PLoS ONE: synergistiske virkninger af Samtidig blokade af PI3K og MEK Pathways i kræft i bugspytkirtlen prækliniske modeller

Abstrakt

Patienter med kræft i bugspytkirtlen har triste prognoser, og der er et presserende behov for nye behandlingsformer. Mutationer af KRAS onkogen forekommer hyppigt i bugspytkirtelkræft og udgør et attraktivt mål. Direkte målretning af de fremherskende KRAS veje har været udfordrende og forskning i terapeutiske strategier er blevet nu er fokuseret på veje nedstrøms for KRAS, phosphoinositid 3-kinase (PI3K) og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK [MEK]). Vi antager, at samtidig inhibering af PI3K og MEK pathways ville resultere i synergistisk antitumorvirkning, som det ville omgå kompenserende vekselvirkning mellem de to veje. Vi undersøgte den kombinerede virkning af PI3K-inhibitor, GDC0941, og MEK-inhibitor, AZD6244, på cellelevedygtighed, apoptose og cellesignalering i et panel af pancreascancer cellelinier. En

in vivo

analyse blev udført på bugspytkirtelkræft implanteret. Mens BxPC-3 (KRAS vildtype) og MIA PaCa-2 (KRAS muterede) cellelinier var følsomme over for GDC0941 og AZD6244 som enkelte midler, synergistiske inhibering af tumorcellevækst og induktion af apoptose blev observeret i begge cellelinier, når de to lægemidler blev kombineret. Interessant, fosforylering af cap-afhængige translationelle komponenter, blev fundet 4E-bindende protein (p-4E-BP1) og S6 at være tæt forbundet med følsomhed over for GDC0941 og AZD6244. I BxPC-3 celle xenografter blev observeret overlevelse forskelle mellem kontrol og AZD6244, GDC0941, og kombination grupper. Vores undersøgelse giver begrundelsen for samtidig målretning af PI3K og MEK veje, uanset KRAS-status, og foreslår, at phosphorylering af 4E-BP1and S6 kan tjene som en prædiktiv biomarkør for respons på behandling

Henvisning:. Zhong H , Sanchez C, Spitrzer D, Plambeck-Suess S, Gibbs J., Hawkins WG, et al. (2013) synergistiske virkninger af samtidig blokade af PI3K og MEK Pathways i kræft i bugspytkirtlen prækliniske modeller. PLoS ONE 8 (10): e77243. doi: 10,1371 /journal.pone.0077243

Redaktør: Adriano Angelucci, University of L’Aquila, Italien

Modtaget: April 15, 2013; Accepteret: August 30, 2013; Udgivet: 9 okt 2013

Copyright: © 2013 Zhong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Publikationen blev støttet af Washington University Klinisk Institut og Translationelle Sciences Grant UL1TR000448 fra National center for Fremme Translationel Sciences (MCATS) og KL2TR000450. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd og kvinder i USA. Det anslås 43,140 mennesker blev diagnosticeret med og 36.800 døde af kræft i bugspytkirtlen i 2013 [1]. Manglen på screeningsmetoder og effektive terapeutiske midler gør påvisning og behandling af pancreascancer et vanskeligt problem. Mens målrettede midler er blevet mainstream for andre typer af kræft, på nuværende tidspunkt, har kun den epidermale vækstfaktor receptor hæmmer erlotinib vundet godkendelse fra Food and Drug Administration til behandling af kræft i bugspytkirtlen [2]. Desværre er den kliniske anvendelighed af erlotinib stort set begrænset på grund af sin temmelig beskeden klinisk fordel, hvilket afspejler en fortsat presserende at udvikle målrettede agenter i bugspytkirtelkræft.

Tilstedeværelsen af ​​en KRAS mutation ses i 30% af præmaligne læsioner [3], op til 90% af pancreas-cancer tumorprøver [4], hvilket antyder, at KRAS mutation er den dominerende kendte træk ved pancreascancer molekylær patogenese. KRAS er en GTPase, og det konverterer ekstracellulære signaler til intracellulære signaler ved at cykle mellem den aktive (RAS-GTP) og inaktive (RAS-BNP) stater. Muterede KRAS resulterer i konstant aktivering af ras-banen ved låsning RAS til den aktive GTP-bindende tilstand og yderligere udløsning af flere efterfølgende signalveje, herunder celleproliferation, apoptose, differentiering og overlevelse [5]. Direkte målretning af KRAS har ikke været en succes i patienter med kræft i bugspytkirtlen [6], så igangværende forskning har fokuseret på to nedstrøms veje, den phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT-vejen [7] og RAF /MEK vej [8 , 9].

