PLoS ONE: Discovery of Novel hypermethyleret Gener i prostatakræft anvendelse af genomisk CpG Island Microarrays

Abstrakt

Baggrund

Promotor og 5′-enden methylering regulering af tumorsuppressorgener er et fælles træk ved mange kræftformer. Sådanne hændelser ofte føre til undertrykkelse af disse centrale gener og dermed de kan bidrage til udviklingen af ​​kræft, herunder prostatakræft.

Metode /vigtigste resultater

For at identificere methylering ændringer i prostata cancer, udførte vi en genom-dækkende analyse af DNA-methylering ved anvendelse af Agilent humane CpG island arrays. Brug beregningsmæssige og gen-specifikke validering tilgange vi har identificeret et stort antal potentielle epigenetiske biomarkører for prostatakræft. Yderligere validering af kandidatgener på en separat kohorte af lav og høj kvalitet prostatakræft ved kvantitativ MethyLight analyse har givet os mulighed for at bekræfte DNA hypermethylering af

HOXD3

BMP7

, to gener, der kan spille en rolle i udviklingen af ​​høj kvalitet tumorer. Vi viser også, at promotor hypermethylering er ansvarlig for nedreguleret ekspression af disse gener i DU-145 PCa cellelinje.

Konklusioner /Betydning

Denne undersøgelse identificerer nye epigenetiske biomarkører for prostatakræft og prostatakræft progression, og giver en samlet vurdering af DNA methylering i prostatakræft

Henvisning:. Kron K, Pethe V, Briollais L, Sadikovic B, Ozcelik H, Sunderji a, et al. (2009) Discovery of Novel hypermethyleret Gener i prostatakræft anvendelse af genomisk CpG Island Microarrays. PLoS ONE 4 (3): e4830. doi: 10,1371 /journal.pone.0004830

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: November 24, 2008; Accepteret: 17 februar 2009; Udgivet: 13 Marts 2009

Copyright: © 2008 Kron et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Canadisk Prostata Cancer Research Initiative, National Cancer Institute of Canada (# 18.568). Ontario Student Opportunity Trust Fund, Scace prostatakræft Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den anden hyppigste årsag til kræft i forbindelse med dødsfald i [1] USA. Undersøgelser har vist, at PCa er en kompleks sygdom påvirket af genetiske og ikke-genetiske epidemiologiske faktorer, og tidlig diagnose er kritisk i den kliniske behandling af sygdommen. En fælles patologisk variabel givet under af prostata tumor, med højere score afspejler dårligt differentieret carcinom. Gleason score ≤ 6 carcinomer betragtes lav kvalitet, Gleason 7 er mellemliggende klasse, og dem med Gleason score 8 og derover betragtes som høj kvalitet (for seneste revision på klassificeringssystem, se [3]).

Epigenetisk modifikationer er blevet vist at påvirke genekspression mønstre og ofte bidrager til patogenesen af ​​mange cancere [4]. Eksempler på epigenetiske histon modifikationer omfatter methylering af specifikke lysinrester, acetylering /deacetylering af lysinrester og phosphorylering af histon haler, der hver har varierende effekt på reguleringen af ​​gentranskription. Disse ændringer fremkalde unormale genekspressionsmønstre og dermed anses for at bidrage til udviklingen af ​​kræft [5], [6]. Afvigende CpG-dinukleotid methylering er en anerkendt epigenetisk kendetegn for mange cancerformer. Global genomisk hypomethylering er fundet i forbindelse med lokaliserede regioner af hypermethylering, typisk i CpG-øer, der er almindeligt forekommende i de promotorer eller 5 ‘regioner af gensekvenser [7]. Promotor hypermethylering virker sammen med specifikke histon modifikationer til tavshed gener ved direkte hæmning af transskription faktor afventende [8], ved binding af methyl CpG bindende domæne proteiner [9], eller gennem interaktion med histon modificerende enzymer [10]. Denne epigenetiske mekanisme kan give en vækst fordel for cancerceller ved hypermethylering af tumorsuppressorgener. Følgelig kan DNA methylering begivenheder tjene som nyttige biomarkører [11], som driver en søgning efter både diagnostiske og prognostiske indikatorer.

