PLoS ONE: ErbB2, EphrinB1, Src kinase og PTPN13 Signaling Complex Regulerer MAP kinase signalering i Human Cancers

Abstrakt

I ikke-kræftceller findes phosphorylerede proteiner forbigående, bliver de-phosphoryleret af specifikke fosfataser, der afslutter opformering af signalveje. I cancere, kompromitteret phosphataseaktivitet og /eller ekspression forekomme og bidrage til tumor-fænotype. Den ikke-receptor phosphatase, PTPN13, er for nylig blevet døbt en formodet tumor suppressor. Det reduceret ekspression i brystcancer korrelerer med nedsat samlet overlevelse. Her viser vi, at PTPN13 regulerer en ny signaleringskompleks i brystkræft bestående af ErbB2, Src, og EphrinB1. Så vidt vi ved, er dette signalering kompleks er ikke tidligere beskrevet. Co-immunopræcipitationsforsøg og lokalisering undersøgelser viser, at EphrinB1, en PTPN13 substrat, interagerer med ErbB2. Desuden den onkogene V660E ErbB2 mutation øger denne interaktion, mens Src kinase medierer EphrinB1 phosphorylering og efterfølgende MAP Kinase signalering. Nedsat PTPN13 funktion yderligere forbedrer signalering. Foreningen af ​​onkogene kinaser (ErbB2, Src), en signalering transmembrane ligand (EphrinB1) og en fosfatase tumor suppressor (PTPN13) antyder, at EphrinB1 kan være en relevant terapeutisk mål i brystkræft huser ErbB2-aktiverende mutationer og faldt PTPN13 udtryk.

Henvisning: Vermeer PD, Bell M, Lee K, Vermeer DW, WIEKING BG, Bilal E, et al. (2012) ErbB2, EphrinB1, Src kinase og PTPN13 Signaling Complex Regulerer MAP kinase signalering i Human kræftformer. PLoS ONE 7 (1): e30447. doi: 10,1371 /journal.pone.0030447

Redaktør: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Canada

Modtaget: 4. august, 2011; Accepteret: 16. december 2011; Udgivet: januar 18, 2012 |

Copyright: © 2012 Vermeer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af 7R01DE018386-03 fra National Institutes of Health /National Institute of Dental og kraniofacial Forskning og staten South Dakota Translational Cancer sub-award 3SB161. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ErbB2 (HER2) amplifikation /overekspression forekommer i 20-30% af brystkræft resulterer i aggressiv tumor adfærd og dårlig prognose [1], [2]. ErbB2 aktivering via hetero-dimerisering med andre familiemedlemmer eller homo-dimerisering med sig selv (når det udtrykkes i høje niveauer) initierer intracellulære signaler, der kulminerer i transkription af mange gener, der regulerer proliferation, overlevelse, differentiering, invasion og metastase. På denne måde, ErbB2 spiller en central rolle i orkestrere en aggressiv brystkræft fænotype [3]. Fremme af målrettede behandlinger såsom trastuzumab, et humaniseret anti-ErbB2-antistoffet, forbedrer overlevelsen af ​​Her2 brystkræftpatienter [4], [5]. Men de fleste patienter ikke reagerer på trastuzumab (62-74%), husly

de novo

modstand; dem, der reagerer har stort udbytte med en øget sandsynlighed for at overleve over fem år eller resterende tumor free. Desværre, 25% af disse oprindeligt responderende patienter senere mislykkes terapi [6] – [9]. Ligesom

de novo

modstand, veje fører til erhvervet trastuzumab modstand er fortsat uklare [10], [11]. Selv om der er gjort betydelige fremskridt i forståelsen af ​​rollen som ErbB2 i brystkræft initiering og progression, den overvældende modstand mod trastuzumab terapi tyder på, at yderligere signalveje findes, der omgå ErbB2 antistof-medieret blokade. Karakterisere disse veje, og, endnu vigtigere, de proteiner, der indleder dem, vil definere nye mål for terapeutisk intervention, der kan re-bevidstgøre Her2 patienter til trastuzumab og forbedre overlevelsen.

Udover forstærkning /over-udtryk, polymorfier i ErbB2 ved kodon 655 (inden det transmembrane domæne) er forbundet med øget udvikling af brystkræft i nogle populationer, hvilket antyder, at ændringer i ErbB2-kodende sekvens også kan have funktionelle konsekvenser i forbindelse med cancer [12] – [14]. ErbB2-kodende sekvenser kan påvirke associationer til partner-proteiner og efterfølgende ændre ErbB2-medieret intracellulær signalering. Således ligesom trastuzumab modstand, identificere disse veje vil være afgørende for at definere behandlinger, der blokerer eller omgå dem, forbedre overlevelsen.

