PLoS ONE: kromosomafvigelser i blærekræft: Frisk versus Formalin Fixed Paraffin Embedded Tissue og målrettet FISK versus Wide Microarray-Based CGH Analysis

Abstrakt

Blære carcinogenese menes at følge to alternative veje drevet af tabet af kromosom 9 og forstærkningen af ​​kromosom 7, omend andre ikke-tilfældige kopital ændringer (CNAs) blev identificeret. Der er imidlertid behov bekræftelse undersøgelser, da mange aspekter af denne model fortsat uklare og betydelig heterogenitet blandt sager er opstået. Et af formålene med denne undersøgelse var at evaluere resultaterne af en målrettet test (UroVysion assay) i vid udstrækning anvendes til påvisning af Transitional Cell Carcinoma (TCC) i blæren, i to forskellige typer af materiale fra den samme tumor. Vi sammenlignede resultaterne af UroVysion test udført på frisk isoleret interphasic Nuclei (FIN) og på Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE) væv fra 22 TCCs og vi fandt ikke væsentlige forskelle. Et andet mål var at vurdere overensstemmelsen mellem vifte-CGH profiler og de målrettede kromosomale profiler af UroVysion assay på et ekstra sæt af 10 TCCs, med henblik på at vurdere, om UroVysion er en tilstrækkeligt følsom metode til identifikation af udvalgte aneuploidier og ikke-tilfældig CNAs i TCCs. Vores resultater bekræftede vigtigheden af ​​globale genomiske screeningsmetoder, der er vifte baseret CGH, at omfattende bestemme de genomiske profiler af store serier af TCCs tumorer. denne teknik har imidlertid endnu visse begrænsninger, såsom ikke at kunne detektere mosaicisme lavt niveau, eller ikke påvise eventuel ændring i antallet af kopier for en slags kompenserende virkning på grund af tilstedeværelsen af ​​høje cellulær heterogenitet. Således er det stadig tilrådeligt at bruge komplementære teknikker som matrix-CGH og FISH, da førstnævnte er i stand til at opdage ændringer på genomet niveau ikke udelukker enhver kromosom, men sidstnævnte er i stand til at opretholde de enkelte data på niveau med single celler, selv om det fokuserer på nogle genomiske regioner

Henvisning:. Panzeri E, Conconi D, Antolini L, Redaelli S, Valsecchi MG, Bovo G, et al. (2011) kromosomafvigelser i blærekræft: Frisk versus Formalin Fixed Paraffin Embedded Tissue og målrettet FISK versus Wide Microarray-Based CGH Analysis. PLoS ONE 6 (9): e24237. doi: 10,1371 /journal.pone.0024237

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: Juni 8, 2011; Accepteret: August 3, 2011; Udgivet 1. september, 2011

Copyright: © 2011 Panzeri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Associazione Gianluca Strada Onlus og af Regione Lombardia, Ring per PROGETTI indipendenti i ambito oncologico 2009. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den syvende mest almindelige kræftform i verden [1] og den fjerde mest almindelige kræftform diagnosticeret hos mænd i. USA og europæiske lande [2]. Transitional Cell Carcinoma (TCC) omfatter størstedelen af ​​blære kræft tegner sig for mere end 90%. Ved præsentationen, de fleste (-70%) er overfladiske, eksofytiske, papillære tumorer, er godt differentierede (lav kvalitet, LG) og ikke trænge epitelbasalmembranen (stadie Ta) [1], [3]; de resterende er musklen invasive (T2-T4) eller microinvasive tumorer (T1), der er trængt lamina propria, men er ikke invaderer musklen. I dette mindretal, er tumor epitel dårligt differentierede (high-grade, HG), og ofte forbundet med carcinom

in situ

(CIS), der på trods af sin overfladiskhed er sammensat af dårligt differentieret epitel. Dette menes at være repræsentativ for en forløber læsion [1]. Prognose for LG Ta tumorer er generelt godt, fordi sådanne tumorer sjældent fremskridt, men overvågning er nødvendig i betragtning af den betydelige risiko for recidiv (op til 70%) [4]; dette er nødvendigt også for HG Ta (TAG3) og T1 tumorer, der frembyder en stor risiko for progression til muskel invasion. For patienter med muskel invasive tumorer (≥T2), metastase er et stort klinisk problem og cystectomies sædvanligvis angivet. Prognosen er forholdsvis fattige med kun 50% overlevelse ved 5 år siden diagnose [4].

