PLoS ONE: Hæmning af TMEM16A Expression Undertrykker Vækst og Invasion i Human Kolorektal Cancer Cells

Abstrakt

Metastase fører til dårlig prognose i kolorektal cancer patienter, og der er et stigende behov for nye terapeutiske mål. TMEM16A (ANO1, DOG1 eller TAOS2) er for nylig blevet identificeret som en calcium-aktiverede klorid kanal (CACC) og siges at være overudtrykt i flere maligniteter; Men dens ekspression og funktion i colorektal cancer (CRC) er fortsat uklar. I denne undersøgelse fandt vi ekspression af TMEM16A mRNA og protein i høje-metastatisk potentiale SW620, HCT116 og LS174T-celler, men ikke i primære HCT8 og SW480 celler under anvendelse af RT-PCR, western blotting og immunofluorescens mærkning. Patch-clamp optagelser detekteret CACC strømme reguleres af intracellulær Ca

2+ og spænding i SW620-celler. Knockdown af TMEM16A af korte hairpin RNA’er (shRNA) resulterede i undertrykkelse af vækst, migration og invasion af SW620-celler som detekteret ved MTT, sårhelende og transwell assays. Mekanistisk blev TMEM16A depletion ledsaget af dysregulering af phospho-MEK, phospho-ERK1 /2 og cyclin D1-ekspression. Flowcytometri-analyse viste, at SW620-celler blev inhiberet fra G1 til S-fasen af ​​cellens cyklus i TMEM16A shRNA gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Afslutningsvis vores resultater viser, at TMEM16A CACC er involveret i vækst, migration og invasion af metastatiske CRC celler og fremlægge dokumentation for TMEM16A som et potentielt mål lægemiddel til behandling af metastatisk kolorektal karcinom

Henvisning:. Sui Y, Sun M , Wu F, Yang L, Di W, Zhang G, et al. (2014) Hæmning af TMEM16A Expression Undertrykker Vækst og Invasion i Human Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 9 (12): e115443. doi: 10,1371 /journal.pone.0115443

Redaktør: Hong Wanjin, Institut for Molekylær og Cell Biology, Biopolis, USA

Modtaget: Juni 17, 2014, Accepteret: November 23, 2014; Udgivet: 26 December, 2014

Copyright: © 2014 Sui et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.173.109, 31.471.099, og 31.301.179), Kina Postdoc Science Foundation (nr 2014M551198), og Jilin provinsen sundhed og familieplanlægning Kommissionens projekt (nr 2014Q024). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige malignitet verdensplan [1], [2], og metastase er en afgørende faktor for dårlig prognose af CRC patienter [3]. Ændringer i multiple gen, såsom aktivering af onkogener og inaktivering af tumorsuppressorgener, der er involveret i progressionen af ​​normal colon epitel i adenom og ind malign adenocarcinom [4], [5] Der er imidlertid begrænset information om de molekylære ændringer, bibringer den kolorektal cancer metastase [6], [7]. Derfor er det nødvendigt at identificere metastase-relaterede gener og deres molekylære veje, som kan give nye mål for behandling af metastatisk CRC.

Det kromosomale bånd 11q13 amplikon er en af ​​de hyppigst forstærkede regioner i humane maligniteter , såsom hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) og bryst, blære og esophageal cancer [8]. Analysen af ​​den differentierede ekspression af gener placeret i denne region førte til identifikation af

TMEM16A

, som også kaldes

ANO1

(anoctamin-1),

DOG1

( opdaget på gastrointestinal stromale tumorer protein 1),

ORAOV2

(kræft i mundhulen overudtrykt 2) og

TAOS2

(tumor-forstærket og overudtrykt sekvens 2) [9], [10], [11] [12], [13]. TMEM16A er sammensat af 26 exoner og indeholder otte transmembrane segaments med N- og C-terminale ender står cytoplasmaet og en reentrant løkke placeret mellem TM5 og TM6 eventuelt holde pore region [14].