Mens dominerende pro-onkogene funktioner som dem der er beskrevet for ErbB2 kinase i brystkræft forekommer hyppigt i fast tumorer, ændringer i fosfataser ligeledes forekomme, og fungerer som tumorsuppressorer. For eksempel er den ikke-receptor-protein-tyrosin-phosphatase, PTPN13 (også kendt som FAP1, PTPL1, PTPLE, PTPBAS, PTP1E; PTP-BL er musehomologen) [15] – [17] er for nylig blevet døbt en formodet tumor suppressor. PTPN13 er en multi-modul indeholdende phosphatase. Dens fem PDZ protein-protein interaktion domæner medierer foreninger med mange cellulære proteiner, og som sådan, antyder, at PTPN13 mutationer kan ændre en række forskellige cellefunktioner [18], [19]. PTPN13 mutationer har faktisk blevet identificeret i kolorektal [16], hoved og hals [20] og leverkræft [17], [21]. Vigtigere, faldt PTPN13 ekspression i brystcancer korrelerer med nedsat samlet overlevelse [22]. Desuden har vi tidligere fundet, at faldet PTPN13 udtryk synergistisk med en aktiveret ErbB2 transmembrane mutation (mNeuNT) forbedring tumorvækst og invasion

in vivo

[23]. Mens i mennesker amplifikation /overekspression af ErbB2 er onkogen, i dyr aktiverende transmembrane ErbB2 mutationer er nødvendige for tumorvækst. Således er vores

in vivo

musestudier kræve brug af mNeuNT, et konstitutivt aktiv transmembran ErbB2 mutation. konstateringen af, at menneskelige ErbB2 polymorfier kan påvirke forekomsten af ​​brystkræft tyder dog på, at studiet af transmembrane aktivere ErbB2 mutationer hos dyr (i mangel af amplifikation /overekspression) kan vise sig gavnlig i forbindelse med sygdom hos mennesker. Mens en undersøgelse af Zhu

et al.

Antyder, at PTPN13 regulerer ErbB2 funktion direkte ved de-phosphorylering ErbB2 signaldomæne [24], har vi ikke fundet, at i vores system tyder på, at PTPN13 og aktiveret ErbB2 alene kan ikke konto vedrørende forstærket nedstrøms signalering, tumorvækst, og invasion tydeligt i vores publicerede undersøgelser [23]. Vi hypotese derfor, at yderligere modifikatorer fungere i PTPN13 /ErbB2 synergi observeret. Vi begrundede endvidere, at en PTPN13 phosphatasesubstrat med signalering kapacitet kan være en sådan kandidat molekyle. Derfor har vi analyseret EphrinB1 [25].

EphrinB1 tilhører en familie af ligander, der binder og aktiverer Eph receptortyrosinkinaser. Ephrin ligander er unikke, bindende og aktivering signalering fra deres beslægtede receptorer, og selv at blive fosforyleret og indlede deres egen signalering kaskader. Dette Ephrin specifik egenskab kaldes “omvendt” signalering. “Reverse” signalering følgende Eph-receptor engagement udgør den konventionelle signalvej. Men Ephriner er promiskuøse i deres sammenslutninger og signalering opstår følgende ikke-Eph-receptor interaktioner [26], [27]. Denne type af Ephrin signalering er ikke-konventionelle.

Da EphrinB1 er en phosphatasesubstrat af PTPN13, nedsat PTPN13 udtryk eller funktionelle PTPN13 mutationer (som begge optræder i solide tumorer) sandsynligvis resultere i øget EphrinB1 phosphorylering og efterfølgende signalering. I forbindelse med brystkræft, hvor faldet PTPN13 udtryk korrelerer med dårlig overlevelse, definere veje aktiveret i fravær af PTPN13 kan identificere kritiske mål for terapeutisk intervention og forbedre overlevelsen. Således har vi en hypotese, at synergien mellem faldet PTPN13 og øget ErbB2 aktivering, der driver tumorvækst og invasion er medieret via EphrinB1 og endvidere, at EphrinB1-medieret signalering er forbedret i brystkræft med kompromitteret PTPN13 udtryk. Her beskriver vi en hidtil ukendt forbindelse mellem ErbB2 og EphrinB1. Angivelse af en aktiveret ErbB2 mutant eller overekspression af vildtype ErbB2 (som i Her2 brystkræft), sammen med nedsat PTPN13 udtryk eller funktion, forbedrer ikke kun kompleksdannelse men også fører til EphrinB1 phosphorylering og tilhørende nedstrøms signalering. I denne rapport, vi karakterisere dette kompleks, de signaler medieret fra den, og dens relevans for brystkræft. Desuden viser vi, at dette kompleks findes i andre epitelceller og foreslå, at signalering fra komplekset spiller en funktionel rolle i andre solide tumorer som godt.