De biologiske forskelle mellem disse grupper sandsynligvis afspejler det underliggende genetiske heterogenitet, som fører til specifikke veje for tumorudvikling og progression. Utallige undersøgelser har sporet status af kendte onkogener og tumorsuppressorgener og har afsløret flere tilbagevendende kromosomale ændringer i forbindelse med den patologiske scenen og /eller resultatet af tumoren [5], [6]. Desuden er baseret på de velkendte genetiske ændringer af blærecancer, en multi-target fluorescens in situ hybridisering (FISH) assay er blevet udviklet [7]. Den UroVysion FISH detection system, der er godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration, er baseret på tre centromere sonder for kromosomer 3, 7 og 17, og en fjerde sonde til 9p21 region, til påvisning af kromosomale aneusomy og /eller sletning af 9p21 locus , som er almindelige genetiske ændringer i TCCs [8], [9]. UroVysion er oprindeligt brugt i det sidste årti kun for overvågning, men for nylig også som blærekræft screening værktøj i patienter med hæmaturi [10] – [12]. Men andre metoder er blevet anvendt, for at opdage kopital ændringer i forbindelse med tumor udvikling og progression af TCC. Konventionelle komparativ genomisk hybridisering (CGH) undersøgelser har givet en hel del oplysninger, herunder identifikation af en række genomiske regioner af DNA-amplifikation indeholdende kendte eller kandidatlande onkogener [13] – [15]. På den anden side, har placeringen af ​​tumor suppressor gener i TCC stort set blevet identificeret ved tab af heterozygositet (LOH) analyse [16]. Med brugen af ​​den høje opløsning kortlægning af matrix-baserede CGH blev nye kopi nummer ændringer (CNA’er) identificeret i mange små genomiske regioner, der ikke blev påvist i tidligere undersøgelser [17] – [19]. De indsamlede data hidtil, udover identificering af mindst to cytogenetiske pathways for tumorudvikling, dvs. tabet af kromosom 9 og forstærkningen af ​​kromosom 7 [20] – [22], kan være nyttige i udformningen af ​​nye individualiserede behandlinger. Der er imidlertid behov bekræftelse undersøgelser, da mange aspekter af denne model fortsat uklare, især på den kronologiske rækkefølge af de afvigelser under deres sygdom. For en fornuftig identifikation af de gener ligger til grund for kromosomafvigelser, bliver det afgørende at bruge pålidelige teknikker og til at gå gennem data valideringsprocessen. Dette spørgsmål blev for nylig behandlet for prostata- og brystkræft, gliomer og myelomatose [23] – [27], men ikke for blærekræft. Selvom formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) prøver har flere fordele, såsom sikkerhed for histologisk diagnose og tillader retrospektive studier af et stort antal prøver, der friske væv betragtes som den mest pålidelige til molekylær genetisk analyse; de giver en omfattende analyse af biopsi, selvom materialet ikke har en histologisk diagnose.

Det første mål for denne undersøgelse var at evaluere resultaterne af en målrettet test i to forskellige typer af materiale fra den samme svulst. I det første trin i forhold vi resultaterne af UroVysion test udført på frisk isoleret interphasic Nuclei (FIN) og FFPE væv fra 22 TCCs (Figur 1). Desuden et andet mål var at vurdere overensstemmelsen mellem vifte-CGH profiler og de målrettede kromosomale profiler, med henblik på at vurdere, om UroVysion er en tilstrækkeligt følsom metode til identifikation af udvalgte aneuploidier og ikke-tilfældig CNAs i TCCs. Det andet trin i sammenligning blev anvendt på et ekstra sæt af 10 TCCs mellem data fra enten vifte-CGH på FIN og fra UroVysion analyse på FFPE væv (Figur 1).