Fordi celle signalering netværk er komplekse, er ikke at resultere i en signifikant klinisk respons, med mindre den genetiske vekslen gør målrettede “effektor” til at være en oncologically drevet begivenhed simpelthen blokere en mægler. Dette er næppe tilfældet i KRAS downstream veje, illustreres af den overordentlig lav forekomst af PIK3CA eller BRAF mutationer i pancreas tumorer [10]. Derfor er det blevet en hypotese, at samtidig blokade i to parallelle veje såsom PI3K og MEK væsentlig grad vil øge chancen for succes med at nå en klinisk relevant respons. Faktisk er observeret synergistiske anti-tumor effekt når PI3K /AKT og MEK veje er både hæmmes i prækliniske tumormodeller [11], herunder en KRAS muteret lungekræft model [12].

GDC0941 er en oral agent udviklet til at hæmme alle fire klasse І PI3K isoformer [13]. Det har dosisafhængig anti-tumor aktivitet mod glioblastom og humane ovariecancer xenotransplantater [14]. GDC0941 har vist lovende antitumor-aktivitet i prækliniske indstilling, og det er under afprøvning i tidlige fase kliniske forsøg [14]. AZD6244 er en potent, selektiv sekundær generation MEK1 /2-inhibitor, som inhiberer MAPK /ERK i en ATP-konkurrencedygtig måde [15]. Sammen med andre MEK-inhibitorer, AZD6422 er i øjeblikket i tidlige fase kliniske forsøg [16-18]. Prækliniske evalueringer af at kombinere en PI3K /AKT-inhibitor og en MEK-inhibitor i bugspytkirtelkræft dukker [19], og vores undersøgelse bekræfter, at en synergistisk effekt opstår, når blokere disse to veje. Desuden har vi yderligere illustreret, at fordelen ved samtidig blokade er ikke KRAS genotype begrænset. Derudover vores undersøgelse viser, at oversættelsesprocessen, navnlig aktivering af 4E-bindende protein 1 (4E-BP1) og S6 synes at være forbundet med de bugspytkirtelkræftceller ‘fænotypisk reaktion mod hæmmere.

Materialer og metoder

Cell kultur og inhibitorer

bugspytkirtelkræft cellelinjer, BxPC-3 (KRAS wild type), MIA PaCa-2 (KRAS mutant), PANC-1 (KRAS mutant) og Capan -2 (KRAS mutant) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og dyrket i et vækstmedium af enten DMEM (PANC-1, MIA PaCa-2), RPMI-1640 (BxPC-3) eller McCoys 5A-medium (Capan-2) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 1 mM natriumpyruvat ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. PI3K-inhibitoren GDC0941 og MEK-inhibitor AZD6244 blev indkøbt fra Selleck Chemicals LLC (Houston, TX, USA) og opløst i dimethylsulfoxid. Begge inhibitorer blev opbevaret ved -20 ° C.

Cell Levedygtighed Assay

bugspytkirtelkræftceller linjer blev podet ved en densitet på 3.000 celler per brønd i en 96-brønds mikrotiterplade i vækstmedium og lov til at adhærere natten. GDC0941 eller AZD6244 dosis-respons blev bestemt ved at behandle bugspytkirtelkræftceller linjer med 5 koncentrationer af lægemidler baseret på en 10-fold fortyndingsrække. Cellernes levedygtighed blev vurderet 72 timer senere af Alamar Blå (Invitrogen, NY, USA) (570λ

Ex /580λ

Em) med en fluorescerende mikropladelæser, og udtrykt som en procentdel af narkotikarelaterede behandlede celler i forhold til at styre ( ingen lægemiddelrelaterede) celler. Data blev analyseret ved anvendelse af GraphPad Prism 5 software (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA), og dosisresponskurven blev anvendt til at beregne koncentrationen af ​​lægemiddel resulterende i 50% inhibition af cellelevedygtighed (IC

50) under anvendelse af en fire parametrisk logistisk model. Alle assays blev gentaget fem gange

I kombinationsbehandlinger undersøgelser blev den synergistiske virkning vurderet af kombinationen index (CI) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Chou Talalay hvor synergi er defineret som CI 1, mens antagonisme er CI 1, og et additiv virkning anses som CI = 1 [20]. Cellelinier blev behandlet med GDC0941, AZD6244 eller en kombination af GDC0941 og AZD6244, og antallet af levedygtige celler blev anvendt til at beregne Cl-værdier ved hjælp CalcuSyn software (Biosoft, Cambridge, England).

