PLoS ONE: En MicroRNA Signature Forudsiger overlevelse i Early Stage småcellet lungekræft behandles med kirurgi og adjuverende kemoterapi

Abstrakt

Små-cellet lungekræft (SCLC) er en af ​​de mest aggressive kræftformer, men de molekylære mekanismer bag sin ødelæggende kliniske resultat forblive undvigende. I denne undersøgelse har vi undersøgt, om microRNA (miRNA) udtryk profiler kan forudsige kliniske resultater af SCLC patienter. I alt 82 patienter med begrænset SCLC, som blev behandlet med kirurgisk resektion og adjuverende kemoterapi, blev indrulleret i denne undersøgelse. Først undersøgte vi ekspressionen af ​​924 miRNA fra 42 SCLC-patienter til at opdage overlevelsesorienterede relevante miRNA og udvikle prognostiske modeller, som derefter blev valideret i en uafhængig kohorte af 40 tilfælde ved brug af kvantitativ real-time PCR. Vi fandt, at MIR-150 /MIR-886-3p signatur var signifikant korreleret med total overlevelse (OS) af SCLC patienter (p = 0,02) i træningssættet, og begge miRNA ekspressionsniveauer var meget lavere i SCLC prøver end normale lunge prøver. Den miRNA signatur viste sig også at være en betydelig indikator for overlevelse i valideringen sæt. Patienter med høj risiko miRNA underskrifter havde dårlig samlet overlevelse (p = 0,005) og progressionsfri overlevelse (p = 0,017) sammenlignet med dem med lav risiko scoringer. Disse resultater bevaret statistisk signifikans efter justering for alder, køn og rygning status (HR: 0,26, 95%: CI 0,10-0,69, p = 0,007), hvilket foreslog det kan være en uafhængig prædiktor for overlevelse. Sammenfattende har vi udviklet en prognostisk miR-150 /miR-886-3p signatur og valideret udtryk i et selvstændigt datasæt af resektabel SCLC. Disse foreløbige resultater viste, at miRNA kan tjene som lovende molekylære prognostiske markører og nye terapeutiske mål for SCLC

Henvisning:. Bi N, Cao J, Song Y, Shen J, Liu W, Fan J, et al. (2014) En MicroRNA Signature Forudsiger overlevelse i Early Stage småcellet lungekræft behandles med kirurgi og opfølgende kemoterapi. PLoS ONE 9 (3): e91388. doi: 10,1371 /journal.pone.0091388

Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrig

Modtaget: November 26, 2013; Accepteret: 10. februar, 2014 Udgivet: 17 Marts 2014

Copyright: © 2014 Bi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af 973 National Key Fundamental Research Program Kina (2009CB521801, 2010CB912800) og National Natural Science Foundation of China (81.021.061, 81.071.830). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft stadig den førende dødsårsag i verden, og småcellet lungecancer (SCLC) tegner sig for 15-25% af tilfældene [1]. Klinisk SCLC skelnes fra ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) af hurtig vækst tumor og tidlig indtræden af ​​metastaser. I modsætning til i de fleste vestlige lande, er SCLC satser stadig stigende i Kina, hvor rygning prævalens også fortsætter med at stige. Selvom SCLC anses for meget lydhøre over for kemoterapi og strålebehandling, tilbagefald ofte inden for to år, og den samlede overlevelse (OS) ud over fem år er ca. 3% -8%. For at forbedre de kliniske resultater, er der udviklet nye lægemidler, men det er nedslående, at overlevelsen for både lokaliseret og avancerede SCLC er toppet i de seneste 20 år.

SCLC menes at bære en række molekylære abnormiteter, der er helt anderledes end NSCLC. For eksempel, TP53 mutationer, Rb inaktivering og c-myc amplifikation er almindelige i SCLC sammenlignet med NSCLC [2], [3]. I modsætning hertil er epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) mutationer, K-ras-mutationer og P16 inaktivering ofte findes i NSCLC, men ikke i SCLC [2] – [4]. Men de underliggende mekanismer, som SCLC hurtigt skrider mangler at blive fastlagt, og identifikationen af ​​disse mekanismer kan fremme udviklingen af ​​nye terapeutiske midler og forbedre forvaltningen af ​​denne udfordrende sygdom.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af ikke-kodende RNA’er, der er ca. 22 nukleotider lange og er post-transkriptionelle regulatorer af genekspression. På grund af deres grundlæggende rolle i udviklingen og differentiering, deltagelse i de biologiske mekanismer bag tumorigenese og progression, samt lav kompleksitet, stabilitet og nem påvisning, miRNA udgør en lovende klasse af vævs- og blod-baserede biomarkører for kræft.