De to trins strategi analyse anvendt i denne undersøgelse

Resultater

første trin i analysen:. sammenligning mellem UroVysion data fra FIN og FFPE

TCC kan skelnes i høj eller lav kvalitet (HG eller LG) og i muskel invasive eller ikke (IN eller NI). I det første trin i analysen 22 TCCs (9 LGNI, 1 LGIN, 3 HGNI, 9 HGIN) blev analyseret ved UroVysion test anvendes i to eksemplarer fra samme biopsi på FFPE og FIN prøver (Figur 1).

I analysen bygger på multinomial model, FIN data var generelt sammenlignelige med dem, udvundet fra FFPE modstykke i LGNI gruppe, i form af procentdele af tab, disomi og forstærkning (tabel 1 for en detaljeret liste se tabel S2). Derimod i HGNI gruppe de to typer af analyse genereret overensstemmende resultater kun for CEP 3 (Kromosom Enumeration Probe 3). Faktisk i CEP 7 og CEP17, FIN tendens til at detektere en lavere procentdel af både tab (1,7 vs 10 for CEP 7; 6 vs 11,3 for CEP17) og disomi (42,7 vs 62,3 for CEP7; 48, 3 vs 60,7 for CEP17); følgelig en højere procentdel af forstærkning er blevet rapporteret (55,7 vs. 27,7 for CEP7; 45,7 vs 28 til CEP 17). Endelig for Locus Specifik Identifier (LSI) 9p21 FIN tendens til at detektere en højere procentdel af både disomi (58,3 vs. 20,0) og gain (10,3 vs 8,7), men en lavere procentdel af tab (31,3 vs 71,3). På den anden side, i HGIN gruppere de to typer af analyse genereret uoverensstemmende resultater kun for CEP 3: FIN tendens til at detektere en højere procentdel af tab (14,9 versus 2,2) og en lavere procentdel af forstærkning (48,1 vs. 62,5) end FFPE.

Disse resultater blev bekræftet i mere raffineret analyse af en Poisson model (figur 2). I LGNI gruppe, det gennemsnitlige antal signaler for CEP3, CEP7, CEP17 og for 9p21 regionen var 2,3, 1,8, 2,0, 0,5 (i FIN prøver) og 2,4, 2,1, 2,2, 0,9 (i FFPE) med ingen signifikant forskel mellem de to typer af test (Figur 2, A). På den anden side, i HGNI gruppe det gennemsnitlige antal signaler for CEP3, CEP7, CEP17 og for 9p21 region var 2,5, 2,9, 2,7, 1,8 (i FIN prøver) og 2.3, 2.3, 2.3, 1.2 (i FFPE) med statistisk signifikante forskelle mellem de to tests med undtagelse af CEP3 (figur 2, B). Omvendt i HGIN gruppe, det gennemsnitlige antal signaler for CEP3, CEP7, CEP17 og for 9p21 region var 2,5, 2,7, 2,3, 1,2 (i FIN) og 3,0, 2,7, 2,7, 1,2 (i FFPE prøver), med betydelig forskel for CEP3 (figur 2, C).

Anslået optælling af signaler observeret i hver probe (med 95% konfidensinterval) opnået i hver type af tumor, der tegner sig for klyngedannelse. De rapporterede p-værdier refererer til sammenligningen mellem FFPE og FIN metoder. Panel A = LGNI (9 patienter); panel B = HGNI (3 patienter); panel C = HGIN (9 pts).

Genomisk kopi nummer forandringer (CNA’er) i frisk isolerede kerner (FIN) ved matrix-CGH