Resultater

PTPN13 Tab forekommer i epitelial kræft

reduceret PTPN13 udtryk korrelerer med nedsat samlet overlevelse i brystkræft [22]. Vi spekulerede på, om denne sammenhæng eksisterede på tværs af alle typer af brystkræft eller hvis det var specifikke for en bestemt undertype. Således har vi analyseret en genekspression vifte fra 200 tidlige stadie brystkræft og 7 normale bryst prøver til PTPN13 med særlig vægt på undertype specificitet. Mens Her2, Luminalt A, Luminalt B brystcancere og normale bryst prøver udtrykker relativt høje niveauer af PTPN13, basal-lignende (BL) tumorer udtrykker signifikant lavere niveauer af PTPN13 mRNA (figur 1A, p = 0,00044 for basal vs. normal). Sammenligninger af de andre undertyper med normal bryst var ikke signifikant. Men mens PTPN13 mRNA-niveauer i Her2, Luminal A og Luminal B brystkræft er ikke anderledes end normalt bryst, dataene ikke udelukke muligheden for, at PTPN13 funktionelle mutationer forekommer i disse undertyper, der kan resultere i en fænotype svarende til den, der findes i dens fravær.

(A) Relativ PTPN13 mRNA ekspressionen af ​​PTPN13 i molekylært karakteriserede brysttumorer. Basal-lignende (BL) brystkræft PTPN13 ekspression er nedsat i forhold til normalt bryst (p = 0,00044 for basal vs. normal). (B) Western blot-analyse af brystcancercellelinier. MDA-MB231, MDA-MB468, HCC1143, HCC1954 er brystcancercellelinier med BL brystkræft egenskaber. The BT474 cellelinien har Her2 /ErbB2-overudtrykkende brystcancer egenskaber. MCF7 og T47D er brystcancercellelinier med luminale karakteristika. HEK293-celler som overudtrykker PTPN13 tjente som en positiv kontrol. (C) BL brystcancercellelinier, MDA-MB231 og MDA-MB468, der udtrykker lave eller høje PTPN13 henholdsvis blev analyseret ved western blot. (D) HEK293-celler stabilt bankede-down for EphrinB1 (sh EphrinB1) eller kontrol blev analyseret ved western blot. (E) MDA-MB468-celler blev transient transficeret med en shRNA plasmid målretning PTPN13 (shPTPN13) eller en ikke-silencing shRNA konstruktion (Non-nedregulering) og analyseret ved Western blot for de angivne proteiner. (F) HaCaT-celler, en human keratinocytcellelinje, og UM-SCC84-celler, en HPV-negativ hoved og hals pladecellekarcinom cellelinie, stabilt bankede-down for PTPN13 (sh PTPN13) eller styreledninger blev analyseret ved western blot. (G) HaCaT celler, der stabilt bankede-down for PTPN13 (sh PTPN13) eller over-udtrykkende HPV16 E6 protein (PHV16 E6) eller kontrol blev analyseret ved western blot for phosphoryleret EphrinB1, phosphoryleret ERK1 /2-, total ERK1 /2-, og GAPDH.

Vi undersøgte også PTPN13 proteinekspression i sub-type defineret brystkræft cellelinier [28]. Mens PTPN13 ekspression varierede blandt cellelinjer, tre ud af fire af de BL-cellelinier testede udviste næsten fraværende PTPN13 protein (figur 1B). BL tumorer omfatter en heterogen gruppe af cancere, men generelt er aggressive tumorer med en dårlig prognose [29]. Således er vores resultater er uændret i forhold til Revillion

et al

korrelerende faldt PTPN13 udtryk og fattige samlet overlevelse [22]. Disse data understøtter den hypotese, at tab af PTPN13 ekspressionsvektorer virkninger tumor fænotype og antyder, at PTPN13 spiller en rolle i reguleringen af ​​epitelproliferation, migration og /eller invasion i BL brystkræft.

