blev betragtet som positive.

Måling af enzymaktiviteter

Caspase-3-lignende (DEVD-AFC, Enxzyme System Products), cystein cathepsin (zFR-AFC, Enzyme System Products), sur phosphatase og SS

N

acetyl-glucosaminidase (NAG) aktiviteter blev bestemt i det væsentlige som beskrevet tidligere [6], [9]. Kort fortalt blev den cytoplasmatiske fraktion ekstraheres med 20-35 pg /ml digitonin og den totale cellulære fraktion med 200 pg /ml digitonin og hastigheden af ​​den passende substrat hydrolyse V

max blev målt over 20 minutter ved 30 ° C på en Spectramax Gemini fluorometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Lactatdehydrogenase (LDH) aktivitet af cytosolen bestemt ved en cytotoksicitet detektion kit (Roche) blev anvendt som en intern standard.

Immunblotanalyse og immuncytokemi

Proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Primære antistoffer dannet mod KIF5B (SUK4 fra Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), University of Iowa) og ab5629 (fra Abcam), lysosomer-associeret membranprotein-2 (LAMP-2, klon H4B4 fra DSHB), Grp75 (SPA825 fra Stressgene ,), cathepsin B (Ab1 fra Oncogene), p70 S6 kinase 1 (p70

S6K1; # 9202) og phospo-p70

S6K1 (# 9206) (fra Cell Signalling Technology), og glyceraldehyd-3-fosfat (GAPDH, Biogenesis, Poole, UK) efterfulgt af passende peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer fra DAKO A /S (Glostrup, Danmark).

i immuncytokemi blev celler på dækglas fikseret ved hjælp af is-kold methanol i 10 minutter eller 3,7% formaldehyd i 30 minutter ved 25 ° C. Celler blev farvet med de angivne primære antistoffer, herunder muse anti søpindsvin KIF5B (1:20; SUK4), muse-anti-humant cytochrom

c

(klon 556.432 ved 1: 350, BD PharMingen, San Diego, CA) , gede-anti-humant γ-tubulin (SC-7396, Santa Cruz Biotechnology) og muse-anti-humant LAMP-2 (1:100). Efter vask blev prøverne inkuberet med den passende Alexa Fluor-488- og Alexa- Fluor-546/594-koblede sekundære antistoffer (Molecular Probes). Konfokale billeder blev taget med et Zeiss Axiovert 100 M Konfokal laserscanningsmikroskop udstyret med LSM 510-system (Carl Zeiss MicroImaging, Inc.).

RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og revers transkription-PCR (RT-PCR)

RNA blev høstet fra cellekultur med RNeasy søjler (Qiagen) og cDNA-syntese blev gjort med TaqMan RT Kit (Roche) under anvendelse oligo- (dT)

16 primere. PCR-reaktionerne blev udført i overensstemmelse med standardbetingelser med de følgende primere:

KIF1A-viderestil: GACACGCTGGTCTGAGATGA. KIF1A-rev: TGGCTTAGGCACTCCTCACT; KIF3A-viderestil: GACTATGCTGAGGCTGCAA. KIF3A-rev: TGTCTTTGGCCTTGCTTTC; KIF5A-viderestil: CAGCTTGACGACAAGGATGA. KIF5A-rev: GGTGTCCACTGACCTCCTGT; KIF5B-viderestil: GATGGATCGGAAGTGAGCAT. KIF5B-rev: ATCACGACCGTGTCTTCTCC; KIF5C-viderestil:. GCAACTGGAACAGGAGAAGC

KIF5C-rev: ACCTCACCCAAACACTCCAG. PBGD-viderestil: CATGTCTGGTAACGGCAATG; PBGD-rev: AGGGCATGTTCAAGCTCCTT. Porphobilinogendeaminase (PBGD; PubMed entry BC000520) blev anvendt som intern kontrol sammen med genet af interesse. PCR-produkter blev størrelse-separeret på en 1,5% -agarose gel indeholdende ethidiumbromid, visualiseret under UV-lys, fotograferet ved hjælp af Polaroid film.