I det andet trin af vores analyse, vi uropført vifte-CGH på et ekstra sæt af 10 TCCs (6 HGIN, en HGNI, 3 LGNI), for at opdage CNAs mellem tumor og reference-DNA. De hyppigste CNAs er opsummeret i tabel 2 (detaljeret udgave i tabel S3). Vi klassificeret prøverne i to kategorier: infiltrerer tumorer (IN-TCCs: 70CR09, 81CR09, 04CR10, 09CR10, 10CR10, 26CR10) og ikke infiltrerende tumorer (NI-TCCs: 28CR09, 75CR09, 80CR09, 82CR09) (Figur 3). Generelt, som forventet, IN-TCCs har mange flere CNAs end NI-TCCs. 20Q gevinst blev delt af 4/6 IN-TCC tumorer, mens 2/4 NI-TCCs; 3p25.2 og 17q21 gevinster ved 4/6 IN-TCC tumorer og 1/4 NI-TCCs; 5p og 20p gevinst ved 3/6 IN-TCC og 2/4 NI-TCCs; 6p22.3 og 11q13 blev kun delt af IN-TCC (3/6 og 2/6 henholdsvis); endelig 3K og 8q var i 1/6 IN-TCCs og 1/4 NI-TCCs. For tabene: 9 p og 9p21 var i 4/6 og 3/6 IN-TCCs mens i 2/4 og 3/4 NI-TCCs; 9q32-q34 var i 3/6 IN-TCCs og 2/4 af NI-TCCs; 2q tab var i 3/6 IN-TCCs og 1/4 NI-TCCs; 8p tab kun i 2/6 IN-TCCs

CNAs af 10 TCCs prøver:. 6 infiltrerer tumorer (IN-TCCs: 70CR09, 81CR09, 04CR10, 09CR10, 10CR10, 26CR10) til venstre, og 4 ikke – infiltrerer tumorer (NI-TCCs: 28CR09, 75CR09, 80CR09, 82CR09) til højre. Hver prik /bar svarer til én prøve. Tab fremgår i grønt, mens gevinster i rødt.

For at identificere mulig berigelse af funktionelle grupper i generne inden regioner med gevinst og tab af HGIN og LGNI tumorer, et gen ontologi annotation analyse var udført under anvendelse af GOstat software. For HGIN opstod en statistisk signifikant underrepræsentation (p 0,05) af gener involveret i celledifferentiering, i cellecyklus og i positiv regulering af apoptose og programmeret celledød; derudover en statistisk signifikant overrepræsentation af gener involveret i celledeling og i regulering af apoptose. På den anden side analysen fremgår for LGNI tumorer en statistisk signifikant underrepræsentation af gener involveret i induktion af apoptose og programmeret celledød (tabel S4)

Andet trin af analyse:. Sammenligning mellem matrix-CGH profiler på FIN og UroVysion data om FFPE

Vi næste udført FISH-analyse ved hjælp af Urovysion test på ekstra sæt af 10 TCCs analyseret ved matrix-CGH; når det er muligt, blev to tumorale områder af den samme sektion scoret for at øge antallet af celler analyseret og at have data så repræsentativt som muligt i betragtning af den kendte heterogenitet i denne type af cancer. For hver probe blev udført en statistisk analyse for at kontrollere, at signalet regner med 100 celler var forskellige overvejer de to områder hver for sig eller blande dem sammen. Overensstemmende resultater mellem de to tumorale områder blev rapporteret i to HGIN tilfælde (070CR09 og 081CR09) (figur 4, A); omvendt statistisk signifikante kontrasterende resultater (p 0,05) blev rapporteret i to HGIN tilfælde (009CR10 og 026CR10) (Figur 4, B); i de resterende seks tilfælde statistisk signifikante forskelle mellem de to tumorale områder var dokumenteret for én (010CR10), to (028CR09 og 080CR09) eller tre prober (004CR10) (se også tabel S5). Disse data understregede generelt høje intra-tumor heterogenitet af disse prøver

Sammenligning mellem resultater på to udvalgte tumorale områder af samme afsnit af FFPE: (A):. De to mest overensstemmende tumorer (070CR09 og 081CR09); (B):. De to mest disharmoniske tumorer (009CR10 og 026CR10)