TMEM16A har for nylig været vist at være en calcium-aktiverede chlorid kanal [14], [15], [16] og er bredt udtrykt i forskellige væv, herunder sekretorisk epitel, glat muskulatur, sensoriske neuroner og andre væv [17], [18]. TMEM16A spiller mange vigtige fysiologiske roller i reguleringen af ​​epitelial væsketransport, vaskulær glat muskulatur kontraktion, spytproduktion og mavetarmkanalbevægelighed [19], [20], [21], [22]. Dysregulering af TMEM16A forårsager humane sygdomme, herunder cystisk fibrose, hypertension, lungesygdomme og diarré [23], [24], [25]; knockout af TMEM16A er embryonically dødelig på grund af tracheomalacia [26].

udtryk for TMEM16A er opreguleret i flere kræftformer, herunder HNSCC og esophageal, bryst- og prostatakræft. Dets overekspression er også korreleret med udviklingen af ​​fjernmetastaser og dårlig prognose af cancerpatienter med HNSCC [27], [28], [29]. For nylig har TMEM16A vist sig at fremme HNSCC tumorigenese og invasion via aktivering af mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signaling pathway. Desuden har TMEM16A blevet rapporteret at bidrage til udviklingen af ​​kræft ved at inducere aktiveringen af ​​epitelial vækstfaktor receptor (EGFR) og calmodulin-afhængig proteinkinase II (CaMK II) og efterfølgende aktivering AKT og MAPK signalering i brystkræft og HNSCC [30] , [31]. Selvom TMEM16A udtrykkes ubikvitært i gastrointestinale stromale tumorer [32], er dens rolle i CRC metastaser lidt undersøgt.

I den foreliggende undersøgelse, vi først demonstreret udtryk for TMEM16A calcium-aktiverede klorid kanaler (CaCCs) i forskellige metastatics potentielle kolorektale cancer cellelinjer. Vi undersøges yderligere rolle TMEM16A i SW620 celler metastase og dens mulige molekylære mekanisme ved hjælp af korte hårnål RNA in vitro.

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige kolorektal carcinom cellelinier HCT8, SW480, SW620, HCT116 og LS174T-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). SW480 og SW620 blev dyrket i L15 medium (Sigma, USA). HCT8 og HCT116 blev dyrket i RPMI-medium 1640 (Sigma, USA). LS174T-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Sigma, USA). Fisher rotte skjoldbruskkirtlen (FRT) celler og FRT celler transficeret stabilt med human TMEM16A blev opnået fra Alan Verkman (University of California, San Francisco, CA, USA) [33] og blev dyrket i Coon modificerede F12-medium. Alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft.

RNA-ekstraktion og RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse med producentens introduktioner. Den koncentration, renhed og integritet af RNA blev målt ved anvendelse af et NanoDrop2000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Fem hundrede nanogram af total RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af revers transkriptase med PrimeScriptTM RT reagenskittet (Takara). CDNA produkt blev anvendt som skabelon til PCR-amplifikation i et samlet volumen på 30 pi, og PCR var som følger: 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 s; 60 ° C i 30 s; og 72 ° C i 60 s. For TMEM16A cDNA-amplifikation blev følgende primere anvendt: senseprimer, 5′-AACGGGA CCATGCACGGCTT-3 ‘; antisense-primer, 5’-TGTTGTGGTGGTTGCACGGC-3 ‘. PCR-produkterne (424 bp) blev analyseret ved agarosegelelektroforese, og β-actin tjente som en endogen kontrol at normalisere ekspressionsdataene.

Western blotting

Celler blev vasket to gange med is- koldt phosphatbufret saltvand (PBS) og opløst i lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 7,5, 1% Triton X-100 og suppleret med 1 mM PMSF). Efter protein kvantificering, prøver indeholdende 100 ug proteiner blev denatureret og elektroforesebehandlet under anvendelse af 10% SDS-PAGE og derefter overført til PVDF-membraner. Efter blokering med 5% (w /v) skummetmælk og vask med Tris-bufret saltvand-Tween-opløsning (TBST) blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med primære anti-TMEM16A polyklonalt antistof (Abcam, ab53212; 1:100 ) og muse-anti-β-actin-antistof (Cell Signaling, 1:500) hhv. Alle andre primære antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology. Efter vask blev blottene inkuberet med sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (Sigma; 1:5,000) i 1 time ved stuetemperatur og visualiseret under anvendelse af et forøget kemiluminescens (Amersham, Little Chalfont, UK) på røntgenfilm (Millipore Corporation , Billerica, USA).