Apoptose Assay

Ca. 2 × 10

5-celler blev podet i 6-brønds plader i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af GDC0941, AZD6244 eller en kombination af GDC0941 og AZD6244 i 72 timer. Celler blev høstet med 0,25% trypsin, vasket med phosphatbufret saltvand (PBS), og opsamles sammen ved centrifugering. Cellerne blev derefter farvet med Annexin V-FITC og PI-opløsning (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) ifølge producentens instruktioner og blev analyseret med en FAC scan flowcytometer (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) . Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

Western blot assay

Celler blev podet i 6-brønds plader til

in vitro

analyser. Når celler blev 70-80% sammenflydende, blev de inkuberet med GDC0941, AZD6244 eller begge GDC0941 og AZD6244 i 24 timer. Derefter blev cellerne vasket med koldt PBS og lyseret i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1%, SDS, 1 mM EDTA, proteasehæmmere ). Supernatanterne blev opsamlet efter lydbehandling og centrifugering, og lige mængder af proteiner blev elektroforeret gennem 4-12% Bis-Tris Gels og overført til nitrocellulosemembraner (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk efter inkubation natten over med de passende primære antistoffer ved 4 ° C. Alle primære antistoffer blev inkuberet i 5% bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Membranerne blev vasket 3 gange for at fjerne ubundet antistof og derefter inkuberet med et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev behandlet med forøget kemiluminescens reagenser ifølge producentens protokol (GE Healthcare Life Science, PA, USA). Primære antistoffer omfattede anti-phospho-AKT (Ser473), anti-Akt, anti-phospho-ERK (T202 /Y204), anti-ERK, anti-phospho-S6 (S240 /244), anti-S6, anti-phospho- 4E-BP1 (S65) og anti-4E-BP1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). ImageJ (freeware) blev anvendt til at sammenligne tætheden af ​​de bands og afslutte densitometrisk analyse.

In vivo studier

Nude mus, 4 eller 5-uger gamle, blev købt fra den nationale Cancer Institute. De blev akklimatiseret i 1-2 uger, inden de blev udsat for nogen eksperimentelle fremgangsmåder. BxPC-3-celler (1×10

6) blev injiceret subkutant (s.c.) i mus flanker. Tumorvolumener blev målt i to dimensioner (længde og bredde) med passere før behandling og to gange om ugen, når behandlingen blev påbegyndt. Musene blev også vejet på disse tidspunkter, og vægtændringer blev beregnet ved følgende formelsamling: [1- (ny vægt /startvægt)] × 100. Tumor størrelser blev beregnet ved standardformlen af ​​tumorstørrelse = Længde x bredde

2 x 0,5. Mus, der udviklede tumorer nå 100-150 mm

3 i størrelse blev randomiseret i følgende fire grupper med 8 mus i hver gruppe: køretøj, GDC0941, AZD6244, eller kombinationsbehandling. Begge lægemidler blev indgivet en eller to gange dagligt ved oral sondeernæring i et volumen på 10 ml /kg legemsvægt. Lægemidler blev opløst i en bærer på 0,5% (vægt /volumen) methylcellulose /0,2% Tween 20 til administration. PI3K-inhibitoren blev leveret dagligt i en slutkoncentration på 50 mg /kg [14], mens MEK-inhibitor blev indgivet to gange dagligt i en slutkoncentration på 25 mg /kg [15]. Kontroldyr fik et ækvivalent volumen 0,5% methylcellulose /0,2% Tween 20 kun, to gange dagligt ved oral sondeernæring. Varigheden behandling var 18 dage. Hvis musen tumor diameter blev større end 15 mm under behandlingen eller musens vægt faldt med 20% i forhold til sin oprindelige vægt, ville musen blive aflivet ved CO

2 overdosis. Alle undersøgelser blev udført i overensstemmelse med protokollen er godkendt af Washington University Institutional Animal Care Facility (Protokol nummer: 20.100.114).