Så vi gjorde et forsøg på at sammenligne UroVysion data om FFPE netop rapporteret med matrix-CGH profiler fra de 10 TCCs, beskrevet ovenfor. Til dette formål for hver prøve ekstrapoleret vi resultaterne for matrix-CGH-analyse svarende til de fire UroVysion målrettede kromosomer og sammenlignet dem med FISH data (tabel 3). Fuld konkordans blev fundet kun 28CR09 (HGNI) og 09CR10 (HGIN) (grå områder i tabel 3). Men af ​​de andre tumorer, er observeret mellem de to teknikker, en rimelig god korrelation; dvs. for tumorer 010CR10 og 070CR09 (begge HGIN) konkordansen blev bevist for 3/4 målrettede kromosomer. Se figur 5 for to eksempler på mere overensstemmende (D) og mindre overensstemmende (E) data. Jo større konkordans blev set for kromosom 3 (7/10), mens de andre målrettede kromosomer viste en rimelig korrelation (6/10). For eksempel i 082CR09 (LGNI) og i 04CR10 (HGIN) blev 9p21 tab fremgår kun af FISH-analyse; på den anden side amplifikationen ved locus 3p25 for 028CR09 (HGNI) og for 070CR09 (HGIN) opstod kun fra arrayet-CGH data. For at validere vifte-CGH data og til at skelne en polysomy af kromosom 3 fra en sand forstærkning blev FISH analyse udført med både Urovysion test assay og tofarvet split sonde PPARy (3p25), på to på hinanden følgende FFPE sektioner af 028CR09 ( Figur 5, C). En statistisk analyse af signal regner med 100 kerner vurderede sande forstærkning ved 3p25 forhold til en polysomy af kromosom 3 (

t-test

: p 0,01).

Urovysion test anvendes til: (A ): FIN prøve 032CR07 (HG NI); (B): FFPE prøve 080CR09 (LG NI). (C) FISH med

PPAR

γ sonde på 028CR09 (HGNI). Urovysion versus matrix-CGH data: eksempel på overensstemmende data (D), (prøve 080CR09); og ikke-overensstemmende data (E), (prøve 004CR10).

Diskussion

På trods af den omfattende forskning i genetiske ændringer af blærekræft og detaljerede modeller, som forbinder sådanne ændringer til tumor initiering og progression [20] – [22], er der kun få pålidelige markører til at skelne tumorer med aggressive egenskaber på tidspunktet for tidlig diagnose, og vi er stadig på udkig efter metoden til valg til at opdage dem. I denne forbindelse har en nyere prospektivt studie endda foreslået, at cystoskopi alene forbliver den mest omkostningseffektive strategi til påvisning tilbagefald for blærekræft ikke invaderer musklen [28]. Men i modsætning til, hvad der tidligere er rapporteret af andre [29], flere forfattere hævdede, den samme konklusion [30], og den rolle, Urovysion i mistænkelige urinprøver forblev tvivlsom, især i lyset af de høje omkostninger.

udviklingen af ​​arrayet-CGH førte til muligheden for at analysere hele genomet i et enkelt forsøg, hvilket tyder på dens mulige anvendelse i screening /overvågningsprogrammer kræftpatienter. I tilfælde af blærecancer, ville arrayet-CGH giver mulighed for at analysere DNA fra en biopsi af tumoren, mens ved Urovysion urinprøver sædvanligvis analyseres.

De største ulemper ved denne teknik er, at selv hvis den er specifik og følsom, det er invasiv og stadig dyrt. Desuden til dato er der ingen tilstrækkelige data til at understøtte brugen af ​​matrix-CGH i denne form for programmer, men det kunne være interessant at anvende denne teknik til patienternes kategorier med høj risiko kræft.

multitarget Urovysion assay er blevet udviklet til påvisning af TCC i urinprøver [7]. Den optimale FISH probe sæt blev bestemt ved at teste forskellige prober for TCC påvisning i urin fra patienter med blærecancer og vælge dem, der var enten den mest følsomme individuelt eller som suppleret andre prober at øge den samlede følsomhed af testen. CEP sonder og LSI 9p21 var komplementære, fordi CEP sonder opdage hyperdiploidy, almindelig i karcinom

in situ

og invasive TCC, mens LSI 9p21 sonden registrerer deletioner af 9p21 band, fælles i ikke-invasiv TCC [7 ]. Det er tidligere blevet foreslået, at en falsk-negative FISH resultat repræsenterer det meste lav kvalitet TCC, der ikke kaste tumorceller i urinen eller ikke udviser de kromosomale ændringer, der registreres af analysen [11]. Anden grænse, og en anden mulig forklaring på falsk negative FISH resultater, kan tilskrives det lave antal neoplastiske celler til stede i prøverne [30].