PTPN13 tab stigninger phosphoryleret EphrinB1 og ERK1 /2-

PTPN13 fem PDZ domæner mægle foreninger med mange proteiner, herunder EphrinB1 [19]. Efter binding PTPN13 de-phosphorylerer EphrinB1, standse revers signalering [18], [19]. For at teste effekten af ​​faldet /tabt PTPN13 om EphrinB1 fosforylering undersøgte vi to BL brystcancercellelinier: MDA-MB231, udtrykker næsten målbart PTPN13 protein, og MDA-MB468, der udtrykker endogene PTPN13 protein (figur 1B). Som forventet lav PTPN13 udtryk (MDA-MB231) korrelerer med øget EphrinB1phosphorylation mens endogen PTPN13 udtryk (MDA-MB468) korrelerer med lav phospho-EphrinB1 (figur 1C). Disse data er i overensstemmelse med EphrinB1 være en PTPN13 phosphatasesubstrat og at nedsat PTPN13 udtryk i BL brystkræft cellelinier øger fosforylering af EphrinB1.

Da EphrinB1 evne til at signalere, vi yderligere spurgt, om phosphoryleret EphrinB1 korreleret med forøget nedstrøms signalering. Molekylær analyse af BL brystcarcinomer viser, at mange genprodukter i BL klyngen er forbundet med MEK /Erk-aktivering, således vi valgte at analysere phosphorylering status Erk1 /2 i disse BL-cellelinier [30] – [33]. Vi fandt at nedsat /fraværende PTPN13 ekspression (MDA-MB231) korrelerer med forøget phosphorylering af ERK1 /2-(Figur 1C); mens endogen PTPN13 ekspression (MDA-MB468) korrelerer med nedsat ERK1 /2-phosphorylering. Disse data antyder, at EphrinB1 aktivering (phosphorylering) signaler via MAP Kinase pathway. For at teste dette, har vi stabilt bankede-down EphrinB1 i HEK293-celler, der er valgt på grund af deres lette transfektion i forhold til brystcancercellelinier. Knock-down af EphrinB1 resultater i fremtrædende dæmpning af fosforyleret Erk1 /2 (Figur 1D) i overensstemmelse med EphrinB1-medieret Erk1 /2-aktivering. Tilsammen data tyder på, at fraværet af PTPN13 resulterer i forbedret EphrinB1 aktivering og samtidig Erk1 /2 phosphorylering.

Som en yderligere test, endogene PTPN13 blev forbigående bankede ned i MDA-MB468-celler (shRNA-medieret , shPTPN13). Som forudsagt, PTPN13 knock-down øget phosphorylering af EphrinB1 overensstemmelse med PTPN13 regulering af EphrinB1 phosphorylering (fig 1E) [25]. Endvidere steg EphrinB1 forbundet med ErbB2 i lysater fra shPTPN13 celler antyder, at phosphorylerede EphrinB1 associerede lettere med ErbB2 i sammenligning med ikke-phosphoryleret EphrinB1. Overraskende PTPN13 knock-down påvirkede ikke ERK1 /2-phosphorylering, hvilket antyder, at enten EphrinB1 ikke signalerer via MAP Kinase pathway i MDA-MB468-celler eller at dens signalering er moduleret i disse celler via yderligere (som endnu udefinerede) komponenter.

Tidligere forsøg fra vores laboratorium til over-express PTPN13 har tabt sagen som dens forøgede ekspression resulterer i celledød, hvilket begrænser vores evne til at analysere dens downstream effekter [34]. Derfor kunne vi ikke teste effekten af ​​overekspression PTPN13 i MDA-MB231-celler, som mangler endogen udtryk. Men i betragtning af dets virkninger på EphrinB1 phosphorylering i brystcancerceller, vi spekuleret på, at en reduktion i PTPN13 ekspression eller funktion kan være et fælles og, endnu vigtigere, en central ændring i andre epiteliale cancere. For at teste dette koncept, vi bankede-down PTPN13 i en human keratinocytcellelinje (HaCaT celler) og analyseret sin indflydelse på signalering. Nedsat PTPN13 udtryk faktisk forbedret EphrinB1 og Erk1 /2 phosphorylering (figur 1F, HaCaT). Tilsvarende knock-down af PTPN13 i hoved og hals pladecellekarcinom cellelinie, UM-SCC84, resulterede i øget EphrinB1 og ERK1 /2-phosphorylering (fig 1F, UM-SCC84). Vigtigere, tidligere undersøgelser fokuseret på humant papillomvirus (HPV) associeret hoved og hals kræft viser, at HPV 16 E6 oncoproteinet binder og mål PTPN13 for nedbrydning [34], [35]. Således HPV positive celler fungerede som en ekstra test af funktionen af ​​PTPN13 i cellulær signalering i forbindelse med