CpG ø hypermethylering i PCa er en fælles begivenhed med over 30 hypermethyleret loci øjeblikket identificeret [12]. Det bedste karakteriseret af disse begivenheder,

GSTP1

promotor methylering, forekommer i 90% af kræft og 70% af forstadie høj kvalitet prostata intraepitelialneoplasi (PIN) læsioner [13], [14] og kan også være påvist i blod og urinprøver [15]. Således

GSTP1

methylering kan tjene som en nyttig diagnostisk markør for PSA. For nylig er der gjort betydelige fremskridt i high-throughput epigenomic screening for identifikation af nye mål for DNA methylering [16]. Efterfølgende har andre godt karakteriserede hypermethyleret gener blevet identificeret i PCa herunder

RASSF1A

,

CDH1

, og

CDKN2A

, for at nævne et par stykker. Der er imidlertid ikke undersøgt til dato gen blevet identificeret som en specifik diagnostisk /prognostisk biomarkør i PCa ligner

GSTP1

[17], [18].

I denne undersøgelse, vi søgte at analysere methylering på en genom bred skala ved hjælp af humane CpG ø microarrays at afdække roman methylatled loci inden prostatakræft. Blandt et panel af nye og /eller differentielt methylerede loci, at vi identificeret, vi yderligere karakteriseret

HOXD3

BMP7

bruge en kombination af MassARRAY® EpiTYPER analyse og kvantitativ MethyLight assay, og vurderet udtryk i DU-145 PCA celler.

Metoder

Patient prøver

20 friske frosne PCA vævsprøver (10 Gleason score 6 eller ren mønster 3 (PP3), og 10 Gleason score 8 eller ren mønster 4 (PP4)) opnået fra prostatektomi eksemplarer af patienter med prostatakræft diagnosticeret mellem 2001 og 2007 blev indsamlet fra vævsbanken ved University Health Network (UHN), Toronto. Patienter, som havde terapi før operation var udelukket. En anden serie af prøver, der består af 39 formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) PCA prøver (20 PP3 og 19 PP4) fra patienter diagnosticeret mellem 2006 og 2008 blev ligeledes indsamlet til validering sæt. Alle patienter samtykke til donation af fjernede væv til UHN vævsbanken og prøver blev opnået ifølge protokoller er godkendt af Research Ethics Board fra Mount Sinai Hospital (MSH) og UHN, Toronto, ON, Canada. PCA prøver blev udsat for histologisk undersøgelse af en ekspert patolog (TVDK) for uafhængig bekræftelse af Gleason kvaliteter.

cellelinjer og DNA-ekstraktion

Menneskelig PCA cellelinjer LNCaP (ATCC # EF- referencelaboratoriet 1740 ), DU-145 (ATCC # HTB-81), PC-3 (ATCC # 59500) og 22RV1 (ATCC # EF- referencelaboratoriet 2505) blev opnået fra Drs. M. Zielinska, R. Bristow, og E. Diamandis. Alle celler blev dyrket som monolag i RPMI 1640-medier (Life Technologies) suppleret med 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinier blev dyrket i fugtig atmosfære med 5% CO

2 ved 37 ° C. DNA blev ekstraheret efter høst cellerne ved trypsinisering efterfulgt af DNA-ekstraktion ved hjælp af QIAamp DNA Mini (Qiagen Inc, Mississauga, ON, Canada), ved anvendelse af protokollen anbefalet af leverandøren.

5-Aza 2 ‘-deoxycitidine (DAC) behandling og RT-PCR

A 250 ug /ml stamopløsning af 5- aza 2-deoxycitidine (DAC) (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada) blev fremstillet i vand og holdt ved -80 ° C indtil anvendelse. DU-145-celler blev udpladet i 6 cm skåle og inkuberet i dyrkningsmedium med 2 ug /ml DAC i 4 dage med udskiftning af medium hver 2 dage. Celler blev høstet og total RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), ved anvendelse af protokollen anbefalet af leverandøren.

