PLoS ONE: Kræft cellevækst differentielt Påvirket af konstitutiv aktivering af Nrf2 af KEAP1 Sletning og Farmakologisk Aktivering af Nrf2 af Syntetisk triterpenoid, RTA 405

Abstrakt

Syntetiske triterpenoids er antioxidant betændelse modulatorer (mål), der udviser en bred anticancer aktivitet. AIMS binde til KEAP1 og inhibere dets evne til at fremme Nrf2 nedbrydning. Som et resultat, Nrf2 øger transkription af gener, der genopretter redox balance og reducere inflammation. AIMS inhibere tumorvækst og metastase ved at øge Nrf2 aktivitet i tumormikromiljøet og ved at modulere aktiviteten af ​​oncogene signalveje, herunder NF-KB, i tumorceller. Akkumulerende tyder på, at KEAP1 tab eller mutation-hvilket resulterer i høje niveauer af vedvarende Nrf2 aktivitetsbaseret kan fremme kræft vækst og øge kemoresistens. Tab af KEAP1 øger også niveauerne af andre onkogene proteiner, herunder IKKβ og BCL2. Den tilsyneladende overlevelsesfordel billede til nogle tumorceller ved tab af funktionel KEAP1 rejser spørgsmålet om, hvorvidt farmakologisk inhibering af KEAP1 kunne fremme tumorvækst. For at løse dette problem, vi karakteriseret de basale niveauer af KEAP1 og Nrf2 i et panel af humane tumorcellelinjer og profilerede aktivitet en AIM, RTA 405. Vi fandt, at i tumorcellelinier med lav eller mutant KEAP1, og i

Keap1

– /-

murine embryonale fibroblaster, blev flere KEAP1 mål, herunder Nrf2, IKKβ, og BCL2 forhøjet.

Keap1

– /- murine embryonale fibroblaster havde også højere spredning og kolonidannelse end deres vildtype-modstykker. I celler med funktionel KEAP1, RTA 405 øget Nrf2 niveauer, men ikke IKKβ eller BCL2 niveauer, og ikke øge celledeling eller overlevelse. Desuden RTA 405 hæmmet vækst på tilsvarende koncentrationer i celler med forskellige basale Nrf2 aktivitetsniveau og i celler med vildtype eller mutant

KRAS

. Endelig har forbehandling med RTA 405 ikke beskytte tumorceller mod doxorubicin- eller cisplatin-medieret vækstinhibering. Kollektivt, disse data, at farmakologisk aktivering af Nrf2 ved AIMS adskiller sig fra genetisk aktivering og giver ikke en vækst eller overlevelse fordel at tumorceller

Henvisning:. Probst BL, McCauley L, Trevino I, Wigley WC, Ferguson DA (2015) Cancer Cell Growth differentielt påvirket af konstitutiv aktivering af Nrf2 af KEAP1 Sletning og Farmakologisk Aktivering af Nrf2 af Syntetisk triterpenoid, RTA 405. PLoS ONE 10 (8): e0135257. doi: 10,1371 /journal.pone.0135257

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, UNITED STATES

Modtaget: 17. december, 2014 Accepteret: 20 Juli 2015; Udgivet: 24 August, 2015

Copyright: © 2015 Probst et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev finansieret af Reata Pharmaceuticals, der havde en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskript

Konkurrerende interesser: forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: Alle forfattere er nuværende eller tidligere medarbejdere i Reata Pharmaceuticals. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Syntetiske oleanane triterpenoids, såsom bardoxolone methyl og RTA 408, er antioxidant betændelse modulatorer ( mål), der udviser en bred antitumorvirkning i modeller for forebyggelse af kræft og behandling [1, 2], og er veltolereret hos patienter med fremskreden malign sygdom [3]. Det primære mål af målene er Kelch-lignende ECH-associeret protein 1 (KEAP1), et substrat adapter protein til CUL3-RBX1 E3 ubiquitin ligase kompleks. Under normale forhold, KEAP1 letter ubiquitinering af sine substratproteiner, hvilket fører til deres nedbrydning med proteasomet [4]. En af disse substrater er transkriptionsfaktoren nuklear faktor (erythroid-afledt 2) -lignende 2 (NFE2L2), også kendt som Nrf2. Sigter kraftigt forøge Nrf2 aktivitet ved binding til en sensor cysteinrest (C151) i KEAP1, forårsager en konformationel ændring, der gør KEAP1 stand til at fremme Nrf2 nedbrydning [5-8]. Nrf2 akkumuleres og kommer ind i kernen, hvor det øger ekspressionen af ​​antioxidant responselement (ARE) -holdige målgener. Produkterne af disse gener omfatter antioxidant og cytobeskyttende proteiner, som genopretter cellulære redox balance og reducere inflammation. Følgelig har AIMS demonstreret bred antiinflammatorisk og cytobeskyttende aktivitet i mange dyremodeller, såvel som i klinikken [9; 10].