I det første trin af denne undersøgelse har vi sammenlignet udførelsen af denne multitarget assay til påvisning af blære tumorceller både i FIN, uden histologisk diagnose og selv med et lavt antal neoplastiske celler, og i FFPE væv. Vores analyse fremgår en god korrespondance Urovysion FISH data mellem FIN og FFPE for LGNI og HGIN tumorer; navnlig i den førstnævnte gruppe, FIN havde tendens til at detektere et mindre antal signal hensyn til FFPE, mens der i sidstnævnte gruppe en modsat tendens blev værdsat. For HGNI TCCs, væsentlige forskelle opstået tre målrettede sonder, men det kunne være på grund af det lave antal prøver af denne gruppe. Udførelsen af ​​denne målrettede test er derfor tilstrækkeligt acceptabelt også på FIN prøver; desuden de samme CNAs blev trofast reflekteret af analysen på FFPE. Det er fortsat at undersøge, om det er en effektiv metode til at påvise de mest repræsentative og effektive CNAs af TCCs. Til dette formål, i det andet trin af denne undersøgelse blev vifte-CGH udført på 10 ekstra TCCs at dissekere det spektrum af ændringer i blærekræft og identificere tilbagevendende afvigelser, der kan indeholde kræft-relaterede gener.

Vi opdaget adskillige genetiske ændringer ved matrix-CGH: den hyppigste tab involveret kromosom 9p-arm, mens den hyppigste gevinst involveret kromosom 20q-arm, som tidligere rapporteret af andre [5], [6], [14], [18], [19]. Overraskende fandt vi ikke en høj procentdel af tumorer med gevinst på 6p22.3 og 8Q rapporteret i andre undersøgelser [14], [18], [19]. LOH og underrepræsentation af kromosom 9 er den hyppigst beskrevne genetisk ændring i TCC ( 50%). Den fælles tab af en hel kopi af chromosom 9 indikerer tilstedeværelsen af ​​tumorsuppressorgener både 9p og 9q, og kandidatgener er blevet identificeret i adskillige regioner, herunder 9p21 (

CDKN2A

), 9q12-13 (

ptch

), 9q32-33 (

DBC1

) og 9q34 (

TSC1

). I denne undersøgelse observerede vi helt eller delvist tab af 9 p og /eller 9q i 7/10 tumorer, både HG og LG. Desuden er der i nogle HG vi observeret en gevinst for dette locus, selv om dette kunne skyldes til kromosom 9 polyploidi (som tegn på kromosomal ustabilitet). Den hyppigste gevinst er 20Q (6 tumorer), i overensstemmelse med data, der tidligere er rapporteret i mange andre cancerformer, herunder blære, colon, ovarie og bryst [31]. Foreningen af ​​5p og 20Q gevinster, der findes i 3 HG tumorer, rapporteret af Bruch [32], kan være forbundet med progression. Endelig er gevinst på 17q21 kun identificeret i HG tumorer, hvilket tyder på en mulig rolle i tumor progression.

Det mest interessante punkt i denne undersøgelse er den sammenligning af matrix-CGH data og Urovysion FISH data. Faktisk vi ses ikke kun en høj intra og inter-tumor heterogenitet i FFPE materiale, som fremgik af analysen af ​​to forskellige tumorale områder af samme tumor; Vi fandt også nogle uoverensstemmelser i de to teknikker, der kunne være delvist tilskrives en mulig maskering fra normale celler eller en kompenserende effekt stammer fra den store tumor heterogenitet. Denne heterogenitet er allerede blevet beskrevet af vor gruppe i blærekræft stamceller-lignende celler, som er genetisk forskellig [33]. Vi kan foreslå, at denne mangfoldighed genererer levedygtige og klonbeslægtede subpopulationer, der bliver heterogen i samme tumor.