Immunofluorescensanalyse

immunfluorescensfarvning blev udført for at lokalisere ekspressionen af ​​TMEM16A. Colorektale cancerceller blev dyrket natten over på foretrukne dækglas (Fisher, USA) og fikseret i 15 minutter i 4% (vægt /volumen) paraformaldehyd (PFA). Cellerne blev derefter skyllet 3 gange med PBS i 5 minutter, permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 /PBS i 20 minutter og derefter inkuberet i 1 time i 3% BSA /PBS blokeringsopløsning. For at detektere TMEM16A blev celler inkuberet ved 37 ° C i 3 timer med muse-anti-humant DOG1 monoklonalt antistof (zhongshanjinqiao, Kina; 1:50), efterfulgt af udsættelse for en Cy3-konjugeret anti-muse-IgG sekundært antistof (Sigma; 1 :1,000) ved 37 ° C i 1 time. At visualisere kerner blev celler farvet med DAPI (Sigma, St. Louis, MO, USA; 40,6- diamidino-2-phenylindol), og dækglassene blev monteret på objektglas med antifade opløsning (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) . Fluorescerende billeder blev undersøgt og fotograferet under en konfokal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan).

Patch clamp optagelser

Humane kolorektal cancer-celler blev podet på dækglas, og patch clamp optagelser blev udført ved hjælp af en EPC10 forstærker (HEKA, Lambrecht /Pfalz, Tyskland) i kombination med Patchmaster (HEKA) ved stuetemperatur. Pipetterne blev fremstillet ud fra borsilicat kapillær glasset med en mikropipette aftrækker (PC-10, Narishige, Japan) og derefter brand-poleret med en microforge (MF-900, Narishige, Japan). Modstanden af ​​pipetter i badet løsning var 2-5 MQ. Celler blev perfunderet med et bad indeholdende: 145 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM MgC

2, 1 mM CaCI

2, 5 mM glucose, 5 mM HEPES og 20 mM saccharose (pH 7,4 med NaOH) . For helcelle-konfiguration, nul Ca

2+ intracellulære opløsning indeholdt følgende: 146 mM N-methyl-D-glucamin-chlorid (NMDG-CI), 2 mM MgCl

2, 5 mM EGTA og 8 mM HEPES (pH 7,4 med NMDG). Høj-Ca

2+ pipette opløsning indeholdt 5 mM Ca

2 + -EGTA stedet for EGTA (frit Ca

2+ ca. 25 uM). Forskellige gratis [Ca

2+] løsninger blev fremstillet ved at blande den nul-Ca

2+ og high-Ca

2 + løsninger. Cellen blev fastspændt fra bedriften potentiale (0 mV) til spændinger mellem -100 til +100 mV ved 20 intervaller mV. For inside-out konfiguration pipetten opløsningen indeholdt: 140 mM NMDG-CI, 2 mM MgC

2, 5 mM CaCI

2 og 10 mM HEPES (pH 7,4 med NMDG); og perfusionsopløsningen indeholdt: 150 mM NMDG-CI, 2 mM MgC

2, 10 mM EGTA, 8 mM Tris og 10 mM HEPES (pH 7,4 med NMDG). Efter forseglingen modstand nåede 40 GQ, blev membranen fjernet, og membranpotentialet blev holdt på -50 mV. Dataene blev filtreret ved 100 Hz med en otte-polet Bessel-filter (LPF-8, Warner Instruments, LLC, Hamden, CT, USA), og digitaliseret ved hjælp af en computer på en sampling rate på 500 Hz. Nifluminsyre (NFA) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Alle inside-out patch blev udført under anvendelse af en hurtig opløsning udveksling perfusionssystem (SF-77B, Warner Instruments). Dødtiden opløsning ændring var 30 ms, og data blev udført analyse for optagelser indeholdende hele celler i en enkelt kanal med Igor software som tidligere beskrevet [34].