Stigningen i antioxidant og anti-inflammatorisk aktivitet, der forekommer ved behandling med AIMS reducerer tumor incidens og byrde ved kemisk og genetisk inducerede modeller af carcinogenese [11-14]. Ligeledes sigter reducere oxidativt stress og inflammation i mikromiljøet af etablerede tumorer og inhibere tumorvækst, metastase, angiogenese og tumor-medieret immunsuppression [15-20]. Sigter også direkte inhiberer proliferation og inducerer apoptose i tumorceller [1; 2; 21; 22]. Selv om mekanismen bag den direkte anticancervirkning af AIMS på tumorceller ikke er helt forstået, er det kendt, at formål modulere aktiviteten af ​​adskillige cancer-beslægtede proteiner, herunder cyclin D1 [12; 23], CDKN1A (p21) [23], JAK1 og STAT3 [24; 25]., HER2 [26], og nuklear faktor kappa B (NF-KB) [27-29]

Selvom Nrf2 spiller en anticancer rolle i tumormikromiljøet, har det været foreslået at have den modsatte effekt i maligne celler [30; 31]. Nylige genetiske analyser af humane tumorer har vist, at mutationer i

KEAP1

eller

Nrf2

-som resultat i høje niveauer af vedvarende Nrf2 aktivitetsbaseret er forbundet med øget proliferation, kemoresistens og dårlig overlevelse [30 ; 31]. Andre mekanismer Nrf2 aktivering er også blevet identificeret, herunder reduceret

KEAP1

udtryk på grund af promotor hypermethylering eller miRNA udtryk [32-34], og forøget ekspression af

Nrf2

grund aktiverede onkogener, såsom KRAS [35]. Det er blevet foreslået, at forhøjet Nrf2 aktivitet giver en overlevelsesfordel til tumorceller ved at øge antioxidantniveauer at styre overskydende reaktive oxygenarter (ROS) og reaktive nitrogenforbindelser (RNS), som er fælles træk for kræft [35]. Disse observationer rejser spørgsmålet om, hvorvidt farmakologiske midler, som aktiverer Nrf2 via KEAP1 hæmning kunne fremme kræft vækst eller øge terapeutisk modstand [31; 36; 37]. Dette spørgsmål er særlig vigtigt i betragtning af potentialet i Nrf2 aktivatorer til at forebygge og behandle en række kroniske inflammatoriske og autoimmune sygdomme [38-40].

I overensstemmelse med den overordnede anticancer aktivitet af målene, er der ingen beviser for, at disse forbindelser øge forekomsten af ​​kræft i dyremodeller [36, 37]; snarere er der stærke beviser for det modsatte [1, 31]. Derfor genetisk induktion af Nrf2 ved tab af KEAP1 funktion synes at have en anden effekt end AIM-medieret aktivering af Nrf2 via KEAP1 hæmning på tumorvækst. Men begge de Nrf2-afhængige virkninger på tumormikromiljøet og Nrf2-uafhængige virkninger på tumorcellerne sandsynligvis bidrager til anticanceraktivitet af målene in vivo. Til vores viden, effekten af ​​AIM-medieret Nrf2 induktion om spredning, overlevelse og kemosensitivitet af isolerede tumorceller ikke tidligere er vurderet.

For at vurdere effekten af ​​AIM-medieret Nrf2 induktion på tumorcellevækst og overlevelse, vi først karakteriseret det basale niveau af Nrf2 aktivitet i et panel af tumorcellelinier at identificere dem, der havde en vildtype KEAP1-Nrf2 akse (dvs. lave basale Nrf2 niveauer), og dem, der havde en dysfunktionel KEAP1-Nrf2 aksen (dvs.., høje basale Nrf2 niveauer). Med denne information, vi evalueret anticancer aktivitet en AIM, RTA 405 (CDDO-ethyl amid) [8; 11; 41-47] i tumorcellelinier hvor Nrf2 aktivitet kunne induceres (dvs. dem med en vildtype KEAP1 -NRF2 akse) i forhold til tumorcellelinjer hvor Nrf2 aktivitet var allerede på dens maksimale niveau (dvs. forhøjet Nrf2 aktivitet på grund af tab af KEAP1 funktion). Til direkte sammenligne virkningerne af tab af KEAP1 funktion til virkningerne af farmakologisk KEAP1 hæmning, vi behandlede vildtype (WT) og