En række forskere har påvist, at afvigende miRNA udtryk er tæt forbundet med udviklingen og progressionen af ​​mange kræftformer, opfører sig som tumor undertrykkere eller onkogener [5] – [10]. De seneste data fra flere studier stærkt støtte potentialet for microRNA’er som biomarkører for NSCLC [11] – [17]. Desuden ændres microRNA ekspression også forbundet med tumorprogression og overlevelse i NSCLC-cancerpatienter. En global miRNA udtryk mønster vurderet bruger, er blevet etableret microarray analyse, og er blevet foreslået flere NSCLC “miRNA signaturer” for forbedret molekylær iscenesættelse og klassifikation af NSCLC [18] – [21]. Men den kliniske betydning af miRNA i SCLC er ikke veletableret.

For at undersøge betydningen af ​​afvigende miRNA udtryk profiler i SCLC, vi først adspurgte 924 kendte miRNA i formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) prøver fra 42 patienter og identificeret en dual-miRNA signatur til at forudsige det kliniske resultat af tidlige stadie SCLC patienter behandlet med kirurgisk resektion efterfulgt af adjuverende kemoterapi. Denne forening blev yderligere valideret med kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (QRT-PCR) analyse af 40 ekstra patientprøver, og den prognostiske værdi af signaturen synes at være uafhængig af alder, køn og rygning status i multivariat Cox regressionsanalyse.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne retrospektiv undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of Cancer Hospital og Institut for kinesiske Academy of Medical Sciences og Peking Union Medical College. Alle de patientjournaler, der anvendes i denne undersøgelse blev anonymiseret og de-identificeret inden analyse.

Patienter og prøver

Vi retrospektivt studerede formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) prøver fra patienter, som blev diagnosticeret med resektable begrænset SCLC og blev opereret efterfulgt af adjuverende kemoterapi (platin-baserede regimer såsom cisplatin /etoposid og carboplatin /etoposid) ved Cancer Hospital og Institut for kinesiske Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina) fra januar 2000 til december 2005. Alle patienterne havde en ECOG performance status på 0-1, og patienter med blandet småcellet /stor-cell carcinoma eller kombineret småcellet karcinom blev udelukket. I alt blev 82 SCLC patientprøver analyseres, blandt hvilke 42 prøver blev anvendt som en screening indstillet til at identificere miRNA forbundet med overlevelse ved anvendelse af et miRNA microarray. De udvalgte miRNA blev derefter valideret i de resterende 40 patienter ved hjælp af real-time PCR. Hematoxylin og eosin (H MIR-150, TCTCCCAACCCTTGTACCAGTG; MIR-150 RT-primer, GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACTGG; MIR-150 fremadrettet primer, GTCTCCCAACCCTTGTACCA; miR-886-3p, CGCGGGTGCTTACTGACCCTT; MIR-886-3p RT-primer, GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAGGGT; MIR-886-3p fremadrettet primer, CACGCGGGTGCTTACTGAC; U6 fremadrettet primer, CTCGCTTCGGCAGCACA; og U6 revers primer, AACGCTTCACGAATTTGCGT. QRT-PCR blev udført under anvendelse af en ABI Prizm 7300 Sequence Detection System med LightCycler DNA Master SYBR Green I mix (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Niveauet af miRNA blev bestemt ved anvendelse af 2

-ΔΔCt metode med SDS 1.3 software, normaliseret til niveauet for den interne kontrol, U6, og plottet for inter-cellulære sammenligning.

endepunkter

Det primære effektmål med denne undersøgelse var OS. Sekundære endepunkter omfattede progressionsfri overlevelse (PFS), lokal-regional kontrol (LRC), og fjernmetastaser overlevelse (DMFS). OS blev beregnet fra datoen for diagnose til død uanset årsag eller den sidst kendte dato, at patienten var i live. PFS blev defineret som varigheden fra tidspunktet for diagnosen til datoen for fiasko enten i brystkassen eller på fjerne steder, datoen for død uanset årsag, eller datoen for den sidste patient opfølgning.

LRC blev beregnet fra datoen for diagnose til den første lokale-regionale (thorax) gentagelse, og DMFS blev beregnet fra datoen for diagnose til den første fjernmetastaser, datoen for død uanset årsag, eller datoen for den sidste patient opfølgning -up.