RNA-interferens

TMEM16A /ANO1 kort hårnål RNA (shRNA) og negative kontrol shRNA plasmid blev konstrueret af GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kina). Stedet for siRNA målretning af den menneskelige TMEM16A /ANO1 genet (GenBank NM_018043) var som følger: # 1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA (1077-1095 nt); og # 2, CGAAGAAGA TGTACCACAT (837-855 nt). RNA-interferens blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev målt ved hjælp af MTT-assayet. Kort fortalt blev 5000 celler udsået i hver 96-brønds plade i 24 timer, transficeret med TMEM16A shRNA eller krypterede shRNA og yderligere inkuberet i 1, 2, 3 og 4 d hhv. MTT-reagens (10 pi; 500 ug /ml) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev yderligere inkuberet i 4 timer. Efterfølgende 150 pi DMSO blev tilsat for at opløse de formazankrystaller. Antallet af levedygtige celler blev kvantificeret ved hjælp af absorbansen målt ved 570 nm med en mikropladelæser (Thermo Scientific, USA).

In vitro

sårheling

Cell mobilitet blev vurderet af en ridse sår assay in vitro. Celler blev podet i en 6-brønds plade indtil sammenflydende, skrabet med en steril, 200-ul spids og vasket to gange med PBS. Efter inkubation med L15-medium indeholdende 1% føtalt bovint serum blev cellerne fotograferet ved 0 timer, 24 timer, 48 timer eller 72 timer under et omvendt mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) ved en forstørrelse på 100 x. Disse eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Afstandene mellem sårkanterne blev målt med en gradueret lineal, og relativ ridse bredde blev bestemt ved et forhold mellem gennemsnitlig bredde i behandling celler versus den gennemsnitlige bredde i kontrol celler.

Cell migration og invasion assays

In vitro

cancer migration og invasion celle aktiviteter blev vurderet i transbrøndene, som tidligere beskrevet, med modifikationer [23]. SW620-celler blev dyrket i L15-medium med 10% FBS indtil sammenløb i 6-brønds plader, transficeret med TMEM16A shRNA eller krypteret shRNA i 24 timer, og derefter trypsineret, vasket og talt. For cellemigration, 1 x 10

5-celler i 200 pi medium med 1% FBS blev podet i det øvre transwell insert kammer indeholdende et polycarbonat filter (6,5-mm diameter, 8-um porer; Corning Costar, Corning, NY , USA). L15-medium (600 pi) med 10% FBS (kemoattraktant) blev tilsat til det nederste kammer, og pladerne blev inkuberet i 72 timer ved 37 ° C i 5% CO

2. For celleinvasion, blev transbrøndene coatet med Matrigel. De celler, som ikke migrerer blev fjernet fra toppen af ​​Transwell filtre ved skrabning. Den gennembrudte celler blev fikseret med paraformaldehyd, farvet med Coomassie blåt og talt under et omvendt mikroskop (100 x forstørrelse). Celleantallet repræsenterede migration aktivitet.

Cell-cycle analysis

Efter transfektion af cellerne med TMEM16A eller krypteret shRNAs i 3 dage blev cellerne løsrevet anvendelse af trypsin, resuspenderet i vækstmedium og talt. Derefter 1 × 10

6 celler blev vasket med PBS og fikseret natten over med 70% (vol /vol) ethanol ved 4 ° C. Efter vask to gange med PBS, blev cellerne farvet med en opløsning indeholdende 50 ug /ml PI og 100 ug /ml RNase A i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur. De farvede celler blev analyseret ved flowcytometri (Beckman Coulter, Epics XL).

Statistisk analyse

Den statistiske analyse blev udført ved anvendelse SPSS statistik (version 17.0) med en to-halet Students

t

-test.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Dataene er udtrykt som den gennemsnitlige ±

SD

.

Resultater

Angivelse af TMEM16A i CRC-cellelinjer

I denne undersøgelse vi først opdaget

TMEM16A

mRNA niveauer ved RT-PCR i tyktarmskræft cellelinjer HCT8, SW480, SW620, HCT116 og LS174T celler. Som vist i fig. 1A, et 424 bp fragment af humant

TMEM16A

blev amplificeret fra SW620, HCT116 og LS174T celler og positiv-kontrol FRT celler transficeret stabilt med human