Primersekvenser for RT-PCR af

BMP7

HOXD3

er tidligere blevet beskrevet [19], [20] og er som følger: (

BMP7

frem) 5′-AGA GCA TCA ACC CCA AGT-3 ‘, (

BMP7

omvendt) 5′-CTA CTC AGG CCC CAG CTT-3 ‘; (

HOXD3

frem) 5′-AGG ATC CTG GTC TGA ACT CAG AGC AGC AGC3 «, (

HOXD3

omvendt) 5′-ACT CGA GTT CAT CCG CCG GTT CTG GAA CCA-3 ‘.

DNA isolation

Frisk frosset arkiveret væv var lynfrosset i flydende nitrogen, knust, og genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af QIAamp DNA mini kit (Qiagen) ifølge sættet protokollen. FFPE væv blev sektioneret (7 um) og lufttørret på objektglas. Områder med en tydelig Gleason klasse i H E farvede objektglas med mindst 80% eller mere neoplastiske celler blev markeret, og de tilsvarende områder blev identificeret på FFPE sektioner til høst celler. Separate prøver med histologisk bekræftet normale væv blev markeret så godt. De berigede cellepopulationer fra fremhævede områder blev derefter manuelt mikrodissekeres og genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af QIAamp DNA Mini kit under anvendelse af en modificeret protokol med udvidet proteinase K-fordøjelse. Kort fortalt blev mikrodissekeret væv spaltet i 30 pi proteinase K ved 56 ° C natten over, efterfulgt af en tilsætning af 20 pi proteinase K og fordøjelse i en time ved 56 ° C den følgende dag. Den Qiagen anbefalede protokol for FFPE væv blev derefter fulgt.

Differential Methvlerinq Hybridisering (DMH) og Human CpG Island Microarrays

forskellen methylering hybridisering teknik til fremstilling af denatureret amplikoner blev udført som beskrevet tidligere [21]. Kort fortalt blev genomisk DNA (0,2 ug) fra PP3 og PP4 sager fordøjet med

Mse

I. De spaltede ender blev ligeret med annealede H-12 /H-24 linkere efterfulgt af yderligere fordøjelse med to successive runder af fordøjelse med følsomme for methylering enzymer, nemlig

Hpa

II og

Bst

UI . Linker PCR-reaktioner blev derpå udført med forbehandlet DNA til generering af de endelige mål-ampliconer for microarray hybridisering. Afsluttende amplikoner blev oprenset ved anvendelse af QIAquick PCR oprensningskit (Qiagen) ifølge producentens protokol. Referenceprøven bestod af DNA isoleret fra lymfocytter fra seks raske mænd aldersmatchede med PCA patienter. Referenceprøver blev behandlet på lignende måde til endelig mål generering og poolede amplikoner blev co-hybridiseret til testcases for individuelle arrays.

Dataanalyse

Alle microarray data, der genereres er kompatibel med de nuværende MIAME standarder i henhold til Brazma

et al

[22].

statistiske analyser blev udført med den statistiske pakke

limma

af

R

[23]. Princippet er at montere en lineær model for hver probe, hvor log-forhold

2 af røde kanal intensitet og grønne kanal intensitet svandt på en tumor indikatorvariabel (I). Vi udførte tre sammenligninger: Ren Mønster 3, Gleason 6 (PP3) (I = 1) vs. Reference (I = 0), Pure M.4, Gleason 8 (PP4) (I = 1) vs. Reference (I = 0) og PP4 (i = 1) vs. PP3 (i = 0), til at finde gener, der har forskellige methylering profiler på tværs af de to grupper sammenlignes. Disse sammenligninger er analoge til en klassisk to-stikprøve

t

-test analyse. Alternativt har vi også brugt en empirisk Bayes

t

-test. Dette har den samme fortolkning som en almindelig

t

-statistic bortset fra at standardafvigelser er modereret tværs gener (skrumpet mod en fælles værdi) under anvendelse af en simpel Bayesian model. Dette har den virkning at låne information fra ensemblet af gener for at gøre følgeslutning om hvert enkelt gen mere robust. Den modereret