Subcellulær fraktionering

For tæthed gradient fraktionering celler blev samlet i iskold homogeniseringsbuffer (250 mM sucrose, 20 mM Hepes og 1 mM EDTA, pH 7,4) og lyseret i en dounce homogenisator på is. Homogenaterne blev centrifugeret, og supernatanten centrifugeret ved 3000 g i 10 minutter ved 4 ° C og pelleten blev kasseret. Supernatanten blev centrifugeret ved 17000 g i 20 minutter ved 4 ° C. Iodixanol gradienter blev dannet ved sekventiel tilsætning af 4, 10, 16 og 24% opløsninger i homogeniseringsbuffer ved 25 ° C i 1 time, hvilket resulterer i dannelsen af ​​en kontinuerlig gradient. Den endelige pellet blev resuspenderet i homogeniseringsbuffer og hældt på en kontinuerlig 4-24% iodixanol gradient og centrifugeret ved 20000

g

i en SW41Ti rotor (Beckman) i 17 timer ved 4 ° C. Gradienter blev separeret i alt tyve 500 pi fraktioner, opsamles fra bunden. Densiteten af ​​hver fraktion blev bestemt ved at måle OD ved 244 nm. Cathepsin B /L,

N

-acetylglucosaminidase (NAG) og sure phosphatase aktiviteter blev målt for hver fraktion efter tilsætning af digitonin.

Analyse af exocytose aktivitet på plasmamembranen sårede

Membran såret ved elektroporering blev udført som tidligere [21] beskrevne. Kort beskrevet blev celler suspenderet i Hanks balanceret saltopløsning (HBSS) (Gibco, Invitrogen), underkastes elektroporering ved 200 V med variable niveauer af kapacitans i en 0,2-cm elektrode Gene Pulser cuvette (Bio-Rad), og inkuberet i 1 min ved 37 ° C. Celler blev derefter inkuberet med anti-LAMP-1 (sc-20011, Santa Cruz Biotechnology) antistof på is i 30 minutter, vasket, fikseret og farvet med Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer (Molecular Probes). Flowcytometri på 10000 celler pr prøve blev udført med en FACS (Becton Dickinson) og data blev analyseret ved CellQuest software (Becton Dickinson). For at måle ionomycin inducerede eksocytoseaktivitet celler blev inkuberet i HBSS indeholdende 10 pM ionomycin (Sigma). En cathepsin B specifik probe, zfr-AMC (VWR International) blev tilsat til hver brønd ved en slutkoncentration på 100 uM til tiden 0 og 10 min. Hastigheden af ​​substrathydrolyse, som målt ved frigivelse af AMC (excitationsbølgelængde, 400 nm; emissionsbølgelængde, 489 nm). Ved 30 ° C på en Spectramax Gemini fluorometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)

Resultater

ΔNErbB2 øger niveauet af KIF5B i lysosomer

MCF-7 brystkarcinomceller udtrykker aminoterminalt trunkeret konstitutivt aktiv form af ErbB2-receptor-tyrosinkinase (ΔNErbB2) vise en meget motile fænotype kendetegnet ved omfattende membran ruffling, plasma membran fremskrivninger og spredning af cellerne (fig. 1A). Endvidere ΔNErbB2 ekspression inducerer lokaliseringen af ​​lysosomer til filopodia (fig. 1A) og en 3-4 gange opregulering af lysosomal cystein cathepsin aktivitet [6] tyder på, at AN-ErbB2 ændrer lysosomale handel og indhold. For at identificere motoriske proteiner involveret i lysosomale handel med kræftceller, vi sammenlignede proteomer af lysosomer isoleret fra kontrol MCF-7 og MCF-7-ΔNErbB2 celler ved stabil-isotop mærkning af aminosyrer (Lys0 /Lys8) i cellekultur ( SILAC) efterfulgt af massespektrometrianalyse [22]. Seks myosin motorer og en mikrotubuli specifik kinesin motor kunne påvises ved denne tilgang som lysosomer-associerede motoriske proteiner (tabel 1 og Datasæt S1). Den lysosomale sammenslutning af tre af de identificerede motoriske proteiner (Myosin Ib, Myosin Ic og kinesin tunge kæde KIF5B) var opreguleret med mere end 25% ved ektopisk AN-ErbB2 udtryk i MCF-7 celler. For at karakterisere den funktionelle signifikans af disse tre motorer med hensyn til vækst, overlevelse og lysosomal fordeling vi forarmet dem i MCF-7 og HeLa cervix carcinomaceller ved RNA-interferens. Kun siRNA’er specifikke for KIF5B påvirket disse parametre (fig. 2 og data ikke vist). Vi valgte derfor at undersøge den rolle, KIF5B på lysosomale funktion mere detaljeret.