viralt

medieret kræft. Således analyseret vi tidligere karakteriseret mus tonsil epitelceller stabilt udtryk HPV 16 E6 eller dem stabilt bankede-down for PTPN13 [34], [35]. Faktisk HPV16 E6 udtryk forbedret EphrinB1 og Erk1 /2 fosforylering, konsistent med nedsat /tabt PTPN13 udtryk. Desuden knock-down af PTPN13 i mus tonsil epitelceller viste en lignende effekt (shPTPN13, figur 1G). Taget sammen antyder disse data at nedsat PTPN13 ekspression forøger EphrinB1 og ERK1 /2-phosphorylering i epitelceller. Konstateringen af, at høj risiko HPV-virus har udviklet en mekanisme til at fjerne cellulære PTPN13, understreger endvidere betydningen af ​​PTPN13 myndighedsopgaverne kritiske i cellulære signalveje. Data tyder på, at PTPN13 udtryk kan være interessant at vurdere i mange, hvis ikke alle, solide tumorer.

ErbB2 co-immunopræcipitater og co-lokaliserer med EphrinB1

Ovenstående data tyder på, at faldet /tabt PTPN13 øger EphrinB1 aktivering, som derefter kan modulere nedstrøms phosphorylering af Erk1 /2. Vores laboratorium har tidligere vist, at faldet /tabt PTPN13 synergistisk med ErbB2, forstærkende MAP kinase signalering [23]. Således har vi spekulerede på, om EphrinB1 phosphorylering og den resulterende ERK1 /2-signalering forekommer i en ErbB2-medieret, ikke-konventionel måde. Derfor spurgte vi, om EphrinB1 associerede med ErbB2 og afsluttede co-udfældning og co-lokalisering undersøgelser. Vi fandt, at EphrinB1 og ErbB2 co-bundfald (figur 2A) fra lysater afledt af brystcancercellelinier samt HaCaT celler. Interessant, knock-down af PTPN13 i HaCaT celler (shPTPN13) forbedrede pull-down af EphrinB1 med ErbB2, igen antyder, at phosphorylerede EphrinB1 associates lettere med ErbB2 end den ikke-phosphorylerede tilstand. Desuden i alle tilfælde flere former for EphrinB1 blev trukket ned med ErbB2 (figur 2A pile). Vi spekulere disse bånd repræsenterer forskellige phosphorylerede former, som foreslået af Xu

et al

. I deres undersøgelse, mutation af EphrinB1 tyrosinrester resulterer i den specifikke tab af EphrinB1 bands tyder på, at båndene tydeligt ved western blot repræsenterer phosphorylerede former af proteinet [36]. Alternativt kan båndene repræsentere uglycosylerede eller forringet EphrinB1 som foreslået af Makarov

et al

[37]. Mens identiteten af ​​disse bånd er udefineret i denne undersøgelse, forskellige EphrinB1 antistoffer verificerede dets co-immunopræcipitation med ErbB2 (data ikke vist). Vigtigere er det, medens varierende mængder af ErbB2 blev trukket ned i alle testede lysater (i overensstemmelse med deres forskellige ErbB2-ekspression) blev en lignende mængde EphrinB1 forbundet med det. Disse data antyder, at der er en grænse for mængden af ​​EphrinB1 som associerer med ErbB2; mere ErbB2 udtryk ikke resulterer i øget EphrinB1 forening. Disse data tyder på, at interaktionen stramt reguleret.