t

-statistic har et forøget antal frihedsgrader i forhold til den almindelige

t

-statistic, hvilket afspejler den større pålidelighed forbundet med den udglattede standardafvigelse. Vores analyser blev udført efter forudgående behandling af dataene. I det første tilfælde, vi brugte en korrektion baggrund metode fra Agilent. I det andet tilfælde, vi brugte en metode implanteret i

limma

. En foldning af normale og eksponentielle fordelinger er monteret i forgrunden intensiteter ved hjælp intensiteterne baggrund som kovariat, og det forventede signal den observerede forgrunden bliver den korrigerede intensitet. Dette resulterer i en glat monoton transformation af baggrunden trækkes intensiteter sådan, at alle de korrigerede intensiteter er positive. Begge metoder klaret sig godt på vores data. Vi anvendte derefter en løss normaliseringsproceduren inden arrays til at fjerne eventuelle systematiske tendenser, som opstår ved microarray teknologien fra methylering foranstaltninger [24].

Partek dataanalyse og Integration

Data fra Agilent Feature Extraction software .txt blev analyseret ved hjælp af Partek Genomisk Suite software (PGS) ved hjælp af en ændring af de tidligere beskrevne protokoller [25], [26]. De forarbejdede R og G kolonne data fra 10 PP3 og 10 PP4 blev importeret til PGS. Det bearbejdede R signal svarede til tumor-DNA og behandles G-signal svarende til den normale lymfocyt DNA. Kræften-specifikt signal på tværs af alle sonder blev normaliseret i forhold til baseline ved hjælp Normalisér til baseline Tool i PGS, hvor baseline data svarede til normale humane lymfocytter DNA. Dataene blev derefter logge

2 transformeret ved hjælp af PGS Normalisering og Skalering Tool.

Sådan normaliseret og omdannet datasæt blev derefter anvendt til påvisning af kræft specifikke methylering profiler, og sekundært at skelne mellem PP4 og PP3-specifikke methylering profiler. For at kunne påvise signifikant cancer-specifik berigelse /udtømning, vi udførte Hidden Markov Model (HMM) afsløring region tværs cirka 244.000 sonder med følgende parametre: minimum sonder: 5, afsløring hedder: -2 2; ignorere tilstand: 0, maksimale sandsynlighed: 0,95, genomisk forfald: 10.000, sigma: 1. Sådanne påviste genomiske regioner blev kommenteret til de tilsvarende gener ved hjælp af PGS gen annotation værktøj med Affymetrix HuGene-1_0-st-v1.na24.hg18.transcript .csv-fil. Ud over de direkte overlappende gener, proksimale gener (op og downstream 1000 nukleotider) til de berigede /udtømte regioner blev også kommenteret.

Betydelige forskelle i berigelse mellem PP3 og PP4 tumorer blev identificeret ved at beregne den gennemsnitlige fold forskel mellem PP3 og PP4 normaliseret signal på tværs af alle sonder ved hjælp af PGS ANOVA værktøjet, og efterfølgende påvisning HMM region og gen anmærkning ved hjælp af de ovennævnte parametre. Sådanne genomiske regioner blev yderligere filtreret omfatte sekvenser med mindst 1,3 gange berigelse, og minimum -1.3 fold udtynding. Visualiseringen af ​​data ved hjælp af varme kort, .wig filer til UCSC Genome Browser, genom vist filer, og tilsvarende data tabeller /lister blev udført ved hjælp af PGS som beskrevet tidligere [25], [26].

MassARRAY EpiTYPER Analysis

Kvantitativ analyse af CpG-dinukleotid methylering blev udført under anvendelse af en massespektrometri tilgang som tilgængelig ved MassARRAY® EpiTYPER analyse (Sequenom). EpiTYPER analyse er et MALDI TOF-massespektrometri baseret metode, der giver en kvantitativ afbildning af CpG-dinukleotid methylering til enkelt eller flere dinukleotid opløsning. DNA første bisulfit modificerede, mærket med en T7-promotor, og transkriberes til RNA. Dette spaltes derefter med RNase A og spaltningsprodukter med forskellig masse kan løses ved MS instrument. Analyse blev udført ved den analytiske Genetics Technology Centre (AGTC), prinsesse Margaret Hospital, Toronto, ON ifølge producentens instruktioner under anvendelse af en delmængde af frisk frosset væv DNA, blev anvendt til CpG island microarray analyse. Regioner analyseret af EpiTYPER svarede til dem, der viste en beriget signal i CpG island array-resultater. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og gennemsnit og standardfejl blev beregnet.