(A) Immunfarvning med lysosomer specifik LAMP-1-antistof i AN-ErbB2 og kontrolceller. (B) RT-PCR-analyse viser mRNA ekspressionsniveauer af forskellige N-kinesiner herunder KIF5A (349 bp), KIF5B (337 bp), KIF5C (320 bp), KIF3A (393 bp) og KIF1A (364 bp) i H: HeLa, M: MCF-7 og U: U2OS celler. KIF forstærkning bands er angivet med pile. Huset-holde gen PBDG (257 bp) blev anvendt som intern kontrol. (C) Light membranfraktioner af HeLa-celler blev separeret ved iodixanol ultracentrifugering og proteinet ekspressionsniveauer af KIF5B, LAMP-2 (lysosomer) og Grp75 (mitochondrier) blev visualiseret ved immunblotting. Den enzymatiske aktivitet niveauer af Cathepsin B /L, sur phosphatase og NAG blev målt i alle fraktioner og tjente som lysosomale markører; lineariteten af ​​iodixanol gradient profil blev bestemt ved at måle OD ved 244 nm (nederste graf).

(A) Protein niveauer af KIF5B, 48 timer efter udtynding med varierende siRNA koncentrationer (KIF5B-1 siRNA ) for HeLa og MCF-7; β-tubulin tjente som intern kontrol. Oligof: kontrol celler behandlet med oligofectamine alene. (B) repræsentant fasekontrast billeder af HeLa, MCF-7 og MCF-7-AN-ErbB2 celler, 72 timer efter behandling med angivne siRNA’er. (C) HeLa-celler blev depleteret for KIF5B eller behandlet med kontrol MM siRNA og metabolisk aktivitet bestemt ved en MTT assay og død estimeret ved LDH-frigivelse-assay (D). MTT og LDH værdier præsenteres som procent af ubehandlede celler. (E) Caspase-3-lignende aktivitet og (F) cytosolisk cathepsin aktivitet i HeLa-celler efter KIF5B depletion (72 timer) målt ved DEVDase og zFRase enzymassays hhv. Værdier repræsenterer middelværdier af tredobbelte målinger ± SD. Alle forsøg blev gentaget tre gange med det væsentlige de samme resultater.

KIF5B er stærkt udtrykt i forskellige cancerceller

Først undersøgte vi mRNA ekspressionsniveauer af KIF5B i tre cancer cellelinjer (MCF-7, HeLa og U2OS osteosarkom) og fandt det at være stærkt til udtryk i alle tre cellelinjer i forhold til andre N-kinesiner herunder KIF5A /KIF5C (kinesin 1), KIF3A (kinesin 2) og KIF1A (kinesin 3) (fig. 1B). Vi har detekteret kun lave niveauer af KIF3A mens både KIF5A og KIF5C mRNA var ikke-påviselige i alle tre cellelinjer, efter aftale med tidligere resultater tyder på, at deres udtryk er begrænset til neuroner [23] (fig. 1B). For at udfordre det lysosomale lokalisering af KIF5B påvist ved proteomisk analyse af MCF-7 celler, vi udsættes lyset membran brøkdel af HeLa-celler til en densitet gradient fraktionering og analyseret de forskellige fraktioner ved immunoblotting og lysosomal enzymatisk aktivitet målinger. Som vist i figur 1C, KIF5B var udelukkende til stede i fraktioner indeholdende høje niveauer af lysosomal LAMP-2-protein og lysosomale enzymatisk aktivitet markører (cystein cathepsiner, sur phosphatase og SS-

N

acetyl-glucosaminidase). Det skal dog bemærkes, at fraktioner indeholdende mitokondrie Grp75 markørprotein var dels overlapper lysosomale fraktioner og KIF5B.