TMEM16A

, men ikke fra HCT8, SW480 celler og negativ-kontrol null-FRT-celler. Immunoblotanalyse under anvendelse af anti-TMEM16A polyklonalt antistof identificeret et ca. 110 kDa proteinbånd i SW620, HCT116 og LS174T-celler (fig. 1B). I modsætning hertil TMEM16A protein band var fraværende i SW480, HCT8 og negative kontrol null-FRT celler. Vi undersøgte yderligere ekspressionen og subcellulær lokalisering af TMEM16A proteinet i CRC-celler under anvendelse immunfluorescensfarvning. Immunofluorescens mærkning afslørede, at TMEM16A var højt udtrykt på cellemembranen og plasma af SW620, HCT116 og LS174T celler (S1 Fig.), Mens TMEM16A næppe blev observeret i HCT8 og SW480-celler (fig. 2). Et cellulært, isogene model (SW480 og SW620 cellelinjer) af humant CRC metastase overgang blev udvalgt til efterfølgende undersøgelse.

A, RT-PCR afslører TMEM16A mRNA-ekspression i SW620, HCT116 og LS174T-celler, men ikke i HCT8 og SW480 celler. B, blev TMEM16A proteinekspression i HCT8 og SW480, SW620, HCT116 og LS174T-celler detekteres ved Western blotting. Null FRT-celler virker som negativ kontrol. FRT-celler transficeret med human TMEM16A tjene som positiv kontrol.

Celler blev dyrket på dækglas og farvet med anti-TMEM16A antistoffer. Venstre kolonne, anti-TMEM16A immunfluorescens (Cy3, rød). Midterste kolonne, til DAPI-farvning visualisere cellekerner. Right kolonne, fusionerede billeder er kompositter af anti-TMEM16A immunofluorescens og DAPI farvning (200 ×).

Funktionel udtryk for TMEM16A kanal i CRC celler

For at validere den funktionelle udtryk for den TMEM16A kanal i CRC cellelinier udførte vi helcelle-patch clamp optagelser af SW480-celler og inside-out patch clamp optagelser af SW620-celler. Fig. 3A viser en familie af strømme som reaktion på spændingstrin af stimuli i nærvær af 1 uM Ca fra en SW480 celle. Strøm-spænding-kurve (Fig. 3B) viste, at reversible potentiale (V

rev) i denne strøm er ca. -50 mV, men V

rev af chloridet kanal blev estimeret til at være ca. 0 mV under anvendelse Nernst-ligningen ifølge den ekstracellulære og intracellulære Cl

-. Dette resultat viser, at de strømninger, der er optaget fra SW480 cellen er ikke fra chloridkanaler.

A, Repræsentative hel-celle strømme i SW480 celler blev aktiveret af en uM Ca. Strømmene blev registreret på en bedrift potentiale 0 mV efterfulgt af pulserende spændinger mellem ± 100 mV i trin på 20 mV. B, Current-spændingskurve fra panel A indikerer, at strømmene ikke er fra chloridkanaler. C, En repræsentant aktuelle spor optaget fra en inside-out plaster på en SW620 celle. En CACC strøm blev fremkaldt med en uM Ca

2+, som markeret. Stiplede linjer repræsenterer nul strøm. Membranen spænding blev holdt på -50 mV; og opadgående udbøjning repræsenterer kanalåbning. D, En stabil strøm spor efter en CACC strøm fra panelet C køre ned. E, En kontinuerlig aktuelle optagelse viser aktivering af CaCCs og anvendelser af spænding ramper i fravær (a og c) eller tilstedeværelse (b) i Ca. Spænding ramper: +50 til -100 mV i en varighed på 2000 ms. F, Current spænding kurver fra panelet E viser typiske ydre berigtigelse karakteristika CaCCs. Bemærk at minimal konduktans blev observeret i fravær af Ca. G og H, blev CaCCs strømme faldt separat af 100 uM NFA og 50 uM T16Ainh-A01.

Inde-out patch clamp eksperimenter af SW620 celler manifesteret, at membranen nuværende var afhængig af calcium og spændingen , som er typiske karakteristika for endogene CaCCs (fig. 3C-F). Desuden blev de detekterede strømme kraftigt inhiberet af Cl

– kanalblokker nifluminsyre (NFA) (Fig 3G.) Og TMEM16A -specifikke inhibitoren T16Ainh-A01 (fig 3H.)