Natriumbisulfit Ændring og MethyLight

Natriumbisulfit modifikation af genomisk DNA blev udført ved hjælp af EZ DNA-methylering Gold Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA) ifølge producentens protokol under anvendelse af 0,8 ug af paraffin- indlejret væv DNA.

methylering niveauer af de to gener af interesse blev bestemt ved quantiative methylering specifikke PCR (MSP), den MethyLight assay, som beskrevet tidligere [27]. Primere og prober blev designet specielt til bisulfit ombygget, methyleret DNA og er som følger: (

BMP7

frem) 5′-CGT TTT TTT GGT TCG GAT CGC-3 ‘, (

BMP7

sonde ) 6FAM-5’GTG TCG AGA GGG TAG GGT CGG TTT CG-3′-BHQ1, (

BMP7

omvendt) 5′-CTA AAA CCT AAC GAA ACG TCG CG-3 ‘; (

HOXD3

fremad) 5’GTT TTG GTA TTT CGG GTT TTT ATC G-3 ‘, (

HOXD3

sonde) 6FAM-5’AAG AGC GTT TGG GGG AGG GGG GC 3′-BHQ1, (

HOXD3

omvendt) 5′-TAA AAC TCC TAA CTT CGC GCT ACG-3 ‘; (

Alu

frem) 5′-GGT TAG GTA TAG TGG TTT ATA TTT GTA ATT TTA GTA-3, (

Alu

sonde) 6FAM-5′-CCT ACC TTA ACC TCC C- 3′-MGBNFQ, (

Alu

omvendt) 5′-ATT AAC TAA ACT AAT CTT AAA CTC CTA ACC TCA-3 ‘. Alle reaktioner blev udført på Applied Biosystems 7500 Real Time PCR instrument. Standardkurver blev dannet ved anvendelse seriefortyndinger af positiv kontrol supermethylated DNA til genet af interesse og

Alu

gentager. Procent methylerede forhold (PMR) til et gen blev beregnet ved hjælp af

Alu

gentager som reference som følger: (gen /

Alu

fluorescens mængde ratio for modificeret eksemplar DNA) /(gen /

Alu

forholdet for supermethylated DNA) x 100%. En positiv score for methylering blev givet hvis PMR for en given tumor blev ≥10%.

Resultater

Analyse af genomisk methylering

Vi adskilt analyse af vores microarray data i to undergrupper. Den første delmængde bestod af alle 20 cancer prøver sammenlignet med reference-dna. En liste over gener, der blev identificeret som væsentlig hypermethyleret i de statistiske metoder, der udføres for kræft versus henvisning datasæt (PP3 PP4 versus reference-dna) er afbildet i tabel 1. Interessant 27 af de 100 methylerede gener (sorteret efter individuel sonde fold ændring) fra kræft /reference datasæt er homeobox eller T-box gener (tabel 2), i overensstemmelse med gældende litteratur analysere methylering mønstre i andre kræftformer herunder lunger, bryst, og kolon [28], [29], [30 ]. Vi har også fundet 2 fold signal i generne tidligere identificeret som methyleret i prostatakræft som

CDKN2A

(gennemsnit på 15,8 fold berigelse),

RUNX3

(2,8 gange), og

PTGS2

(2,9 gange). Genet, der viser den største grad af methylering var

FOXC1

med en gennemsnitlig gange ændring på 60,9 versus referencen DNA. Brug PGS, der begrænsede analyse til flere sonder viser berigelse, den største grad af methylering i en karakteriseret gen var

HOXD9

(3,2 gange ændring på 8 sonder).