De overordnede matrix-CGH data endnu engang understreges, om tilstedeværelsen af ​​hyppige ændringer (dvs. 20p og 5P gevinster), der ikke kan detekteres ved Urovysion assay. En yderligere fordel ved anvendelse af en integreret teknisk tilgang opstod for 028CR09 prøve: amplifikationen af ​​3p vist ved opstilling-CGH blev undersøgt ved FISH med Urovysion assay og en LSI 3p probe. Gennem integration af flere metoder, var vi i stand til at skelne den sande forstærkning fra et kromosom 3 polysomy. Dette locus omfatter peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma (

PPARG

), en ligand aktiveret transkriptionsfaktor impliceret i reguleringen af ​​proliferation og differentiering af urothelium [34], [35].

I Afslutningsvis betydelig indsats er nødvendig for at definere de gener, ligger til grund for kromosomafvigelser til en bedre forståelse af de genetiske mekanismer for at udvikle nye terapeutiske strategier. Vores resultater bekræftede vigtigheden af ​​globale genomiske screeningsmetoder, der er vifte baseret CGH, at omfattende bestemme de genomiske profiler af store serier af TCCs tumorer. denne teknik har imidlertid endnu visse begrænsninger, såsom ikke at kunne detektere mosaicisme lavt niveau, eller ikke påvise eventuel ændring i antallet af kopier for en slags kompenserende virkning på grund af tilstedeværelsen af ​​høje cellulær heterogenitet. Således er det stadig tilrådeligt at bruge komplementære teknikker matrix-CGH og FISH, da førstnævnte er i stand til at opdage ændringer på genomet niveau ikke udelukke noget kromosom, men sidstnævnte er i stand til at opretholde de enkelte data på niveau med enkelte celler , selv om den fokuserer på nogle genomiske regioner.

Materialer og metoder

En detaljeret formular findes i Materialer og metoder S1.

Denne undersøgelse blev godkendt og grundlagt af Direzione Generale Sanità Regione Lombardia og præsenteret af generaldirektør og etik engagement ICP Hospital Bassini. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra undersøgelsens deltagere før væv samling.

Patienter og prøver

I alt 32 tumorprøver (28 mænd og 4 kvinder) blev opnået ved transuretral resektion i en fortløbende serie af patienter nydiagnosticeret med TCCs til fast center (tabel S1). Informeret samtykke blev opnået før vævet kollektion. Iscenesættelse og sortering blev udført i henhold til World Health Organization Consensus Klassifikation [1]. De blev skelnes i høj eller lav kvalitet (HG eller LG) og i muskel invasiv eller ej (IN eller NI).

Fluorescens in situ hybridisering

For FIN, biopsier blev skåret op og dyrket i RPMI-1640 (Euroclone Spa) suppleret med 20% FCS i 24 timer. Stykker blev underkastet hypotonisk behandling og fikseret med 3: 1 methanol: eddikesyre. Enkelte celler isoleret fra biopsier med eddikesyre 60%, blev spottet på lysbilleder og lad tørre. For FFPE blev væv fikseret ifølge standardprocedurer.

Forbehandling og FISH-analyse blev udført på begge kerner isoleret fra FIN og FFPE prøver under anvendelse UroVysion blærekræft kit (Vysis, Wiesbaden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner .

efter hybridisering de ubundne prober blev fjernet ved en række vaske og kernerne blev modfarvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI). Salg

mindst 100 celler for hvert præparat blev scoret og signalerne blev inddelt efter tab (antal signaler /celle 2), disomi (antal signaler /celle = 2) og gain (antal signaler /celle 2).

For locus 3p25 FISH analyse på FFPE blev udført ved hjælp af Poseidon ™ Gentag Gratis ™ PPARy (3p25) Break sonde (kreatech Diagnostics, Amsterdam, Holland). Den statistiske signifikans af forskelle mellem kromosom 3 polisomy og 3p25 amplifikation blev vurderet ved Students t-test på separate tællinger af 100 kerner. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant med p. 0,01

Alle digitale billeder blev taget med et Leitz mikroskop (Leica DM 5000B) udstyret med en charge coupled device (CCD) kamera og analyseres ved hjælp af Chromowin software (Tesi Imaging, Milano, Italien).