Statistisk analyse

de kliniske karakteristika for forskellige grupper blev sammenlignet ved hjælp af den selvstuderende t-test, χ

2 test, eller Fishers eksakte test. Sammenhængen mellem microarray data og QRT-PCR-data blev analyseret med Spearman korrelation. OS, PFS, LRC og DMFS blev estimeret med Kaplan-Meier-metoden og log-rank test. HRs blev beregnet med Cox regressionsanalyse. En multivariat Cox regressionsmodel blev brugt til at teste, om miRNA signatur var en uafhængig prognostisk faktor, når der korrigeres for alder, køn og rygning status. Alle analyser blev udført under anvendelse af SPSS software pakken (version 11.5, SPSS Inc., Chicago, IL). En to-sidet p-værdi på mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Resultater

De kliniske karakteristika for de 82 SCLC patienter er anført i tabel 1. Den mediane opfølgning gang var 57,2 måneder. Fyrre-fire patienter er stadig i live. Fyrre-to patienter havde tilbagevendende sygdom, og den mediane tid til en diagnose af tilbagefald var 12,3 måneder.

I træningssættet, vi identificeret to miRNA, miR-150 og miR-886-3p, der var forbundet med dårlige OS vha Cox proportional hazard regression. Begge af dem var beskyttende (tabel 2). Sammenligningen mellem NL og SCLC-væv også bekræftet, at miR-150 og miR-886-3p ekspressionsniveauer i SCLC tumorer var meget lavere end i NL prøver (figur 1).

Vi derefter udledt en formel til at beregne risikoen score for hver patient fra udtrykket niveauet for de to miRNA forbundet med OS, vejet med Cox regressionskoefficienter: risiko score = (0,545 × udtryk niveau af miR-150) + (0,617 × udtryk niveau af miR -886-3p). Patienter i træningssættet blev inddelt i høj-risiko eller lav risiko grupper med medianen miRNA signatur risikoscore som cutoff. Patienter med risiko score højere forventes at have dårlig OS. Sammenlignet med patienter med en lav risiko miRNA signatur, patienter med en høj risiko signatur havde signifikant kortere median OS (12.6 måneder sammenlignet med ikke nået, p = 0,02) (fig. 2A). Ligeledes patienter i gruppen med høj risiko havde kortere PFS og DMFS gange end dem i gruppe med lav risiko (Begge p-værdier var 0,045) (fig. 2B-C). Men LRCs var ens mellem de to grupper (p = 0,36) (fig. 2D).

For at validere microarray hybridisering udtryk data, ekspressionsniveauerne af de to miRNA forbundet med OS blev kvantificeret ved hjælp af QRT-PCR i 10 SCLC-væv valgt tilfældigt fra træningssættet. Signifikant korrelation blev observeret mellem log 2-transformeret Array signalintensiteter og QRT-PCR Ct-værdier for både MIR-150 (r = 0,94, p 0,001) og MIR-886-3p (r = 0,75, p = 0,01) (fig. 3).

(C) Sammenhæng mellem ekspressionen af ​​U6 RNA ved QRT-PCR og log 2-transformeret globale gennemsnitlige matrix udtryk. (D) Ekspression af U6 RNA i humant normalt lungevæv (NL, n = 3) og småcellet lungecancer (SCLC, n = 42) prøver ved microarray metode. Whiskers skildrer de 10 og 90 percentiler. p-værdi beregnes af Mann-Whitney U test.

Dernæst brugte vi den samme risiko score formel fås fra uddannelsen sat til at beregne den miRNA signatur risikoscore for 40 patienter i sættet test, for hvilke miRNA niveauer i FFPE prøver blev bestemt ved QRT-PCR. Igen, den høje miRNA signatur risiko score patienterne udviste kortere overlevelse end i gruppen med lav risiko (median OS 18,9 måneder sammenlignet med ikke nået, p = 0,005) (fig. 4A). PFS, DMFS, og LRC var også signifikant kortere i den høje end i gruppen med lav risiko (PFS p = 0,017, DMFS p = 0,019 og LRC p = 0,031, Fig. 4B, 4C, og 4D). Den multivariate Cox-regressionsanalyse blev udført for yderligere at vurdere, om dual-miRNA signatur er en uafhængig prognostisk faktor i forbindelse med overlevelse i denne test sæt. Vores resultater viste, at miRNA signatur fortsat være en uafhængig prognostisk faktor til OS (HR: 0,26, 95%: CI 0,10-0,69, p = 0,007), PFS (HR: 0,36, 95%: CI 0,15-0,86, p = 0,02) , DMFS (HR: 0,34, 95%: CI 0,13-0,86, p = 0,02), og LRC (HR: 0,26, 95%: CI 0,07 til 0,99, p = 0,05) efter justering for alder, køn og rygning status (tabel 3).