den anden delmængde af data sammenlignet de ti PP3 sager til de 10 PP4 sager, som vi betegnet progression datasæt. Anvendelse af en 2-fold gennemsnitlig berigelse signal forskel mellem de to mønstre som en cut-off, opdagede vi et sæt af 493 array-prober, der er i stand til at skelne mellem PP3 og PP4 cancere. Vi derefter filtreres flere sonder, der repræsenterer det samme gen og sonder, der repræsenterer karakteriserede steder, hvilket giver en endelig liste over 223 individuelle gener. En specifik probe repræsenterer CAP-GLY domæne indeholdende linker protein familie, medlem 4 (

CLIP4

) viste den største fold forskel mellem de to mønstre (6.5). Brug PGS til statistisk analyse, ventral forreste homeobox 1 (

VAX1

) vises den største gennemsnitlige fold forskel (2.7) over flere prober (6 i alt). Et repræsentativt billede af gener fra PGS analyse er givet i tabel 1. I lighed med kræft /reference datasæt, 23 af de 100 gener klassificeret efter sonde fold ændring fra progression datasæt er homeobox gener (Tabel 2).

Vi næste udvalgt to gener fra disse lister til yderligere analyse ved anvendelse af en kombination af methylering og ekspression baserede teknikker. Udvælgelseskriterier omfattede den biologiske funktion af genet, deltagelse i /bidrag til prostatakræft, og statistisk signifikans fra CpG microarray resultater

Gene specifik methylering analyse

De gener valgt til analyse var:.

BMP7

[knoglemorfogenetisk protein] (kromosom # 8p21), et gen allerede impliceret i PCa progression [31], som tidligere blev rapporteret som methyleret i en oligodendrogliom cellelinje og gastrisk kræft [32] , [33]. Vi besluttede at yderligere at undersøge dets methylering profil på grund af dens formodede nedregulering i PCa progression [31] og observerede methylering signal i vores cancer /reference datasæt (3,2 fold berigelse), hvilket antyder, at methylering af dette gen kan spille en rolle i PCa progression.

HOXD3

[Homoebox transskription faktor] (kromosom # 2q31-37), et gen sig at være methyleres i lungekræft cellelinjer og primære tumorer [34], som viste en tydelig mønster af stigende methylering med tumorklassificering i vores serie baseret på gennemsnitlig berigelse forskel (6,4), hvilket antyder, at methylering af dette gen kan være involveret i sygdomsprogression samt.

Partek grafisk og heatmap visualisering af microarray data vist for de to gener i figur 1.

(A)

BMP7

og (B)

HOXD3

. Linje grafer i det øverste panel af hvert show log

2 forholdet værdier for hver probe, med røde repræsenterer PP4 sager A-J og blå PP3 sager 1-10 repræsenterer. Den nederste panel af hver er en varme kort for hver probe i individuelle PP4 og PP3 sager. Røde pile svarer til regioner udvalgt til EpiTYPER analyse mens sorte pile svarer til regioner valgt til MethyLight analyse.

EpiTYPER kvantificering af CpG Methylering

EpiTYPER analyse omfattede en delmængde af sager, der viste berigelse af ≥3 fold eller en mangel på methylering signal (≤2 fold) på mikroarrays. Data fra EpiTYPER analyse bekræftede berigelse /methylering profiler i

BMP7

og

HOXD3

der var tydeligt af de microarray resulterer i et sæt af fire microarray sager udvalgt til analyse (figur 2, 3) . For

BMP7

, methylering af regionen identificeret ved vores microarray analyse bekræftede, at for prøver B og 3, var der en signifikant grad af methylering sammenlignet med referencen DNA (op til 76% for CpG-dinukleotid 4 i prøve B) (2A, B). Disse prøver havde en gennemsnitlig methylering af 43% og 52% (methyleret /methyleret ratio, givet som procent) henholdsvis på tværs af alle 35 CpG’er analyserede, mens prøver I og 4 viste et gennemsnitligt CpG-methylering på 14% og 17%, hhv.

HOXD3

vises et tydeligt mønster af øget methylering i PP4 sager sammenlignet med PP3 sager. Analysen af ​​frisk frosset DNA-prøver F, I, 4 og 8 bekræftede en differentielt methylering fra PP3 til PP4, i det mindste med hensyn til de fire analyserede sager (figur 3A, B). Høj kvalitet sager F og jeg havde en gennemsnitlig methylering af 72% og 43%, på tværs af alle 27 CpG-dinukleotider analyseret, mens lav kvalitet prøver 4 og 8 havde en gennemsnitlig methylering af 19% og 35%.