Statistiske Analyser

Cell levedygtighed data blev repræsenteret som middelværdi ± standard afvigelse (SD). Celleapoptose data og eksperimenter tumorvækst var repræsenteret som middelværdi ± standardfejl på middelværdien (S.E.M.). Kaplan-Meier-kurver blev anvendt til at overleve analyser. Statistiske sammenligninger blev foretaget under anvendelse af ANOVA (enkelt faktor) og t-test (parret to prøver til midler og uparret t-test), som angivet. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Samtidig hæmning af PI3K og MEK har en synergistisk effekt på kræft i bugspytkirtlen cellelinjer vækst

in vitro

Til bestemme den anti-tumor aktivitet PI3K og MEK-inhibitorer alene og i kombination

in vitro

, fire bugspytkirtelkræft cellelinjer blev udvalgt til undersøgelsen. BxPC-3 er en KRAS vildtype pankreatisk cancercellelinie, medens de andre tre cellelinier harbor KRAS mutation. Alle fire cellelinjer er ikke kendt for at bære enten PI3K eller BRAF-mutationer [21]. Den anti-proliferative effekt af PI3K eller MEK-inhibitor alene i BxPC-3, MIA PaCa-2, PANC-1 og Capan-2-celler blev målt ved Alamar Blå. Kun væksten af ​​BxPC-3 og MIA PaCa-2-celler blev påvirket af GDC0941. Koncentrationerne af GDC0941 resulterer i 50% inhibering af cellelevedygtighed (IC

50) efter 72 timers eksponering var 376,4 nM i BxPC-3-celler og 754,6 nM i MIA PaCa-2-celler (figur 1A). AZD6244 undertrykt alene også cellevækst med en IC

50 værdi på 599 nM og 375 nM i BxPC-3 og MIA PaCa-2-celler, (figur 1B). IC

50 blev ikke nået i PANC-1 og Capan-2 cellelinier og som følge heraf blev disse anses for at være resistente cellelinier. Vi gjorde observere en svag stigning i PANC-1 cellevækst med GDC0941at 1 nM, 10 nM, og 100 nM, men ændringer var ikke statistisk signifikant (kontrol vs 1 nM, p = 0,32, kontrol vs 10 nM, p = 0,17, kontrol vs 100 nM , p = 0,22). Desuden har vi sammenlignet kontrol vs 1 nM AZD6244 i PANC-1 og MIA PaCa-2-celler, og ingen signifikante forskelle blev observeret (p = 0,20, p = 0,64, henholdsvis)

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af GDC0941 (A) eller AZD6244 (B) alene i 72 timer. Doser var i området fra 1 nM til 10 uM.

anti-proliferative effekt af at kombinere en PI3K og MEK-inhibitor blev målt i BxPC-3 og MIA Paca-2-celler ved at beregne kombinationen index (CI) ifølge Chou-Talalay-fremgangsmåden (20) under anvendelse af en fast dosis-forhold. Begge GDC0941and AZD6244 blev introduceret til cellekulturer på 0,25 ×, 0,5 ×, 1 ×, 2 × og 4 × deres respektive IC

50’erne i BxPC-3 og MIA PaCa-2-cellelinjer. Cellevækst i begge cellelinier blev markant nedsat efter kombinationsbehandling ved multiple parrede koncentrationer sammenlignet med enten enkelt middel alene. Data blev evalueret for at få CI under det tilsvarende effektive dosis (ED) i BxPC-3 og MIA PaCa-2-cellelinjer (figur 2) ved CalcuSyn software. For BxPC-3 cellelinie følgende Cl-værdier blev opnået: 0,4101 (ED50), 0,0112 (ED75) og 0,0003 (ED90). For MIA PaCa-2-cellelinje de Cl-værdier var 0,02052 (ED50), 0,0295 (ED75) og 0,0440 (ED95). CI Resultaterne antydede, at GDC0941 og AZD6244 arbejdet synergistisk til frembringelse af en antiproliferativ virkning i BxPC-3 og MIA PaCa-2-cellelinjer (figur 2A-B).