(A) Western blot-analyse af en human keratinocytcellelinje, HaCaT celler (kontrol såvel som celler bankede-down for PTPN13) og brystcancercellelinier ( MCF7, BT474, HCC1953) immunudfældet (IP) for ErbB2 og immunoblottedes (IB) for EphrinB1. Membrane blev re-undersøgt for ErbB2. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (B)

En ansigt

konfokale billeder af HaCaT celler immunolocalizing overflade EphrinB (grøn) og total ErbB2 (rød). Kerner modfarvet med DAPI (blå). Scale bar 20 pm. (C) Western blot analyse af brystkræft cellelinier: T47D, BT474 og MCF7. (D) HEK293-celler transient transficeret med enten vildtype PTPN13 eller C /S PTPN13 mutant analyseret ved western blot. (E) HEK293-celler transient transficeret med enten eGFP alene, eller en kombination af EphrinB1, ErbB2 (vildtype eller mNeuNT), og PTPN13 (vildtype eller C /S mutant) og analyseret ved western blot. (F)

En face

konfokale billeder af celler transficeret i E behandles til immunlokalisering af fosforyleret EphrinB (grøn) og ErbB2 (rød). Kerner modfarvet med DAPI (blå). Scale bar 20 pm.

Co-immunfarvning af endogen ErbB2 og endogene, overflade EphrinB i HaCaT celler viser, at ErbB2 og EphrinB co-lokaliserer i celle-celle kryds (figur 2B). Surface EphrinB blev lokaliseret på ikke-fikserede, unpermeabilized celler under anvendelse EphB1-Fc. EphB1-Fc er en kimære, der består af den ekstracellulære region af EphB1 receptoren (en beslægtet EphrinB receptor) fusioneret til humant IgG

1. Således EphB1-Fc binder til overflade udtrykte EphrinB ligander. Disse interaktioner er derefter detekteret under anvendelse et anti-humant IgG-FITC og celler analyseret ved konfokal mikroskopi. Medens overfladefarvning er ikke specifik for EphrinB1alone, men det betyder, at EphrinB proteiner co-lokalisere med ErbB2. Sammen med immunudfældningsundersøgelser data antyder disse data, at EphrinB1 forbinder med ErbB2

For at vurdere betydningen af ​​ErbB2 /EphrinB1 interaktion i brystkræft, vi yderligere analyseret: BT474, en Her2 (ErbB2) cellelinje;. T47D, en luminal cellelinie med høj ErbB2 udtryk; MCF7, anden luminal cellelinje med lav ErbB2-ekspression (figur 1B). Interessant, både T47D og MCF7-celler udtrykker næsten upåviselig PTPN13, mens BT474 celler udtrykker endogene PTPN13 (figur 1B). Immunopræcipitation for ErbB2 efterfulgt af western blot-analyse for EphrinB1 demonstrerer forbedret EphrinB1 co-IP i T47D-celler, som korrelerede med højere niveauer af phosphoryleret EphrinB1. Dette fund er i overensstemmelse med vores tidligere data tyder på, at phosphorylerede EphrinB1 associerede lettere med ErbB2. Desuden T47D-celler demonstrerer robust phosphorylering af ERK1 /2-, som var udetekterbar i BT474 og MCF7-celler (figur 2C). Tilsammen tyder disse data, at i brystcancercellelinier med lav /fraværende PTPN13 udtryk, og høj ErbB2 udtryk, er EphrinB1 fosforylering forhøjet som er dens forening med ErbB2 og korrelerer med forbedret Erk1 /2 phosphorylering. De data antyder endvidere, at manglende virkning på Erk1 /2 fosforylering i shPTPN13 MDA-MB468-celler (Figur 1E) kan skyldes utilstrækkelig ErbB2-ekspression og /eller kompleksdannelse med EphrinB1.

mNeuNT øger kompleksdannelse og signalering

Da ErbB2 er en tyrosinkinase og EphrinB1 fosforylering indleder omvendt signalering, vi spekulerede på, om ErbB2 phosphorylerer EphrinB1. I betragtning dens virkninger på EphrinB1 fosforylering, vi spekuleret på, at PTPN13 regulerer denne aktivering. For at undersøge dette, blev begge vildtype PTPN13 (PTPN13

wt) samt en phosphatase null mutant (PTPN13

C /S) testet. Derudover vores tidligere resultater viser, at et konstitutivt aktiv ErbB2 transmembrane mutant (V660E, herefter benævnt mNeuNT) synergistisk med tab af PTPN13 og øger MAP-kinase signalering og invasive vækst hvorimod vildtype (endogene) ErbB2 ikke [23]. Derfor blev mNeuNT og vildtype ErbB2 (wt ErbB2) også testet. På grund af deres lave endogen udtryk for PTPN13, nem transfektion og robust udtryk for transficeret PTPN13 blev HEK293 celler anvendes til disse undersøgelser (figur 2D). I disse eksperimenter HEK293-celler blev transient transficeret med ErbB2 (enten vildtype eller mNeuNT), vildtype EphrinB1 og PTPN13 (enten vildtype eller C /S mutant) og analyseret ved western blot.