Keap1

– /- murine embryonale fibroblaster med RTA 405 og vurderes spredning og overlevelse, såvel som niveauerne af IKKβ og BCL2-to andre KEAP1 substrater, har kræft fremme aktiviteter. Vi evaluerede også virkningen af ​​RTA 405-medieret Nrf2 aktivering på KRAS proliferation og følsomheden af ​​tumorcellelinier til andre kemoterapeutika. Tilsammen resultaterne fra denne undersøgelse viser, at Nrf2 induktion ved sigter ikke øger celleproliferation eller overlevelse, og at de efterfølgende virkninger af farmakologisk KEAP1 hæmning af mål er forskellige fra dem, der følger af tab af funktionel KEAP1 i tumorceller.

Materialer og metoder

Materialer

RTA 405 (2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9 (11) -dien-28-syre ethylamid) og RTA 402 (methyl-2-cyano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oat) blev syntetiseret af Reata Pharmaceuticals, Inc. (Irving, TX USA). Medmindre andet er angivet, blev alle andre kemikalier indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA). Vildtype og

Keap1

– /- murine embryonale fibroblaster (MEF’er) blev opnået fra Dr. Masayuki Yamamoto (Tohoku University, Japan) [48; 49]. LSL-Kras

G12D MEF blev opnået fra Dr. Tyler Jacks (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA) [50]. Alle andre cellelinier anvendt i denne undersøgelse var fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA USA). ATCC bruger kort tandem repeat (STR) analyse til at screene alle menneskelige cellelinier til ægthed og renhed før distribution. Alle cellelinjer blev passeret i mindre end seks måneder efter genoplivning.

Cell kultur

MEF’er, MCF-7, Panc-1, A549, og HeLa-celler blev dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium ( DMEM), SK-N-SH-celler i Eagles minimale essentielle medium (EMEM), og G-361 celler i McCoys 5A-medium. DMEM og McCoys 5A-medium blev opnået fra Life Technologies, Grand Island, NY USA. EMEM blev opnået fra ATCC, Manassas, VA USA. Alle andre cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 medium (Life Technologies). Dyrkningsmedium blev suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin. FBS bruges i kultur af LSL- Kras

G12D MEF blev varme-inaktiveret. Cellelinjer blev dyrket i nærvær af 5% CO

2 ved 37 ° C.

Cellevækst og klonogene assays

I celletælling eksperimenter, MEF’er (5 x 10

4 celler /brønd) blev udpladet i 6-brønds skåle, der er behandlet med RTA 405 den følgende dag, og talt med forskellige tidsintervaller ved anvendelse af en Vi-cELL XR celle analysator (Beckman Coulter, Indianapolis, IN USA). For klonogene assays, vildtype (1 x 10

3 celler /brønd) og

Keap1

– /- (0,5 x 10

3 celler /brønd) MEF’er blev podet i 6 Tja retter og 6 timer senere, behandlet med RTA 405. Efter syv dage kolonier blev fikseret (1: 7 eddikesyre: methanol) og farvet med 0,5% krystalviolet i methanol. Kolonier af ≥ 50 celler blev talt.

For at bestemme IC

50 og GI

50 værdier blev celler udpladet i plader med 96 brønde og behandlet med RTA 405 ved koncentrationer fra 50 til 1000 nm . Cellevækst blev bedømt under anvendelse af sulforhodamin B (SRB) assayet [51]. Kort fortalt, 50 pi iskold 50% (vægt /volumen) trichloreddikesyre blev sat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved 4 ° C i 1 time. De fikserede celler blev derefter vasket fem gange med ledningsvand og lufttørret natten over. Den følgende dag blev cellerne farvet med 0,4% (w /v) SRB i 1% eddikesyre ved stuetemperatur i 20 minutter. Farvede celler blev derefter vasket fem gange med 1% eddikesyre og lufttørret. SRB farvestof blev opløst ved tilsætning af 200 pi 10 mM Tris-base og absorbansen blev målt ved 490 nm. For IC