(A) PP3 sager 3 og 4 og (B) PP4 tilfælde B og I. reference lymfocyt er vist for hver. Farvede søjler repræsenterer den gennemsnitlige methylering over tre gentagelser med standard fejllinjer vises.

(A) PP3 sager 4 og 8 og (B) PP4 sager F og I. reference lymfocyt er vist for hver. Farvede søjler repræsenterer den gennemsnitlige methylering over tre gentagelser med standard fejllinjer vises.

MethyLight Analyse

For at verificere methylering mønstre af disse gener, vi valideret dem i en selvstændig serie af paraffin indlejret PCA tilfælde, med matchede normale væv fra de samme prøver, hvor tilgængelige, og også vurderet deres status methylering i PCA cellelinier (DU-145, PC-3, 22RV1, og LNCaP) ved hjælp MethyLight.

BMP7

methylering blev bekræftet i alt 4 tumor prøver (to PP3, to PP4) samt to normale prøver fra forskellige tilfælde (figur 4A).

HOXD3

methylering var til stede i alt otte prøver (to PP3, seks PP4) (figur 4B). DU-145 celler var positive for methylering af både

BMP7

HOXD3

. PMR-værdier for DU-145 og positive tilfælde er angivet i tabel 3.

(A)

BMP7

og (B)

HOXD3

MethyLight forstærkning plots. X-aksen viser antallet af cykler, mens y-aksen viser delta Rn værdi. + Ctrl -. Supermethylated DNA

RT-PCR

Vi næste behandlet DU-145 celler med demethyleringsmiddel DAC og udført semi-kvantitativ RT-PCR-analyse ved hjælp af ubehandlet og behandlede celler for at vurdere virkningen af ​​methylering ved ekspression på de to gener.

HOXD3

udtryk synes at være helt afskaffet i ubehandlede DU-145 celler, mens

BMP7

er minimalt udtryk. Behandling med DAC induceret

HOXD3

udtryk og forårsagede en stigning i

BMP7

mRNA-niveauer (Figur 5), hvilket indikerer, at methylering er involveret i reduceret ekspression af både

BMP7

HOXD3

NTC -. ingen skabelon kontrol. -DAC – Ubehandlet. + DAC – behandlet med 5-aza-2-deoxycytidin

Diskussion

Vi har brugt humane CpG ø microarrays at identificere denatureret gener i PCa som helhed, såvel som forskelligt. methylerede i lav kvalitet, PP3 og høj kvalitet, PP4 PSA. Intermediate Gleason score 7 tumorer blev ikke undersøgt, da de er sammensat af både mønstre 3 og 4, og vi valgte at indsnævre vores fokus på de tumorer, der er sammensat udelukkende af Gleason mønster 3 eller Gleason mønster 4, for at have beriget celle mønster befolkninger. Vi fandt, at vi var i stand til at identificere CpG-øer, der er både kvantitativt mere methyleret og methyleret på en øget frekvens i PP4 tumorer sammenlignet med PP3 tumorer. Dette kan afspejle en overordnet skift til en større tilstand af methylering inden promoter CpG øer som tumoren skrider i retning af en højere lønklasse.

De fleste gener afsløret gennem vores arrays har enten aldrig blevet vist at methyleres i PCa eller i andre cancertyper. Andre tidligere beskrevne denatureret gener i prostatakræft, såsom

CDKN2A

,

PTGS2

, og

RUNX3

, viste alle tegn på methylering baseret på fold ændringer og statistisk signifikans. Den stringens af de statistiske analyser, at vi udførte kunne have forhindret inddragelse af disse gener i vores top gener af progressionen eller cancer /reference datasæt. Derfor kan det ikke være tegn på en mangel på methylering, men i stedet kan forklares med kvantitative methylering niveauer. Det er muligt, at methylering af disse gener kan være sket i færre celler og /eller i et mindre antal CpG-dinukleotider, hvorved der frembringes en mindre robust signal i vores skærm. Alternativt kan gruppering af sager i statistiske analyser har filtreret disse gener ud, da methylering i et færre antal prøver vil skabe en lavere gennemsnitlig og højere variation på tværs af disse sager. Vi blev overraskede over at finde, at den bedst karakteriserede methylering begivenhed i PCa, hypermethylering af