Kontrol lysater (eGFP) viser, at EphrinB1 co-immunpræcipitater med ErbB2 men at EphrinB1 er ikke phosphoryleret og Erk1 /2 ikke aktiveret (bane 1, figur 2E). Ekspression af hverken vildtype (bane 2, fig 2E) eller C /S PTPN13 (bane 4, fig 2E) ændrer disse parametre i nærvær af overudtrykt wt ErbB2 og EphrinB1. I modsætning hertil udtryk for mNeuNT med EphrinB1 øger ikke kun den mængde EphrinB1 associere med det, men også fører til EphrinB1 og Erk1 /2 phosphorylering (bane 3 og 5, figur 2E). HEK293-celler udtrykker lidt endogene ErbB2 (data ikke vist); desuden er anti-ErbB2-antistoffet anvendes til immunpræcipitation genkender både vildtype ErbB2 og mNeuNT. Således, mens co-IP undersøgelser ikke kan skelne mellem EphrinB1 forbundet med endogen ErbB2 eller mNeuNT, data støtter stærkt en forening mNeuNT. Mens vi tidligere har vist, at mNeuNT ekspression alene øger ERK1 /2-phosphorylering [23], vores fund, at ekspression af PTPN13

C /S er ikke stand til at reducere EphrinB1 og ERK1 /2-phosphoryaltion, antyder, at EphrinB1-medieret revers signalering også bidrager til ERK1 /2-phosphorylering (fig 2E, bane 5, pile). Desuden ekspressionen af ​​vild PTPN13 (bane 3, figur 2E), men ikke C /S PTPN13 mutant (bane 5, fig 2F), nedsætter mængden af ​​phosphoryleret EphrinB1 og P-Erk -1/2, også i overensstemmelse med EphrinB1 phosphorylering påvirker MAP-kinase signalering.

Disse biokemiske data blev bekræftet ved immunlokalisering undersøgelser af fosforyleret EphrinB (figur 2F, grøn) og ErbB2 (figur 2F, rød). Kun ekspression af mNeuNT resulterer i phosphoryleret EphrinB stede på celleoverfladen (fig 2F, paneler 3 og 4, gul angiver ekspression co-lokalisering af phosphoryleret EphrinB og ErbB2). Desuden er det kun vildtype PTPN13 nedsætter mængden af ​​phosphoryleret EphrinB ved celleoverfladen (fig 2F, sammenlign gul og grøn mellem panelerne 3 og 4). Tilsammen tyder disse data, at en) mNeuNT forbinder med EphrinB1 og denne forening er forbedret med EphrinB1 fosforylering, 2) phosphoryleret EphrinB1 korrelerer med phosphorylering af Erk1 /2 og 3) at PTPN13 de-phosphorylerer EphrinB1 i denne sammenhæng.

mNeuNT co-immunopræcipitater med og aktiverer Src

ErbB2-medieret signalering sker direkte via sin kinase aktivitet eller ved sin rekruttering af Src i en signalering kompleks [38]. Endvidere vil der efter binding til dets kognate Eph-receptor, Src phosphorylerer EphrinB1 [25]. Da både vildtype ErbB2 og mNeuNT indeholder en vildtype tyrosinkinasedomæne, vi hypotese, at den forbedrede EphrinB1 phosphorylering og MAP-kinase signalering tydeligt i forbindelse med nedsat /tabt PTPN13, involverer Src. Således har vi først satte sig for at afgøre, om Src forbinder med ErbB2, som foreslået af litteraturen [38]. HEK293-celler blev transient transficeret med vildtype ErbB2 eller mNeuNT og testet. Mens co-IP aktiveret Src med vildtype ErbB2 var næsten ikke målbart, aktiveret Src forbundet med mNeuNT (figur 3A). Den anti-aktiverede Src antistoffet genkender Src tyrosin 416 (pSrc-Y416), når phosphoryleret, et websted, der fremmer Src aktivitet [39], [40]. Disse data antyder, at mNeuNT associerer med aktiveret Src.

(A) HEK293-celler transient transficeret med enten vildtype ErbB2 eller mNeuNT og analyseret ved western blot. (B) HEK293-celler transient transficeret med en kombination af EphrinB1, mNeuNT, og PTPN13 (vildtype eller C /S mutant) blev behandlet med eller uden PP2 og analyseret ved western blot. (C) Utransfekterede HEK293 celler behandlet med stigende doser af saracatinib og analyseret af Western blot for ekspression af endogene aktiveret Src, total Src, phosphoryleret EphrinB1 og immunpræcipiteret EphrinB1.