50 beslutsomhed blev cellelevedygtighed vurderet efter 48 timers vækst. For GI

50 bestemmelse blev celler i en plade fastgjort ved starten af ​​eksperimentet (tid 0) og celler i et dobbeltsæt af skåle blev behandlet med RTA 405 i 72 timer. Den procentdel af væksten af ​​RTA 405-behandlede celler i forhold til bærerbehandlede celler blev beregnet ved hjælp af følgende ligning: [(T

iT

z) /(CT

z)] x 100, hvor (T

z) er absorbansen på tidspunkt nul, (C) er absorbansværdi fra vehikelbehandlede brønde efter 72 timer, og (T

i) er absorbansværdien fra brønde behandlet med lægemidlet. For kombinationseksperimenter med doxorubicin eller cisplatin blev cellerne forbehandlet med RTA 405 til 2, 6 eller 24 timer og derefter behandlet med doxorubicin eller cisplatin i yderligere 72 timer. IC

50 og GI

50 værdier blev bestemt ud fra dosis-respons-kurver ved hjælp af GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA USA).

Real-time revers transkription PCR

Totalt RNA blev isoleret fra celler med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD USA) og revers transkriberet under anvendelse af Superscript II (Life Technologies). PCR reaktioner blev udført under anvendelse af primere valideret til specificitet og amplifikation effektivitet. Revers transkription og PCR-cyklus information kan findes i S1 Protokoller og PCR-primer-sekvenser er tilvejebragt i S1 tabel.

ribosomprotein S9

(

RPS9

) og

ribosomale protein L19 Hotel (

Rpl19

) blev anvendt som reference- gener for humane og murine prøver hhv. Den relative forekomst af hvert mål genet blev bestemt ved anvendelse af sammenlignende Ct-metoden (ΔΔCt) [52].

KEAP1

Nrf2

sekventering

Genomisk DNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af DNeasy (Qiagen). PCR-amplifikation og sekventering af de kodende exoner af

KEAP1

og exon 2 af

Nrf2

blev udført ved anvendelse af primere som beskrevet tidligere [53, 54]. PCR-produkterne blev oprenset ved anvendelse af QIAquick PCR rensning (Qiagen) og sekventeret ved Sequetech Corporation (Mountain View, CA USA). Alle mutationer blev bekræftet ved sekventering i begge retninger.

Western blotting

Eksperimentelle oplysninger om forberedelse af hele cellelysater og nukleare ekstrakter er i S1 protokoller. Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA USA). Proteiner (20 til 40 ug) blev opløst ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Membraner blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Antistof oplysninger findes i S2 tabel. Peberrod-peroxidase konjugerede sekundære antistoffer var fra Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA USA).

ROS og glutathion analyser

Basal ROS niveauer blev målt ved hjælp af CM-H

2DCFDA (Molecular Probes , Eugene, OR USA). Total glutathionniveauer blev målt under anvendelse af GSH-Glo Glutathione Assay (Promega, Madison, WI USA). Glutathionniveauer blev normaliseret til cellulære protein niveauer ved hjælp SRB-assayet. For at kontrollere for variation mellem eksperimenter, den basale ROS og total glutathion niveau for hver cellelinje blev normaliseret til NCI-H460 (indstillet til en værdi på 1). Yderligere eksperimentelle detaljer for ROS og glutathion assays kan findes i S1 protokoller.

Caspase-3/7 Aktivitetsmenutast

Caspase-3/7 aktivitet blev bestemt som tidligere beskrevet [55] ved brug DEVD- AFC (EMD Biosciences, Billerica, MA USA) som substrat. For at kontrollere for variation mellem eksperimenter, fluorescensen af ​​hver prøve blev normaliseret til 786-0 (indstillet til en værdi på 100).

siRNA

A549, DU 145, og NCI-H460 celler blev omvendt transficeret i OptiMEM med Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies, Grand Island NY USA) og 20 nM siNRF2 eller 20 nM siNTPool (GE Dharmacon, Lafayette, CO USA), L-003755-00-0005 og D-001810-10-05 , henholdsvis). Mock prøver modtog ikke siRNA. Celler blev udpladet i 24-brønds plader ved en densitet på 4 x 10

5 (A549 og DU 145) eller 8 x 10

5 (NCI-H460) celler per brønd eller på 96-brønds plader ved en densitet af 8 x 10

3 (A549 og DU 145) eller 1,6 x 10

4 (NCI-H460) celler per brønd i RPMI 1640-medier suppleret med 10% FBS. Fireogtyve timer efter transfektion blev celler behandlet med DMSO eller RTA 405. Efter 0 blev 24, 48, og 72 timer celler i plader med 96 brønde fikseret med 50% TCA og forarbejdet til SRB-assayet som beskrevet ovenfor. Efter 72 timer blev cellerne i plader med 24 brønde vasket med sterilt PBS og høstet i lysepuffer til western blots.