Udtømning af KIF5B inducerer lysosomale lækage og celledød i HeLa-celler

For at belyse rolle KIF5B i cellevækst og overlevelse, HeLa og MCF-7-celler blev depleteret for KIF5B af RNA-interferens (fig. 2A). Interessant erhvervede KIF5B-udtømte HeLa-celler en aflang cellulær fænotype efterfulgt af betydelig væksthæmning og celledød (fig. 2B-D). KIF5B udtømning fremkaldt lignende, men klart svagere cytostatiske /cytotoksiske virkninger i MCF-7-celler og lidt mere i MCF-7-AN-ErbB2 celler som analyseret ved lysmikroskopi (fig. 2B). På trods af induktionen af ​​betydelig celledød, kun meget lav caspase-3-lignende aktivitet blev påvist i KIF5B-udtømte HeLa-celler (fig. 2E). I stedet KIF5B forarmet celler udviste en signifikant stigning i cytosolisk cystein cathepsin aktivitet indikerer lysosomale membranpermeabilisering (fig. 2F).

Udtømning af KIF5B i HeLa-celler inducerer perifere aggregeringer af lysosomer i HeLa-celler

Da KIF5B mangelfuld mus extraembryonic celler vise perinuklear gruppering af mitokondrier og nedsat syre-udløst handel med lysosomer mod cellens periferi [16], vi næste studerede fordelingen af ​​disse organeller efter KIF5B udtynding. For at undersøge den lysosomale distribution, tog vi fordel af HeLa celler, der udtrykker en eGFP-LIMP1 som lysosomale markør [19]. I KIF5B-depleteret HeLa-eGFP-LIMP1 celler fordelingen af ​​eGFP-LIMP1-postive lysosomer blev dramatisk ændret fra et diffust perinukleær mønster til store perifere aggregater (fig. 3A). Disse lysosomer dukkede op i klynger og var aktivt transporteret til og fra aggregaterne som observeret af video time-lapse mikroskopi (Video S1 og S2). I modsætning til lysosomerne, blev det mitokondrielle fordeling ikke påvirkes af KIF5B depletion i HeLa-celler (fig. 3A).

(A) Repræsentative konfokale billeder af enten HeLa-celler eller HeLa stabilt udtrykker LIMP-1-EGFP transficeret med KIF5B eller MM siRNA, og farvet med angivne antistoffer. (B) HeLa-celler podet på dækglas (80% sammenflydning) blev membranen såret med en skalpel og umiddelbart efter farvet for overfladen LAMP-1; celler blev efterfølgende fikseret og farvet for KIF5B. (C) HeLa-celler transficeret med angivne siRNA’er blev (efter 48 h) stimuleret til exocytose med 10 pM ionomycin. Ekstracellulær udskillelse af lysosomale cathepsiner blev målt ved en zFR-AMC enzymassay og værdier (gennemsnit af tre målinger ± SD) blev udtrykt som procent af totalt cellulært LDH-indhold. (D) Kvantificering af overfladen LAMP-1 i elektroporerede HeLa-celler ved flowcytometri. Rød og grøn indikerer celler i to forskellige porte. Procentdelen af ​​celler i den røde port blev brugt til at estimere mængden af ​​overfladen-eksponerede LAMP-1 +/- elektroporation. FL1-H: fluorescensintensitet. FSC-H:. Fremad side scatter

Da KIF5B fungerer som en

plus

-end motor, dvs. en motor, der transporterer gods fra centrosom til cellen periferien [24], ophobning af lysosomer til cellens periferi i KIF5B-udtømte celler kan skyldes en perifer lokalisering af centrosom eller et svigt i lysosomerne til at fusionere med plasmamembranen. For at teste den første mulighed, farvede vi HeLa-eGFP-LIMP1 celler med et antistof mod γ-tubulin at markere centrosomer. Men de lysosomale klynger ikke ophobes omkring centrosomer (Fig. 3A). For at undersøge, om KIF5B er afgørende for lysosomal exocytose, vi anvendt tre forskellige metoder (mekanisk ridser, elektroporation og ionomycin) for at inducere plasma membran læsioner, der udløser Ca