BxPC-3 (A) og MIA PaCa-2-celler (B) blev behandlet med GDC0941 alene, AZD6244 alene eller GDC0941-AZD6244 i kombination. Resultater blev analyseret i henhold til Chou-Talalay-metoden [18]. Kombinationen indeks (CI) blev beregnet ved hjælp af CalcuSyn software. PANC-1 (C) og Capan-2-cellelinje (D) blev behandlet med GDC0941 ved 400 nm, AZD6244 ved 200 nM eller kombination. * P-værdi. 0,05 sammenlignet med kontrol eller enkeltstof alene

Interessant, mens GDC0941 eller AZD6244 alene påvirkede ikke PANC-1 og Capan-2 cellevækst, administration af disse to lægemidler i kombination mildt inhiberede cellevækst. Cellevækst blev reduceret til 71,4% og 67,0% i de PANC-1 og Capan-2 cellelinjer, efter administration af lægemidlerne i kombination (p 0,05, kombination sammenlignet med ubehandlede gruppe eller enkelt middel alene) (figur 2C D).

Samtidig PI3K og MEK hæmning inducere apoptose af bugspytkirtelkræftceller linjer

in vitro

for bestemme apoptotiske effekt af den kombinerede terapi, to forskellige koncentrationer af GDC0941 og AZD6244 blev brugt alene og i kombination. Mens apoptose på BxPC-3-celler ved baseline var 17,0%, steg betydeligt til 34,0% og 47,8% efter administration af GDC0941 ved 380 nM og 1,520 nM koncentrationer (p 0,05, GDC0941 alene versus ubehandlede gruppe). AZD6244 alene ved 600 nM og 2400 nM øget apoptose på BxPC-3-celler til 26,5% og 27,2% (p 0,05, AZD6244 alene vs ubehandlede gruppe). En kombination af GDC0941 og AZD6244 resulterede i en meget højere hastighed af apoptose i BxPC-3-celler i sammenligning med kontrolgruppen eller inhibitor alene. Kombinationen af ​​GDC0941 ved 380 nM, og AZD6244 ved 600 nM eller kombinationen af ​​GDC0941 på 1.520 nM og AZD6244 på 2.400 nM øgede BxPC-3-apoptose sats til 63,3% og 82,8% (p 0,05, kombination vs. ubehandlede gruppe eller enkelt middel alene) (figur 3A). Satsen for apoptose ved baseline i MIA PaCa-2-celler var 8,0%, og det steg til 17,4% og 24,7% med GDC0941 indgivet med 400 nM og 1.600 nM koncentrationer (p 0,05, GDC0941 alene vs. ubehandlede gruppe). AZD6244 alene ved 200 nM eller 800 nM øget apoptose sats til 22,7% og 36,9% (p 0,05, AZD6244 alene versus ubehandlede gruppe). Kombinationen af ​​GDC0941 på 400 nM og AZD6244 på 200 nM eller kombinationen af ​​GDC0941 på 1600 nm og AZD6244 800 nM øgede MIA PaCa-2 apoptose sats på 49,5% og 55,6%, henholdsvis, og dette var en statistisk signifikant forskel i forhold med den ubehandlede gruppe eller enkelt middel alene (p 0,05) (figur 3B). For resistente cellelinier PANC-1 og Capan-2, mens hverken middel alene havde en betydelig indvirkning på apoptose, kombinationen af ​​PI3K og MEK-inhibitor resulterede i en apoptose på 31,8% i PANC-1-celler; dette var statistisk signifikant sammenlignet med en 14,0% apoptose sats i disse celler uden behandling eller med en enkelt inhibitor (p 0,05) (figur 3C). Kombination GDC0941 og AZD6244 også signifikant øget apoptose sats i Capan-2 celler til 41,3% mod 12,2% uden behandling eller med enkelt middel alene (p 0,05). (Figur 3D)

Bugspytkirtelkræft celle linjer blev behandlet med GDC0941 alene, AZD6244 alene eller GDC0941-AZD6244 i kombination i 72 timer. Celle apoptose blev påvist ved flowcytometri. A, B: kombinationer vs. ubehandlede grupper (* p-værdier 0,05), kombinationer vs. enkelte midler (* p-værdier 0,05), enkelte agenter vs. ubehandlede grupper (* p-værdier 0,05). C, D: kombinationer vs. ubehandlede grupper (* p-værdi 0,05) og kombinationer vs. enkelte midler (* p-værdi 0,05)