LSL-Kras

G12D murine embryonale fibroblaster Salg

rekombination af Kras

LSL-G12D allelen blev udført

in vitro

ved hjælp af en selv-udtagelse Cre rekombinase. MEF’er blev inficeret med 500-1000 MOI af mock, Ad-EGFP eller Ad-Cre /EGFP (GeneCopoeia, Rockville, MD USA) adenoviruspartikler ifølge fabrikantens protokol. Celler blev høstet 72 timer efter infektion. Genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen) og PCR blev udført for at evaluere rekombination som beskrevet (https://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/KrasCond_tablesTWO.html). Niveauer af vildtype og Kras

G12D proteiner blev vurderet ved Western blot.

Statistiske analyser

Alle eksperimenter blev udført tredobbelt, medmindre andet er angivet. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism 6.0 software. De anvendes til at bestemme statistisk signifikans metoder er beskrevet i hver figur legende.

Resultater

Klassificering af humane tumorcellelinier ved basal Nrf2 aktivitet

Nrf2 er blevet rapporteret til at være konstitutivt aktiv i tumorer med mutant KEAP1. Hovedformålet med vores undersøgelse var at bestemme, om Nrf2 aktivering af RTA 405 øger cellevækst eller overlevelse i humane tumor linier. Vi ræsonnerede, at RTA 405 ville være i stand til at øge Nrf2 aktivitet i cellelinier med lav eller mutant KEAP1; imidlertid har status KEAP1 og basale aktivitet niveau af Nrf2 blevet rapporteret for meget få fælles cancer linjer [34; 48; 56]. Derfor, for at evaluere effekten af ​​RTA 405, vi først gennemført en række forsøg for at karakterisere status KEAP1 og Nrf2 i et panel af tyve humane tumorlinjer (tabel 1). For at opnå dette, vi sekventeret alle kodende exons af

KEAP1

og exon 2 af

NFE2L2

at afgøre, om nogen af ​​de cellelinjer havde mutationer i disse gener. Vi begrænsede

NFE2L2

sekventering til exon 2, fordi det koder for KEAP1-interagerende domæne og har tidligere vist sig at huse aktiverende mutationer [30; 53]. Vores sekventering resultater bekræftede de tidligere identificerede

KEAP1

mutationer i A549 og NCI-H460 ikke-småcellet lungecancer cellelinier [54] og identificeret en ny mutation (Q193H) i NCI-H23-cellelinje, som er også afledt af ikke-småcellet lungecancer (tabel 1). Vi fandt ingen mutationer i exon 2 af

NFE2L2

i dette panel af cellelinjer.

Ud over

KEAP1

og

NFE2L2

mutationer , andre mekanismer-såsom promotor hypermethylering, miRNA udtryk og onkogen signalering-kan resultere i høje konstitutive niveauer af Nrf2 aktivitet [32-35]. For at afgøre, om nogen af ​​de cellelinjer uden

KEAP1

eller

NFE2L2

mutationer havde høje basale niveauer af Nrf2 aktivitet, vi målte KEAP1, nuklear Nrf2, og NQO1 (en prototypisk Nrf2 target-gen) protein niveauer ved Western blot. Vi fandt, at, trods vildtype

KEAP1

NFE2L2

gener, flere af de cellelinjer havde karakteristika forhøjet Nrf2 aktivitet. For at lette analysen, vi grupperet de cellelinjer i tre kategorier: dem med lav, moderat eller høj basal Nrf2 aktivitet (figur 1A, ubeskårne blots er i S1 Fig). I cellelinier med lav basal Nrf2 aktivitet (

n

= 8), aktiviteten af ​​KEAP1 syntes tilstrækkelige til at fremme Nrf2 nedbrydning, hvilket resulterer i lave niveauer af NQO1 (Fig 1A og 1B, øvre paneler). I cellelinier med moderat basal Nrf2 aktivitet (

n

= 5), vildtype KEAP1 var detekterbar, men er syntes at være utilstrækkelig til helt at undertrykke Nrf2 aktivitet, hvilket resulterer i detekterbare niveauer af NQO1 (Fig 1A og 1B , mellemledere paneler). Cellelinjer med høj basal Nrf2 aktivitet (

n

= 7) havde enten mutant eller lave niveauer af KEAP1, som syntes at gøre den i stand til at målrette Nrf2 for nedbrydning (Fig 1A og 1B, lavere paneler). Som et resultat, blev der påvist et højt nukleart Nrf2 og NQO1 i disse cellelinjer.