diskussion

i denne undersøgelse indledte vi en opdagelse fase øvelse at identificere de vigtigste miRNA ved opmåling ekspression af 924 kendte miRNA i FFPE prøver fra 42 SCLC tilfælde. Vi opdagede, at en dual-miRNA signatur, miR-150 og miR-886-3p, var forbundet med OS og PFS. Disse resultater blev efterfølgende bekræftet i en uafhængig kohorte af 40 SCLC patienter ved hjælp af QRT-PCR-metoden, og overensstemmelsen mellem disse to platforme var høj.

Anvendelse en optimal normalisering metode er særlig vigtig for miRNA profilering at minimere tekniske variationer og få meningsfulde biologiske ændringer. Der er dog ingen konsensus normalisering metode og anbefalinger på nuværende til enten microarray eller QRT-PCR-metoder i form af miRNA profilering. I denne undersøgelse anvendte vi et globalt normaliseringsmetode i træningssættet, som anses for mere egnet til storskalaproduktion miRNA-profilering datasæt [27]. I sættet test, vi brugte U6 RNA til at normalisere data, fordi det er den hyppigst rapporterede henvisning gen for miRNA udtryk studier i lungekræft i litteraturen [21], [28] – [30]. Vi korreleret også udtryk for de to miRNA på QRT-PCR med array-udtryk, og bekræftede, at de forskellige miRNA-profilering metoder ikke havde indflydelse på resultaterne af miR-150 og miR-886-3p udtryk (Fig.3A-B). Desuden blev korrelationen af ​​U6 udtryk på QRT-PCR med globale middeltemperatur vifte udtryk observeret (r = 0,71, p 0,001;. Figur 3C). U6 RNA viste absolut fold ændrer lavere end 1,2 gange og havde ingen signifikante forskelle mellem NL og SCLC-prøver (p = 0,96, fig. 3D).

I øjeblikket er der kun to offentliggjorte undersøgelser undersøger miRNA udtryk i humane SCLC prøver [31], [32]. Lee et al. undersøgte udtryk for et panel af syv miRNA (miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, og lad-7a) i 31 SCLC-tumorer [31]. De rapporterede, at ekspression af disse syv miRNA var relateret til de kliniske karakteristika for SCLC patienter og var ikke prognostisk i form af OS eller PFS, var heller ikke udtryk niveau prædiktive for behandlingsrespons. Disse data var i overensstemmelse med vores resultater. Ranade og kolleger evalueret ekspressionen af ​​880 validerede humane modne miRNA med yderligere 473 valideret human pre-miRNA i 34 formalinfikserede, paraffinindlejrede SCLC tumorprøver og fandt, at MIR-92a-2 * uafhængigt var forbundet med overlevelse. Selv om denne undersøgelse viste for første gang, at miRNA kan være prognostisk for SCLC, den omfattede tilfælde med både begrænset stadie (12,1%) og omfattende fase (87,9%) kræft på diagnose, og patienter med omfattende-stadie sygdom har kræft, der anses mere heterogen. Endvidere i denne undersøgelse, blev tumorvæv indsamlet ikke kun fra primære tumorer, men også fra lymfeknuder og fjerne metastaser, hvilket ville forvirre resultaterne af evalueringen fordi miRNA ekspression anses for at være vævsspecifik. Desuden er det kun halvdelen af ​​patienterne i denne undersøgelse fik stråling under first-line behandling. Dette er vigtigt, fordi stråling kan påvirke overlevelsen betydeligt i både begrænset-fase [33] og omfattende fase SCLC [34]. Til dato, vores undersøgelse er det første viser, at i den tidlige fase SCLC patienter behandlet med kirurgi og adjuverende kemoterapi, en miR-150 /miR-886-3p signatur forudsiger OS og PFS i både træning og test sæt. Denne forening var uafhængig af alder, køn og rygning status. Disse resultater viser, at miR-150 /miR-886-3p signatur kan være en god kandidat som en molekylær prognostisk markør og vil potentielt hjælpe lægerne til at identificere patienter med høj risiko, der kan have gavn af mere omfattende adjuverende behandling.