Vi. også tilsat TEME16A specifik inhibitor T16Ainh-A01 til SW620-celler og SW480 celler separat, og observerede vækst ændring af disse celler efter 24 timer. Resultaterne viste, at T16Ainh-A01 specifikt kan mindske proliferation af SW620-celler, men ikke SW480-celler (fig. 4).

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af T16Ainh-A01 i 24 timer og cellelevedygtigheden blev målt ved MTT-assayet. Data er udtrykt som gennemsnit ± SD (n = 3).

Knockdown af TMEM16A hæmmede spredning af SW620 celler

For at afsløre funktioner TMEM16A i tyktarmen kræftceller, vi transficeret to TMEM16A shRNA sekvenser (# 1 og # 2) i SW620 celler til at lukke munden udtryk for TMEM16A. Western blot Resultaterne viste, at TMEM16A shRNA # 1 forårsagede 63,4% reduktion i TMEM16A proteinekspression og TMEM16A shRNA # 2 forårsagede 71,7% reduktion i forhold til kontrollen shRNA. TMEM16A knockdown førte til en betydelig ændring i hel-celle calcium-aktiverede klorid strømme og immunofluorescene densitet (fig. 5).

A, Western blot analyse af TMEM16A proteinekspression i SW620 celler, der blev transficeret med shRNA # 1 og # 2. B, Søjlediagrammet opsummerer den relative ekspression niveauet af TMEM16A protein fra panel A. Ekspression af TEMEM16A protein blev normaliseret med ekspressionsniveauet af β-actin (n = 3). C, er repræsentative immunofluence billeder af SW620 celler vises efter TMEM16A er knockdown af shRNA # 1 og shRNA # 2 sammenlignet med kontrol shRNA (200 ×). D, Søjlediagrammet opsummerer peak strømme er optaget ved 100 mV spænding i SW620 celler efter TMEM16A blev slået ned, sammenlignet med kontrol shRNA. ** P 0,01. Alle data er vist som middelværdi ± SD. E, Whole-celle strømme blev registreret fra SW620 celler transficeret med kontrol shRNA, shRNA # 1 og # 2 på en bedrift potentiale 0 mV efterfulgt af pulserende spændinger mellem ± 100 mV i trin på 20 mV.

for at undersøge virkningerne af TMEM16A om spredning af SW620 celler, vi brugte to shRNA sekvenser at blande udtryk for TMEM16A. MTT-analyse viste, at TMEM16A knockdown stærkt undertrykt cellevækst i en tid -afhængig måde sammenlignet med kontrol shRNA udtrykker SW620 celler

in vitro

(fig. 6).

A, Væksten af ​​SW620 celler blev inhiberet af TMEM16A shRNA # 1 og # 2 i sammenligning med kontrolgruppen (gennemsnit ± SD, n = 3; * P 0,05). B, Repræsentative immunoblots bekræfter knockdown af TMEM16A. Ctrl kontrol.

Undertrykkelse af migration og invasion af SW620 celler ved tavshed endogene TMEM16A

For yderligere at iagttage virkningerne af TMEM16A på celle motilitet, vi udførte sårhelende analyser efter lyddæmpning endogene TMEM16A. Sårhelende billeder viste, at sårlukning af TMEM16A shRNA # 1 og # 2-celler var langsommere end i kontrolgruppen shRNA-behandlede celler efter skrabe cellerne (fig. 7). Dette resultat viste, at deregulering af TMEM16A forsinket sårheling sammenlignet med kontrolgruppen.

A, Migration af SW620-celler blev vurderet ved en sårhelende assay i nærværelse af TMEM16A shRNA # 1 og shRNA # 2, sammenlignet med kontrol shRNA. Repræsentative billeder af sårlukning blev taget ved 0 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer efter sårdannelse under 100 × forstørrelse. B, er vist Bar grafer af panel A. Værdier er de midler ± SD; n = 3; ** P 0,01. Ctrl kontrol.

Vi næste undersøgte roller TMEM16A i metastaser i SW620 celler. Transwell migration og invasion analyser af TMEM16A Knockdown celler blev udført. I Transwell migration assay, antallet af celler transficeret med TMEM16A shRNA der trængte membranen vid udstrækning faldt sammenlignet med SW620-celler transficeret med den negative kontrol. Resultaterne viste også, at SW620 celler transficeret med TMEM16A shRNA # 1 og # 2 udviste væsentlig forringelse af migreringsevnen. Tilsvarende blev også observeret det tilsvarende rolle TMEM16A shRNA # 1 og # 2 for invasiv evne i en parallel invasiv assay (fig. 8).