A. Skematisk diagram, der viser karakteristika af cellelinier med lav (øvre panel), moderat (midterste panel) eller høj (nedre panel) basal Nrf2 aktivitet. B. Protein niveauer af KEAP1 og NQO1 (hel-cellelysat), og Nrf2 (nuklear fraktion), blev evalueret ved Western blot. Actin (hel-cellelysat) og HDAC2 (nuklear fraktion) tjente som lastning kontrol. Baseret på KEAP1, Nrf2, og NQO1 protein niveauer blev cellelinjer kategoriseret efter deres basale Nrf2 aktivitet

De fleste af de cellelinjer kunne kategoriseres i en af ​​de tre grupper.; men enkelte besad karakteristika mere end en gruppe. For eksempel, når sammenlignet med andre cellelinier i det lave basale Nrf2 aktivitetsgruppe, SK-N-SH linje havde relativt lave niveauer af KEAP1 (Fig 1B, øvre panel). Men baseret på de lave niveauer af nukleare Nrf2 og NQO1 de KEAP1 niveauer i denne linje viste sig at være tilstrækkelige til at fremme Nrf2 nedbrydning. Omvendt, når sammenlignet med de andre cellelinjer i den høje basale Nrf2 aktivitetsgruppe, NCI-H460 linje havde relativt høje niveauer af KEAP1 (Fig 1B, nedre panel). Det er imidlertid kendt, at

KEAP1

muteres (D236H) i NCI-H460 celler, og at Nrf2 er konstitutivt aktiv [54]. Trods meget høje niveauer af nukleare Nrf2 i A498-cellelinje, blev påvist relativt lave niveauer af NQO1. Men denne cellelinie udviste adskillige andre karakteristika, der stemte overens med høj basal Nrf2 aktivitet (se nedenfor); hvilket tyder på, at NQO1 selv kan gå tabt eller muteret. Endelig, selv om KEAP1 var mutant (Q193H) i NCI-H23-cellelinje (tabel 1), Nrf2 aktivitet syntes at være lav, hvilket tyder på, at Q193H mutation kan være en polymorfisme, der ikke mindsker KEAP1 funktion. Dette er i overensstemmelse med resultater fra en nylig undersøgelse, hvor 4 af 18 KEAP1 mutationer identificeret i lungekræft prøver ikke forringe evne KEAP1 til at fremme Nrf2 degradataion [57].

Karakterisering af humane tumorcellelinier med forskellige niveauer af basal Nrf2 aktivitet

for yderligere at validere klassificeringen af ​​cellelinjer, vi målte niveauer af andre biomarkører for Nrf2 aktivitet, herunder

NQO1

mRNA, ROS og glutathion niveauer. Som nævnt ovenfor

NQO1

er et prototypisk Nrf2 målgen og man ville forvente dens transkription at være forhøjet i cellelinier med høj basal Nrf2 aktivitet. Sammenlignet med cellelinjer med lav basal Nrf2 aktivitet, dem med moderat og høj basal Nrf2 aktivitet havde successivt højere niveauer af NQO1 udtryk (Fig 2A og S2 Fig). Ud over