Array-CGH

For vifte-CGH-analyse, genomisk DNA blev ekstraheret fra friske biopsier efter enzymatisk behandling med collagenase H (Roche, Mannheim, Tyskland) og proteinase K (Roche, Mannheim, Tyskland) og oprenset under anvendelse af phenol /chloroform (Carlo Erba, Milano, Italien). Prøvefremstilling, slide hybridisering og analyse blev udført ved anvendelse SurePrint G3 human CGH Microarray 8x60K (Agilent, Santa Clara, CA) ifølge producentens instruktioner. Sex-matchede kommercielle DNA-prøver (Promega) blev anvendt som reference DNA under matrix-CGH. De arrays blev scannet ved 2-um opløsning ved hjælp af Agilent microarray scanner og analyseret ved hjælp af Feature Extraction v10.7 og Agilent Genomisk Workbench v5.0 software. Den Aberration Detection Metode 2 (ADM2) algoritme foranlediget af Genomisk Workbench software blev anvendt til at beregne og bistå identifikation af aberrationer for en given prøve (tærskel = 5; log2 forhold = 0,3). For at beregne den anslåede procentdel af mosaicisme brugte vi formlen bestemt af Cheung SW et al. [36].

Gene ontologi analyse

For at analysere, hvilke ontologi klasser var over- og underrepræsenterede blandt de gener, afgrænset inden for gevinst og tab regioner opdaget af matrix-CGH, ​​den GOstat software ( tilgængelig på https://gostat.wehi.edu.au/) blev anvendt [37] baseret på Amigo (Gene ontologi database) version 1.8.

Statistisk analyse

sager blev beskrevet af beregning af andele af tab, disomi og gevinst ved i alt mindst 100 celler, specielt for type analyse (FFPE og FIN), og sonde af UroVysion test.

En multinomial model tegner sig for tilstedeværelsen af ​​klyngedannelse blev anvendt til at estimere for hver type tumor og type analyse, den samlede andel af tab, disomi og vinde med 95% konfidensintervaller. Denne model blev også anvendt til at sammenligne de samlede andele af tab, disomi og forstærkning detekteres af to typer analyser.

A Poisson model baseret på logaritmisk transformation af tællinger i nærværelse af klyngedannelse blev anvendt til at estimere antallet af signaler detekteres af hver type analyse med 95% konfidensintervaller. Denne model aktiveret også at sammenligne antallet af signaler på tværs af de to typer af analyse (FFPE og FIN).

Støtte oplysninger

tabel S1.

Clinicopathologic karakteristika 32 tumorprøver af undersøgelsen. Histologi /Grade og fase af undersøgelsen er angivet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0024237.s001

(DOC)

tabel S2.

UroVysion testresultater på frisk isolerede interphasic kerner (FIN) og på formalin fast paraffin indlejrede kerner (FFPE).

doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s002

(DOC)

tabel S3.

Kopier nummer ændringer (CNA) delte (plus tegn) blandt 10 TCC prøver analyseret ved matrix-CGH. NI-TCCs er angivet i kursiv; IN-TCCs er angivet med fed. For Histologi /Grade se tabel S1

doi:. 10,1371 /journal.pone.0024237.s003

(DOC)

Tabel S4.

Gene ontologi. I. Statistisk signifikant (p 0,05) underrepræsentation af gen-ontologi (GO) kategorier i HG i tumorer. II. Statistisk signifikant (p 0,05) overrepræsentation af gen ontologi (GO) kategorier i HG i tumorer. III. Statistisk signifikant (p 0,05) underrepræsentation af gen-ontologi (GO) kategorier i LG NI tumorer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0024237.s004

(DOC)

tabel S5.

Urovysion data. I. Sammenligning mellem Urovysion data i to forskellige tumorale områder af den samme sektion II. Sammenligning mellem Urovysion data i to forskellige tumorale områder af samme sektion

doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s005

(DOC)

Materialer og metoder S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0024237.s006

(DOC)