Vi fandt også, at både miR-150 og miR-886-3p negativt var forbundet med OS. Sammenligning af miRNA niveauer mellem NL og SCLC-væv også bekræftet, at miR-150 og miR-886-3p ekspressionsniveauerne i SCLC var meget lavere end i NL prøver. På grund af den lille NL stikprøve, vi var ude af stand til at identificere et mønster af vedvarende små p-værdier. Men disse data konsekvent foreslog, at miR-150 og miR-886-3p kunne tjene som vigtige tumorsuppressorer i udviklingen og progressionen af ​​SCLC og kan fungere med potentielle anticancer mål. Vores tidligere eksperimentel undersøgelse har vist en hidtil ukendt MIR-886-3p-medieret mekanisme ligger til grund for afvigende ekspression af i polo-lignende kinase 1 (PLK1) og transformerende vækstfaktor beta 1 (TGF-β1) i SCLC [23]. Den 3 ‘utranslaterede regioner af PLK1 og TGF-β1 indeholder højt konserveret MIR-886-3p bindende motiver, og direkte interaktioner med MIR-886 nedregulerer endogen PLK1 og TGF-p1 proteinniveauer. Vi viste ligeledes, at MIR-886-3p overekspression inhiberede proliferation, migration og invasion i SCLC celler, samt undertrykke væksten og metastase af SCLC xenografter i nøgne mus. Endelig afslørede vi, at mekanismen bag nedreguleret ekspression af MIR-886-3p i SCLC blev medieret af DNA hypermethylering af dets promotor. Tilsammen disse resultater etablere en miR-886-3p-PLK1 /TGF-b1 nexus som en ny regulator og lovende terapeutisk mål for SCLC.

observation af miR-150 som en tumor suppressor i SCLC er i overensstemmelse med lignende observationer i bugspytkirtelkræft [35], levercancer [36], kolorektal cancer [37], NSCLC [38], malignt lymfom [39] og akut leukæmi [40]. Imidlertid har ikke været rapporteret sit engagement i SCLC, og de præcise molekylære mekanismer bag sin ændrede udtryk er uklare. Jiang et al. for nylig fundet, at MIR-150 modning er undertrykt af MYC i MLL-associeret leukæmi. Desuden er MIR-150 rapporteret at være en beskyttende miRNA, der er direkte målrettet c-Myb og andre faktorer [36], [40]. MIR-150 interagerer med 3’UTR af c-Myb-mRNA, og overekspression af MIR-150 nedregulerer c-myb proteinniveauer [36]. Interessant begge MYC familiemedlemmer og c-Myb gen er to kendte og dominerende proto-onkogener, der ofte viser sig at blive forstærket eller over-udtrykt i SCLC [41]. Tilsammen disse nyligt publicerede data sammen med vores, tyder på, at miR-150 har en tumor suppressor effekt i SCLC fordi lave niveauer af miR-150-ekspression var korreleret med dårlig overlevelse. Der er dog behov for yderligere undersøgelser for at belyse de molekylære mekanismer i både årsag og virkning af ændrede miR-150-ekspression i udviklingen og progressionen af ​​SCLC.

Begrænsninger af denne undersøgelse omfatter dens relativt lille stikprøve størrelse, en nødvendighed fordi kun et lille antal patienter (mindre end 5%) med tidlig perifer sygdom [42] er kirurgiske kandidater. Mere end otte hundrede SCLC patienter blev behandlet med kemoterapi på vores hospital i samme periode. Som et resultat, biomarkør analyser fra SCLC-patienter rapporteres langt mindre hyppigt i forhold til NSCLC-patienter. Desuden, fordi denne kendsgerning, multi-test korrektioner blev ikke anvendt i denne undersøgelse, fordi disse korrektioner forhindre type I fejl på bekostning af en stigning i type II fejl. Ikke desto mindre blev sammenhængen mellem miRNA signatur og kliniske resultater uafhængigt bekræftet i en anden patient sæt. Der er behov for mere omfattende undersøgelser for at bekræfte vores resultater. En anden begrænsning er den retrospektive design. Imidlertid blev alle målinger foretaget i en blind måde. Endelig bør potentiel interaktion mellem miR-150 og miR-886-3p undersøges nærmere at belyse mekanismen bag den prognostiske rolle af denne dual-miRNA signatur.

Som konklusion, foreslog vores foreløbige resultater, at miR -150 /miR-886-3p signatur kan forudsige kræft progression og overlevelse i begyndelsen fase SCLC-patienter og kan være en lovende prognostisk biomarkør og potentielle terapeutiske mål for SCLC patienter.

Tak

Denne undersøgelse 31 blev accepteret til mundtlig præsentation på det 15. verdenskonference om lungekræft, Sydney, Australien, October 27 oktober 2013.