Virkninger af PI3K og MEK hæmninger på cellesignalering.

for at vurdere virkningen af ​​begge lægemidler på nedstrømseffektorer af PI3K og MEK veje, brugte vi Western blot-analyse for at observere total protein-ekspression og fosforylering status. Det totale protein niveauer af ERK, S6 og 4E-BP1 forblev uændret efter behandling med GDC0941 og AZD6244 i hver cellelinier (figur 4). p-ERK, p-S6 og p-4E-BP1 syntes at være undertrykt af GDC0941 og AZD6244 kombinationsbehandling. Men vi observerede ændringer i AKT-udtryk følgende kombination lægemiddelbehandlinger, og densitometrisk analyse blev anvendt til at kvantificere ekspressionsniveauerne. Vi bruges forholdet mellem p-AKT /AKT fremstillet af hver dosis til sammenligning. Efter p-AKT /AKT niveauer af behandlingsgrupperne blev normaliseret til forholdet mellem den ubehandlede gruppe, blev der observeret kombinationsbehandlingen at undertrykke p-AKT niveauer med 90% i BxPC-3 cellelinie med 6% i MiaPaCa-2 cellelinie, med 29% i PANC-1-cellelinien, og med 8% i Capan-2-cellelinien. Kombinationen af ​​begge lægemidler reduceret p-ERK (T202 /Y204), p-AKT (S473), p-S6 (S240 /244) og p-4E-BP1 (S65) udtryk i forhold til baseline i alle testede cellelinier. Mens p-AKT og p-ERK-niveauer differentielt blev udtrykt i de fire cellelinier, vores undersøgelse viste, at de grundlæggende niveauer af p-AKT ikke forudsige respons på PI3K-inhibitoren, heller ikke baseline p-ERK-niveauer forudsige reaktion på MEK inhibitor.

Alle fire bugspytkirtelkræft cellelinjer blev behandlet med den GDC0941-AZD6244 kombination i 24 timer, blev Cellelysater derefter høstet til at detektere p-AKT (S473) /AKT, p-ERK (T202 /Y204) /ERK, p-S6 (S240 /244) /S6 og p-4E-BP1 (S65) /4E-BP1.

for at forstå de fænotypiske forskelle set i MIA PaCa-2 (følsomme til GDC0491 og AZD6244) og PANC-1 (resistent over for GDC0491 og AZD6244) cellelinjer, som begge huser KRAS mutation, vi undersøgte forskellene i deres nedstrømseffektorer efter GDC0941 og AZD6244 administration (figur 5). I begge cellelinier, GDC0941 undertrykt phosphorylering af AKT, AZD6244 faldt p-ERK-niveauer, og kombinationen af ​​de to lægemidler undertrykte både p-AKT og p-ERK-niveauer. GDC0941 og AZD6244 havde en lignende effekt på AKT og ERK i de to cellelinjer. Interessant, effekten fra begge inhibitorer på p-S6 og p-4E-BP1 niveauer var alternativt cellelinje specifik. F.eks GDC0941 og AZD6244 alene og i kombination markant inhiberet p-S6 og p-4E-BP1expression niveauer i MIA PaCa-2-celler, sammenlignet med den minimale suppression observeret i PANC-1-celler (figur 5). Hverken GDC0941 eller AZD6244 alene undertrykt p-S6 og p-4E-BP1 i Panc-1 celler, hvilket tyder på, at begge effektorer kan tjene som biomarkører i forbindelse med behandling svar. Ekspressionsniveauerne af p-S6 og p- 4E-BP1 signifikant undertrykt af kombinationsbehandlingen i MIA PaCa-2-celler, og dette var i overensstemmelse med cellens lines fænotypiske responser mod kombinationsbehandling.

Både MIA PaCa -2 og PANC-1-celler blev behandlet med 400 nm GDC0941, 200 nM AZD6244 eller en kombination ved disse doser i 24 timer. Celleproteiner blev derefter høstet til påvisning p-AKT (S473) /AKT, p-ERK (T202 /Y204) /ERK, p-S6 (S240 /244) /S6 og p-4E-BP1 (S65) /4E-BP -1.