A, migration (uden Matrigel) og invasion (med Matrigel) af SW620-celler er signifikant undertrykt ved knockdown af TMEM16A sammenlignet med kontrolgruppen gennem Transwell penetration assays. Ikke-migrerede celler blev skrabet med en vatpind. Celler, som trængte Transwell filtre blev farvet med Coomassie blue. Repræsentative billeder vises. B og C, Bar grafer af panel A er vist. Værdier er de midler ± SD; n = 3; ** P 0,01. Ctrl kontrol.

Udtømning af TMEM16A hæmmede aktivering af MAPK signalering

For at belyse de molekylære mekanismer, som TMEM16A påvirker human CRC vækst og metastase, vi undersøgt korrelationen mellem TMEM16A med cyklin D1 og MAPK-signalvejen. Som vist i fig. 9, knockdown af TMEM16A faldt betydeligt udtryk for cyklin D1 og fosforylering af MEK og ERK1 /2, mens det ikke påvirker det samlede MEK eller ERK1 /2-ekspressionsniveauer.

Western blot resultater viser hæmning af TMEM16A førte til et fald i phospho-MEK, phospho-ERK1 /2 og cyclin D1. Ctrl kontrol.

Udtømning af TMEM16A forårsagede forsinkelse af celle-cyklus procession

Vi yderligere målt cellecyklus fordelingen ved flowcytometri at undersøge den mulige mekanisme TMEM16A i regulering CRC celle proliferation. Som fig. 10 viste en stigning i celletallet ved G0 /G1-fasen og fald i celleantal ved G2 /M-fasen blev observeret efter endogen TMEM16A blev slået ned. Procentdelen af ​​G1-fase celler i TMEM16A-shRNA # 1-celler (50,3% ± 1,83) og TMEM16A-shRNA # 2-celler (51,8 ± 1,13) signifikant højere end i kontrolceller (33.95 ± 2.05) (P 0,01). Disse resultater bekræftet, at TMEM16A knockdown førte til forsinkelse af celle-cyklus progression i SW620 celler ved at arrestere celler på Go /G1 fase, som forårsagede væksthæmning af TMEM16A shRNA celler.

A, B og C, Flowcytometrisk analyse af cellecyklusfordeling af SW620-celler transficeret med kontrol shRNA, TMEM16A shRNA # 1 og # 2 henholdsvis i 72 timer. D, Bar grafer, der viser den relative procentdel af celler i de angivne faser af cellecyklus efter knockdown af TMEM16A. Data er udtrykt som middelværdi ± SD; n = 3; * P. . 0,05

Samlet set vores resultater viser, at udtømning af TMEM16A undertrykt aktiveringen af ​​MAPK signalvejen og forsinket progression af cellecyklus

Diskussion

TMEM16A proteiner blev for nylig fundet at danne Ca

2 + -aktiverede Cl

– kanaler, der blev kortvarigt aktiveres af intracellulær calcium [15], [16], [26], [35]. Disse kanaler spiller en vigtig rolle i epitel Cl

– sekretion, kontraktion af glat muskulatur og olfaktoriske signaltransduktion [17], [36], [37], [38], [39]. Tidligere undersøgelser har vist, at TMEM16A er ofte overudtrykt i flere maligniteter, herunder SCCHN, kræft i spiserøret og gastrointestinale stromale tumorer (GIST) [28], [36], [40]. Imidlertid ekspressionen af ​​TMEM16A i CRC fortsat uklar.