2+ tilstrømning og induktion af genlukning reaktion, der involverer exocytose af lysosomer [25 ]. En skalpel blev anvendt til at ridse på en semi-konfluent lag af HeLa-celler til mekanisk at inducere plasma skader membran og lysosomal exocytose blev straks analyseret under anvendelse af et antistof påvisning af en luminal epitop af lysosomal LAMP-1 på celleoverfladen. Overfladen fluorescens af LAMP-1 var signifikant forøget ved skader stedet indikerer lysosomale membran genlukning, og en ekstra co-lokalisering og akkumulering af KIF5B på skaden site blev observeret tyder på, at KIF5B er involveret i dette svar (fig. 3B). Da denne metode ikke er egnet til kvantitative undersøgelser anvendte vi elektroporering til at inducere små hydrofile porer i plasmamembranen at undersøge om KIF5B var nødvendig i transportprocessen af ​​lysosomer til skaden sites. Fremgangsmåden er bredt anvendt til at indføre proteiner og DNA i celler og afhænger af celler evnen til at genlukke deres plasmamembran efter elektroporering [26]. HeLa-celler blev elektroporeret med stigende kapacitans og umiddelbart efter de blev farvet for overfladen LAMP-1 (fig. 3D). Kvantificering af LAMP-1 eksponeret på plasmamembranen ved flowcytometri afslørede et påviseligt niveau af LAMP-1 på 3,3% af ubehandlede celler. I modsætning hertil, når cellerne blev elektroporeret ved 125 og 250 uF, blev LAMP-1 detekteret på overfladen i 11,4 og 21% af cellerne hhv. Celler forarmet for KIF5B og udsat for 125 uF ikke vise nogen signifikant ændring i overfladen LAMP-1 i forhold til kontrol behandlede celler udsat for 125 uF (fig. 3D). Tilsvarende ionomycin-induceret lysosomale exocytose af luminale proteaser var upåvirket af KIF5B depletion (Fig 3C). Disse data viser, at KIF5B er ikke afgørende for den lysosomale exocytose og plasmamembranen genlukning. Endvidere blev optagelsen af ​​Alexa Mel 488-Dextran (10 kDa) ikke påvirket af KIF5B udtynding indikerer at KIF5B ikke er nødvendig for væskefase endocytose (data ikke vist).

Udtømning af KIF5B inducerer peri-nukleare ophobning af autophagosomes

Næste, vi undersøgt, om KIF5B spiller en rolle i autophagy, de store lysosomale nedbrydningsvej. Til dette formål behandlede vi MCF-7-celler, der stabilt udtrykker den autophagosome-associerede LC3 protein fusioneret til det forstærkede grøn fluorescensprotein (MCF-7-LC3-eGFP) med enten rapamycin der inducerer autophagy ved at inaktivere mammalian target of rapamycin komplekse 1 ( mTORC1) eller concanamycin A, der inhiberer vakuolære V-ATPase-aktivitet i lysosomer medfører reduceret omsætning autophagosomes samt induktion af autophagosome dannelse via hæmning af mTORC1 [27]. Interessant udtømningen af ​​KIF5B af tre ikke-overlappende siRNA’er faldt betydeligt evnen af ​​rapamycin til at udløse dannelsen af ​​LC3-postive autophagic vesikler (fig. 4A). Denne effekt blev ikke fremkaldt af ændringer i evne rapamycin til at hæmme mTORC1 siden udtømning af KIF5B ikke havde nogen indflydelse på mTORC1 aktivitet som analyseret af phosphorylering status p70 S6 kinase 1 (p70

S6K1) (fig. 4B). At undersøge fænomenet yderligere, fulgte vi autophagosome dannelse i MCF-7-LC3-eGFP celle behandlet med rapamycin (ikke vist) eller concanamycin A ved tidsforskydningen video mikroskopi i 45 minutter. Overraskende blev fordelingen af ​​autophagosomes dramatisk ændret af KIF5B udtynding. I KIF5B udtømte celler dukkede de autophagosomes og akkumuleret primært omkring kernen (Fig 4C-E;. Video S3) mens de i celler behandlet med kontrol siRNA var fordelt diffust hele cytoplasmaet (figur 4C;. Video S4). De perinukleære autophagosomes i KIF5B udtømte celler blev placeret i umiddelbar nærhed af Golgi-apparatet som visualiseret ved farvning med et antistof mod et

trans

-Golgi netværk membranprotein Golgin-97 (fig. 4F og video S5).