GSTP1

promotor, ikke blev fanget i vores matrix skærm resultater. Det er muligt, at den anvendte metode omfatter til mål-DNA-fremstilling i kombination med microarray platform er ansvarlig for den manglende påvisning af

GSTP1

methylering signal. Sekvensanalyse af

GSTP1

afslørede, at vores methyleret DNA berigelse metode ville frembringe et fragment på ca. 1900 bp, som kan påvirke annealing til prober med betydeligt mindre længde (ca. 45-60 mer) eller kan ikke forblive intakt efter methylering følsomme fordøjelse. Ved nærmere undersøgelse af

GSTP1

methylering i de samme 20 kræft prøver, men vi kunne opdage methylering i 80% af tilfældene ved hjælp MSP (data ikke vist).

Vi udviklede en liste af gener at sammenligne den samlede cancer datasæt versus reference, samt separering methylering profiler for PP3 og PP4 Gleason scores. Vi valgte at gøre en grundig methylering analyse af

BMP7

HOXD3

, da disse er nye mål for methylering i PSA. De repræsenterer en delmængde af gener, hvor lyddæmpningssystemer kan spille en rolle i udviklingen af ​​høj kvalitet prostatakræft baseret på vores array-resultater, men også baseret på tilgængelige funktionel oplysninger fra nuværende litteratur. Derfor behøver disse gener ikke nødvendigvis afspejler den største statistiske signifikans eller den største methylering fold ændring i enten to datasæt, som vi producerede. Generne med de største fold ændringer i datasæt,

FOXC1

VAX1

vil kræve fremtidig validering i en større serie af prostata tumorer.

knoglemorfogene proteiner udskilles faktorer, der styrer udviklingen og vedligeholdelsen af ​​knogledannelse og hører til TGF superfamilien af ​​signalproteiner [35]. Inden PCa er det blevet påvist, at

er BMP7

betydeligt underexpressed i laser mikrodissekeres kræftceller, hvilket fører til en epitelial-til-mesenkymale overgang [31]. Det betyder dog, synes at være re-udtrykkes i metastatiske PCa foci af knoglen [36]. Vores opdagelse af promotor methylering i

BMP7

tyder på en mulig mekanisme, gennem hvilken den indledende nedregulering opnås, som behandling af DU-145-cellelinjer med DAC steget

BMP7

udtryk dramatisk. Tidligere undersøgelser har vist methylering af

BMP7

i gastriske cancere og oligodendroglioma cellelinier [32], [33], hvilket antyder, at nedregulering af

BMP7

via denne mekanisme er ikke begrænset til PCa alene. Notatet

BMP7

methylering var ikke eksklusivt til histologisk kræft væv, men var også tydeligt i tilstødende normale væv. Dette kan tilskrives det område cancerization effekt hvorved methylering sker før enhver histologisk kræft ændring i cellerne, som har vist sig at forekomme i prostatacancer [37]. Alternativt kan denne methylering primært aldersrelateret, da dette fænomen også er blevet vist før i normalt prostatavæv [38]. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at løse disse problemer.

HOXD3

, anden roman PCa methylering mål, viste en tydelig ændring i retning af en højere grad af methylering fra PP3 til PP4 PCa når man analyserer vores CpG array-resultater. Den rolle, som

HOXD3

spiller i tumorigenese og /eller progression af sygdommen er endnu ikke identificeret, men aktivering af TGFp signalering er blevet vist i A549-celler transficeret med

HOXD3

[39]. Afvigelser i denne vej er veldokumenteret i PCa og andre kræftformer [40]. Det er derfor muligt, at methylering-induceret nedregulering af

HOXD3

er forstyrrende TGFp signalering, og måske bidrage til udviklingen af ​​høj kvalitet PCa.