NQO1

, Nrf2 også regulerer ekspressionen af ​​flere gener involveret i glutathion syntese og stiger cellulære glutathion niveauer [58]. I overensstemmelse hermed blev de samlede glutathionniveauer signifikant forhøjet i cellelinier med høj basal Nrf2 aktivitet sammenlignet med dem med lav eller moderat basal Nrf2 aktivitet (Fig 2B og S2 Fig). Ved at øge glutathion niveauer samt ekspression af andre antioxidant gener, Nrf2 reducerer oxidativ stress. At vurdere niveauet af oxidativt stress i hver tumorcellelinie, målte vi ROS-niveauer under anvendelse af en fluorescerende probe. Vi fandt, at ROS-niveauer var lavest i cellelinier med høj basal Nrf2 aktivitet (Fig 2C og S2 Fig). Derfor, i resumé, cellelinier med høj basal Nrf2 aktivitet havde høj NQO1 mRNA niveauer, høje glutathion niveauer, og lave ROS niveauer. Endvidere NQO1 og glutathionniveauer forhøjes i forhold til niveauet af basal Nrf2 aktivitet. I modsætning hertil ROS niveauer ikke følge en lignende tendens: Der var ingen forskel mellem cellelinjer med lave og moderate Nrf2 aktivitetsniveau. Dette antyder, at moderat aktivering af Nrf2 er tilstrækkelig til at forøge målgenekspression og glutathion-syntese, men Nrf2 aktivitet skal være en vis tærskel, som kun kan opnås, når KEAP1 er fraværende eller inaktive, for at reducere ROS-niveauer.

A.

NQO1

mRNA-niveauer for individuelle cellelinjer blev målt ved qPCR og normaliseret til den gennemsnitlige basale

NQO1

niveau for alle cellelinier med lav basal Nrf2 aktivitet. B. Total glutathion niveauer for de enkelte cellelinjer blev normaliseret til NCI-H460 (sat til en værdi af 1), der blev kørt som en reference i hvert forsøg. De viste værdier blev normaliseret til det gennemsnitlige basale glutathion niveau for alle cellelinier med lav basal Nrf2 aktivitet. C. Reaktive ilt arter (ROS) niveauer for de enkelte cellelinjer blev normaliseret til NCI-H460 (sat til en værdi af 1), der blev kørt som en reference i hvert forsøg. De viste værdier blev normaliseret til det gennemsnitlige basale ROS niveau for alle cellelinier med lav basal Nrf2 aktivitet. D-E. Basal IKKβ (D) og BCL2 (E) proteinniveauer i humane tumorcellelinier med lav, moderat eller høj basal Nrf2 aktivitet. Fejlsøjler i A-C er SEM. Statistisk signifikans blev bestemt ved Mann-Whitney-test. *,

P

0,05; **,

P

0,01; ***,

P

. 0,001

Udover Nrf2, KEAP1 regulerer niveauet af andre proteiner, herunder IKKβ og BCL2 [59; 60]. KEAP1 direkte binder til, og letter ubiquitinering af IKKβ og BCL2 af CUL3 /RBX1 E3 ligase kompleks. Dette fører til nedbrydning af IKKβ og BCL2 af proteasomet. Derfor, tab af KEAP1 i cellelinjer resulterer i forhøjede niveauer af IKKβ og BCL2 [59; 60] er, og IKKβ niveauer forhøjet i humane tumorer med lave KEAP1 /CUL3 niveauer [59; 61]. IKKβ er en kinase, der fremmer nedbrydning af nuklear faktor kappa let polypeptid genenhancer i B-celler inhibitor, alfa (NFKBIA eller kBa), en suppressor af NF-KB-transkriptionsfaktoren, som styrer ekspressionen af ​​mange gener involveret i overlevelse, og BCL2 er et onkogen med anti-apoptotisk aktivitet. I betragtning af forholdet mellem KEAP1, IKKβ, BCL2, og kræft, vi undersøgt, om de tumorcellelinjer med høj basal Nrf2 aktivitet også havde forhøjede IKKβ og BCL2 protein niveauer. Vi fandt, at mange cellelinier i panelet tendens til at have høje niveauer af IKKβ (S3 Fig). Imidlertid blev IKKβ niveauer forhøjede i 100% af cellelinier med høj basal Nrf2 aktivitet, sammenlignet med 80% af cellelinier med moderat Nrf2 aktivitet, og 62,5% af cellelinier med lav Nrf2 aktivitet (figur 2D). Da vi undersøgte BCL2, fandt vi, at færre af de cellelinjer havde forhøjede BCL2 niveauer (S3 Fig). I de cellelinier med høj basal Nrf2 aktivitet, 71% havde også høje BCL2 niveauer sammenlignet med 37,5% og 20% ​​af cellelinier med lav og moderat Nrf2 aktivitet hhv. Ligesom glutathion niveauer, IKKβ niveauer steg i forhold til niveauerne af basal Nrf2 aktivitet, hvorimod BCL2 niveauer blev forhøjet i en større brøkdel af cellelinjer, der havde høj Nrf2 aktivitet, sammenlignet med dem med lav eller moderat Nrf2 aktivitet. Dette tyder på, at forskellige KEAP1 substrater kan have forskellige følsomheder til ændringer i KEAP1 funktion. Tilsammen disse data er i overensstemmelse med den opfattelse, at tabet af KEAP1 påvirker flere mål, der er relevante for kræft cellebiologi, herunder ikke kun Nrf2, men også IKKβ og Bcl2 [62].