Src medierer EphrinB1 fosforylering

Både mNeuNT og Src er kinaser, som begge kan phosphorylerer EphrinB1. Desuden mNeuNT fortrinsvis associerer med aktiveret Src (figur 3A). Derfor testede vi, om aktiveret Src (snarere end mNeuNT) medierer EphrinB1 fosforylering. HEK293-celler blev transient transficeret med mNeuNT, EphrinB1 og enten vildtype eller mutant (C /S) PTPN13 og analyseret ved western blot. I overensstemmelse med de ovennævnte data, mNeuNT co-IPS med aktiveret Src og EphrinB1 phosphoryleres (figur 3B, bane 1); PTPN13

C /S øger EphrinB1 phosphorylering (figur 3B, bane 3). For at teste rolle Src i EphrinB1 phosphorylering, blev transficerede celler behandlet med PP2, en potent Src inhibitor. Xu

et al

tidligere påvist, at behandling med en uM PP2 effektivt blokerer Src-medierede EphrinB1 phosphorylering mens behandling med 25 pM PP2 resultater i celle løsrivelse [36]. Således i denne undersøgelse for at sikre en effektiv Src inhibition blev celler behandlet med 10 pM PP2 i kort tid (4 timer). I mNeuNT, EphrinB1 og vildtype PTPN13 transficeret lysater, PP2 behandling faldt mængden af ​​aktiveret Src forbundet med mNeuNT og dæmper EphrinB1 phosphorylering (figur 3B, bane 2). Lysater af mNeuNT, EphrinB1 og PTPN13

C /S transfekterede celler blev ligeledes påvirket af PP2 tyder på, at EphrinB1 fosforylering i mNeuNT, Src, PTPN13 kompleks medieres via Src. Tilsammen tyder disse data, at Src, snarere end mNeuNT, phosphorylerer EphrinB1 og yderligere understøtter den publicerede litteratur og vores egne konklusioner, som PTPN13 er ansvarlig for de-phosphorylerende EphrinB1 i dette kompleks.

PP2 er en Src-familie kinase inhibitor, blokering aktivering af Lck, Fyn, Hck og Src. Desuden eksperimenterne udført under anvendelse PP2 udnyttet HEK293-celler som overudtrykker PTPN13, ErbB2 og EphrinB1. Således mere selektivt at hæmme Src og for at teste sin funktion på fosforylering af endogen EphrinB1, vi analyserede også saracatinib (AZD-0530, i øjeblikket i kliniske forsøg [41] – [44]) på ikke-transficerede celler. HEK293-celler blev behandlet med saracatinib (0, 0,25 uM eller 1,0 uM) og analyseret ved western blot. Saracatinib behandling held hæmmede Src aktivering og en dosis respons var tydeligt. Hertil kommer, ved den højeste dosis, der var et fald i mængden af ​​EphrinB1 fosforylering (figur 3C) i overensstemmelse med en rolle for Src ved mediering EphrinB1 fosforylering.

EphrinB1 immunpræcipitater med ErbB2 på en måde, der ikke kræver den ekstracellulære eller C-terminale PDZ motiv

Vores data tyder på, at regulering af ErbB2 /EphrinB1 komplekset kan mægle signaler vigtige i brystkræft. Eftersom ErbB2 og EphrinB1 interagere, kan rationale design af små molekyleinhibitorer til at blokere deres forening være af terapeutisk værdi. Således blev ErbB2 og EphrinB1 mutanter genereret at definere domæner nødvendige og tilstrækkelige for deres associering.

ErbB2 indeholder to store ekstracellulære domæner, som vi udpegede ligandbindende domæner 1 og 2. ErbB2 ekstracellulære mutanter udgår af enten ligandbindingsdomænet 1 (Δ 1-174 LBD1) eller begge domæner 1 og 2 (Δ 1-487 LBD2) blev genereret. ErbB2 s PDZ bindende domæne blev slettet i en tredje mutant (Δ 1251-1255 PDZBD) (figur 4A). Alle ErbB2 mutanter, herunder fuld længde vildtypeproteinet, var HA mærket ved N-terminalen. Konstruktioner blev transficeret i HEK293 celler og analyseret for tab af co-IP med endogen EphrinB1.