Anti-tumor effekter af PI3K og MEK hæmninger

in vivo.

at påvise effekten af ​​GDC0941 og AZD6244 på tumorvækst

in vivo

anvendte vi GDC0941, AZD6244, og en kombination af GDC0941and AZD6244 til behandling BxPC-3 xenograft-mus i 18 dage. Sammenlignet med kontrolgruppen (køretøj) gruppe, tumor volumen faldt betydeligt i AZD6244 og kombination grupper (p = 0,037 og p = 0,032, henholdsvis), men ikke i GDC0941group sammenlignet med kontrol (figur 6A). Baseret på Kaplan-Meier-kurver (figur 6B), var der en statistisk signifikans forskel i overlevelse blandt de fire grupper (p = 0,005)

A:. 1 × 10

6 BxPC-3 pancreascancer celler blev injiceret sc i den højre flanke af kvindelige nøgne mus. Mus modtog vehikel (0,5% methylcellulose /0.2% Tween-20), 50 mg /kg GDC0941 QD, 25 mg /kg AZD6244 BID, eller 50 mg /kg GDC0941 QD plus 25 mg /kg AZD6244 BID peroralt i 18 dage. Data er præsenteret som gennemsnit ± SE. * P-værdier blev bestemt ved uparret t-test. B:. Kaplan-Meier-overlevelseskurverne for xenografter der modtager køretøj, GDC0941 alene, AZD6244 alene og GDC0941-AZD6244 i kombination

Diskussion

Selvom målrettet terapi er blevet en mainstream tilgang til kræft behandling, har den kliniske udvikling af målrettede midler i bugspytkirtelkræft ikke været en succes. På grund af den høje frekvens af KRAS mutationer i bugspytkirtelkræft har KRAS været direkte målrettet i prækliniske og kliniske forsøg, men resultaterne har været skuffende. I lyset af disse udfordringer, har forskning fokuseret på at målrette KRAS downstream veje, PI3K og MEK. Fordelen ved at blokere en individuel sti er stort set blevet begrænset af tilstedeværelsen af ​​en kompenserende feedback mellem PI3K og MEK. For eksempel inhibering af MEK pathway resulterer i aktivering af PI3K pathway [11], og PI3K-aktivering medierer resistens over for MEK-inhibering [22]. For at omgå dette kompenserende tilbagemeldinger, har samtidig blokade af de to veje blevet testet, og blev opdaget synergi i anti-tumor effekt, der giver begrundelsen for fase I kliniske forsøg. Desuden er der rapporteret tidlige tegn på klinisk fordel i fremskreden kræft ved en retrospektiv analyse af patienter, der får midler, der er målrettet både veje [23].

I modsætning til at arbejde i andre typer af tumorer, prækliniske evalueringer af nedregulering af både veje i bugspytkirtelkræft er begrænset [19,24]. Vores undersøgelse er vigtig i adskillige aspekter. For det første har vi vist, at følsomheden af ​​kræft i bugspytkirtlen cellelinjer mod enten PI3K eller MEK-inhibitorer er ikke KRAS afhængig. Mens forskellige i KRAS-status, BxPC-3 og MIA PaCa-2-celler har vildtype PI3K og PTEN, og begge var følsomme over for begge inhibitorer, hvilket er konsistent med tidligere publicerede rapporter [22,25]. For det andet vores undersøgelse viste, at PI3K og MEK-inhibering enten alene eller i kombination kan inducere apoptose. I fortiden, var lægemidler rettet mod PI3K eller MEK menes at have mere af en cytostatisk effekt, men nylig rapport antyder, at denne virkning er apoptotiske [26] For det tredje har vores undersøgelse vist, synergi i undertrykkelse af cellevækst og induktion af apoptose i to følsomme cellelinier (BxPC-3 og MIA Paca-2) med kombinationen regime. Desuden blev mild inhibering i cellevækst og induktion af apoptose observeres med lægemiddelkombinationen i resistente cellelinier (Panc-1 og Capan-2). Selvom graden af ​​gavn af kombinationsbehandlingen var beskeden til både resistente cellelinier, er yderligere forståelse af denne fordel berettiget til denne ødelæggende sygdom. Vores undersøgelse understøtter en lignende præklinisk studie i bugspytkirtelkræft, der viste, at behandlingen fordel for en MEK-inhibitor blev forstærket af en AKT-inhibitor [24].