IKKβ og BCL2 niveauer i

Keap1

– /- murine embryonale fibroblaster

Vi har vist, at niveauerne af IKKβ og BCL2 tendens til at være højere i tumorcellelinier, der har høj basal Nrf2 aktivitet, hvilket antyder, at mutant eller lave /fraværende niveauer af KEAP1 kan bidrage til forhøjede IKKβ og Bcl2 niveauer. Vi brugte næste vildtype (WT) og

Keap1

– /- murine embryonale fibroblaster (MEF’er) som model for direkte vurdere forholdet mellem KEAP1, IKKβ, og BCL2 niveauer. Som tidligere rapporteret [49], Nrf2 blev forhøjet i

Keap1

– /- MEF’er (S4 Fig). Behandling med RTA 405 øget Nrf2 niveauer i WT MEF, men ikke i

Keap1

– /- MEF’er (S4 Fig). I overensstemmelse med Nrf2 aktivering, proteinet (A) og mRNA (Fig 3B) niveauer af NQO1 og GCLM, to Nrf2 målgener blev forhøjet i

Keap1

– /-

MEF . Ud over forhøjede niveauer af Nrf2 og dens downstream målgener, vi fandt også, at niveauerne af IKKβ og BCL2 var højere i

Keap1

– /- MEF end i WT MEF (Fig 3A). For at bestemme om de forhøjede IKKβ niveauer korrelerede med en stigning i dens aktivitet vurderede vi niveauerne af nedstrøms komponenter i NF-KB-signalering pathway. IKKβ phosphorylerer kBa, hvilket fører til dens nedbrydning og efterfølgende aktivering af NF-KB-transkriptionsfaktoren. I overensstemmelse med højere IKKβ aktivitet, vi observerede lavere niveauer af kBa (Fig 3A) og signifikant højere ekspressionsniveauer af flere NF-KB målgener, herunder

CCND1

,

MMP9

,

Ptgs2

,

VEGF

,

og Bcl2l1

, i

Keap1

– /- MEF’er sammenlignet med WT MEF (fig 3C og S5 fig). Der var ingen signifikante forskelle i

CCL2

,

Birc3

eller

Il1b

niveauer, og af ukendte årsager

Ccl5

niveauer signifikant højere i WT MEF end i

Keap1

– /- MEF’er (S5 Fig). Taget sammen viser disse resultater, at tab af KEAP1 resulterer i højere IKKβ og BCL2 niveauer, og at forhøjet niveau af IKKβ fører til en stigning i NF-KB transkriptionel aktivitet. Disse resultater stemmer overens med den observation, at tabet af KEAP1 var korreleret med højere NF-KB transkriptionel aktivitet i humane tumorer [61].

A. Basale niveauer af KEAP1-interagerende proteiner og efterfølgende mål blev evalueret i WT og

Keap1

– /- MEF’er ved Western blot. GAPDH tjente som en belastning kontrol. B. Basal mRNA niveauer af

Nqo1

Gclm

i WT og

Keap1

– /- MEF’er målt ved qPCR. mRNA-niveauer i

Keap1

– /- celler blev normaliseret til WT celler. *,

P

0,05; **,

P

.01 Vs. WT ved parret t-test. C. Basal mRNA niveauer af

CCND1

,

MMP9

,

Ptgs2

, og

VEGF

i WT og

Keap1

– /- MEF’er målt ved qPCR. mRNA-niveauer i

Keap1

– /- celler blev normaliseret til WT celler. ***,

P

0,001; ****,

P

.0001 Vs. WT af t-test. For alle paneler, datapunkter er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. Fejl barer er SD

Vækst rate af celler med forskellige niveauer af basal Nrf2 aktivitet

Tab af KEAP1 er blevet rapporteret at øge udbredelsen på MEF. [48; 63]. For at bekræfte og udvide disse undersøgelser, vi tælles antallet af levedygtige WT og

Keap1

– /- MEF’er ved 24-timers intervaller efter såning. 0,01; 0,01; 0,0001; 0,01; 0,001. 0,01;