Vores konklusion giver den første bevis på, at TMEM16A forstærkes og højt udtrykt i SW620, HCT116 og LS174T-celler, men ikke i HCT8 og SW480 celler. Vi fandt, at TMEM16A proteinet var ca. 110 kD og placeret i den cellulære membran og plasma fra SW620, HCT116 og LS174T-celler, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter [39], [41]. Coloncancercellelinie SW480 stammer fra primær adenocarcinom i colon fra en 50-årig mandlig patient, og SW620 celler er afledt fra en metastatisk mesenterisk lymfeknude fra den samme patient. Så SW620 celler har høj metastase potentiale i forhold til SW480-celler [42]. LS174T og HCT116 har højere metastaser potentiale end HCT8 celler [43], [44], [45]. Disse resultater viser, at opregulering af TMEM16A var forbundet med øget potentiale af metastase i de fem CRC cellelinier. Vi spekulere, at ændring af TMEM16A udtryk var forbundet med erhvervelsen af ​​mere aggressive egenskaber i CRC-cellelinjer, som inducerer tumorer bliver metastatisk. Forholdet mellem TMEM16A udtryk og CRC tumor progression skal undersøges nærmere i flere CRC-cellelinjer og i et andet klinik undersøgelse.

På grund af deres isogene funktion, SW480 og SW620 cellelinjer tjene som en værdifuld model for at studere den genetiske vekslen i tyktarmskræft metastatisk progression [46]. Derfor vælger vi dette par celle model til efterfølgende undersøgelse.

Elektrofysioloqisk beviser valideret, at TMEM16A fungerer som CaCCs i SW620 celler. Først, den nuværende er afhængig af koncentrationen af ​​calciumion i cytoplasmaet og spænding (fig. 3C-F). Desuden både klorid kanal blokker NFA og TMEM16A-specifik inhibitor T16A

inh-A01 [47] effektivt kan undertrykke de strømninger, der er optaget fra en SW620 celle patch (fig. 3G, H). Interessant observerede vi, at efter en celle patch blev udskåret, den CACC strøm faldt hurtigt på først og derefter blev relativt stabilt (fig. 3C, D). Dette fænomen viste, at andre proteiner, såsom calmodulin eller calmodulin-afhængig kinase, kan være involveret i reguleringen af ​​TMEM16A CaCCs i SW620 celler.

Der er beviser for, at klorid kanaler bidrager til tumorigenese og tumor progression [48] , [49], [50], [51]. TMEM16A CaCCs er for nylig blevet rapporteret at fremme vækst og metastase i HNSCC, prostatakræft og brystkræft [27], [30], [31]. I overensstemmelse med disse resultater, fandt vi, at TMEM16A knockdown resulterede i undertrykkelse af proliferation, migration og invasion af SW620 celler. Vores data giver dokumentation for, at TMEM16A sandsynligvis bidrager til tumorigenese og metastase i high-metastatisk potentiale CRC. Små molekylære inhibitorer, der kan mindske ekspressionen af ​​TMEM16A kan tjene som nye terapeutiske lægemidler for metastaserende CRC.

Til dato den mekanisme, hvormed TMEM16A påvirker tyktarmskræft forblev relativt uudforsket. Talrige undersøgelser viste, at ERK-vejen ikke kun styrer cellulær proliferation og overlevelse, men også påvirker tumorcellemigration, invasion og progression [52], [53], [54]. Nylige undersøgelser rapporteret, at TMEM16A fremmer HNSCC tumorigenese og cancer progression ved at aktivere MAPK signalvej [30]. Derfor har vi fokuseret på at studere forholdet mellem TMEM16A og MEK-ERK1 /2 vej hos CRC. Ændringer i denne vej blev undersøgt efter TMEM16A ekspression blev inhiberet under anvendelse af western blotting. Vores resultater viser, at knockdown af TMEM16A signifikant inhiberede aktivering af MEK og ERK1 /2. På grundlag af dette resultat, vi undersøgt yderligere ekspressionen af ​​cyclin D1, en celle-cyklus regulatorisk protein, der er associeret med pErk1 /2-ekspression. Resultaterne viste, at ekspression af cyclin D1 er positivt forbundet med pErk1 /2 og TMEM16A ekspression. Desuden flowcytometri (FCM) assays viste, at cellecyklusprogression fra G1 til S-fasen blev inhiberet, hvilket var i overensstemmelse med deregulering af cyclin D1-ekspression efter TMEM16A blev udtømt. Disse resultater giver en mulig forklaring på den observerede hæmning af celleproliferation, migration og invasion af CRC da TMEM16A blev undertrykt, og indikerede, at TMEM16A bidrager til vækst og metastase af CRC muligvis ved at regulere MAPK pathway.

Som konklusion viste vi, at ekspression af TMEM16A er relateret til metastatiske potentiale CRC cellelinier.