Et afgørende element for målrettet terapi udvikling er at bestemme molekylære markører, der forudsiger behandlingen respons. PI3K pathway forandringer, herunder HER2 forstærkning, PI3KCA mutationer eller PTEN tab har vist sig at være forbundet med følsomhed over for GDC0941 i brystkræft cellelinier

in vitro

in vivo

[27]; Det ovennævnte genetiske vekslen er sjældent til stede i pancreas tumorer [21]. Vores undersøgelse tyder på, at downstream p-AKT undertrykt af GDC0941 ikke forudsige celle følsomhed, heller ikke nedreguleret p-ERK forudsige følsomhed for AZD6244. Denne observation er i overensstemmelse med tidligere rapporter [27].

For yderligere at forstå de molekylære begivenheder indtruffet efter samtidig blokade i begge KRAS muterede cellelinjer, vi sammenlignet proteinekspression i PANC-1 (resistent) og MIA PaCa- 2 (følsomme) cellelinier. Disse to cellelinjer er forskellige i deres fænotypiske reaktion på PI3K og ERK-hæmmere, trods husly lignende store genetiske vekslen. Begge cellelinier er rapporteret at indeholde KRAS-mutationer, p53-mutationer, vildtype P16 og vildtype DPC-4 [21]. Mens vi i vores undersøgelse viste, at suppression af p-AKT af PI3K-inhibitoren og p-ERK af MEK-inhibitor blev opnået i begge cellelinier, oplevede PANC-1-celler kun en minimal undertrykkelse af p-S6 og p-4E-BP1 når de behandles med enten PI3K eller MEK-inhibitor alene. Disse resultater tyder på, at PI3K eller MEK-inhibitorer alene er i stand til at undertrykke deres umiddelbare tilsvarende downstream mediatorer (AKT og ERK) i Panc-1-celler, men er ikke i stand til at nedregulere de yderligere nedstrøms mediatorer (p-S6 og p-4E-BP1 ). Begge markører, derfor er tæt forbundet med følsomhed for både PI3K og MEK-inhibitorer. I en kompleks signalering netværk, en targeted middel evne til at inhibere phosphoryleringen processen med dens downstream mål hyppigt ikke udslag i fænotypiske ændringer. For eksempel Serra et al har rapporteret identifikationen af ​​nogle få gener, der kan fremme cellulære overlevelse i forbindelse med PI3K blokade, og blandt de gener, ribosomale S6 kinaser RPS6KA2 (RSK3) og RPS6KA6 (RSK4) bliver yderligere valideret for at bidrage til PI3K modstand

in vitro

in vivo

gennem dæmpning af den apoptotiske proces og opregulering af protein oversættelse [28]. Vores observation genklang med nye beviser for, at downstream cap-afhængige oversættelse kan være en bedre indikator for reaktion på disse målrettede midler [29,30].

4E-BP1 spiller en stor rolle i cap-afhængige oversættelse. Det binder til elF4E-mRNA cap kompleks til at hæmme cap-afhængige oversættelse, og phosphoryleret 4E-BP1 falder derefter ud af oversættelsen komplekse, så initiering af translation kan begynde [31]. mTORC1, en effektor nedstrøms for PI3K pathway, kan phosphorylere 4E-BP1 at indlede oversættelsesprocessen [32]. Den afgørende rolle, 4E-BP1 som et centralt effektor af AKT og ERK signalveje i tumorer er elegant undersøgt af hun et al [29]. Desuden har høje ekspressionsniveauer af 4E-BP1 vist sig at have prognostisk værdi i flere tumortyper [33-37]. Derfor bør yderligere udforskning af målretning 4E-BP1 udforskes i fremtiden for flere tumortyper, herunder og især, kræft i bugspytkirtlen.

Sammenfattende har vi undersøgt gavn for samtidige vej blokade af PI3K og MEK hæmmere alene og i kombination for bugspytkirtelkræft. Synergi i faldende cellevækst blev observeret og virkningerne var ikke KRAS afhængige. Vedvarende phosphorylering af S6 og 4E-BP1 syntes at være associeret med resistens over for de PI3K og MEK-inhibitorer. Fremtidige undersøgelser af alternative mekanismer 4E-BP1 phosphorylering og målretning af 4E-BP1 i bugspytkirtelkræft er berettiget.