PLoS ONE: ICAM1 er en potentiel Cancer Stem Cell Marker af esophageal planocellulært Carcinoma

Abstrakt

esophageal planocellulært karcinom (ESCC) tegner sig for omkring 90% af kræft i spiserøret diagnosticeret i de asiatiske lande, med forekomsten af stigningen. Cancer stamceller (CSC, også kendt som tumor-initierende celler, TIC) er naturligt resistente over for cytotoksisk kemoterapi og stråling og associerede med dårlig prognose og fiasko terapi. Målretning terapi mod kræft stamceller har vist sig som en potentiel terapeutisk tilgang til at udvikle effektive regimer. Men den passende CSC markør for ESCC til identifikation og målretning er stadig begrænset. I denne undersøgelse screenede vi de hidtil ukendte CSC membran proteinmarkører under anvendelse af to særskilte stemness karakteristika cancercellelinier af en sammenlignende fremgangsmåde. Efter validering af RT-PCR, qPCR og western blot-analyser, intercellulært adhæsionsmolekyle 1 (ICAM1) blev identificeret som et potentielt CSC markør for ESCC. ICAM1 fremmer cancer cellemigration, invasion samt øger mesenkymale markør ekspression og svækkende epitelial markør ekspression. Desuden ICAM1 bidrager til CSC egenskaber, herunder sfære dannelse, lægemiddelresistens, og tumorigenese i mus xenotransplantation model. På baggrund af analysen af ​​ICAM1-regulerede proteiner, vi spekuleret på, at ICAM1 regulerer CSC egenskaber dels gennem en ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1 vej. Desuden observerede vi, at ICAM1 og CD44 kunne have en kompensation effekt på vedligeholdelse af stemness karakteristika ESCC, hvilket tyder på, at kombinationen af ​​multi-targeting behandlinger bør være under alvorligt overveje at anskaffe en mere potent terapeutisk effekt på CSC i ESCC.

Henvisning: Tsai ST, Wang PJ, Liou NJ, Lin PS, Chen CH, Chang WC (2015) ICAM1 er en potentiel Cancer Stem Cell Marker af esophageal pladecellecarcinom. PLoS ONE 10 (11): e0142834. doi: 10,1371 /journal.pone.0142834

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN

Modtaget: September 7, 2015; Accepteret: 27 oktober 2015; Udgivet: November 16, 2015

Copyright: © 2015 Tsai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan Grants NSC102-2320-B-039-050 og mEST 102-2911-i-002- 303. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i spiserøret er den ottende hyppigste årsag til maligniteter over hele verden med sin forekomst i stigning [1]. Den repræsenterer 1% af kræfttilfælde diagnosticeret i USA, med en anslået 17.500 nye tilfælde rapporteret i 2012 [2]. Kræft i spiserøret er patologisk klassificeres i to store undertyper, esophageal adenocarcinom (EAC) og esophageal pladecellecarcinom (ESCC). ESCC tegner sig for omkring 90% af kræft i spiserøret diagnosticeret i de asiatiske lande. Da strategier tidlig påvisning ikke er blevet godt ved klinisk skærm, er disse tumorer ofte diagnosticeres i fremskredne stadier. Når metastase forekommer, kræft dødelighed øger [3]. Den samlede 5-års overlevelsesrate efter kirurgisk resektion er 70% ~ 92% for patienter uden kirtelinvolvering, men kun 18% ~ 47% for patienter med lymfeknudemetastaser [4]. Manglen på grundlæggende viden om stråling og kemoterapi resistens i disse tumorceller har været et stort klinisk barriere for at erhverve et bedre resultat. Den begrænsede forståelse af den molekylære biologi af tumorer har forladt os med empiri i klinikken

Cancer stamcelle. (CSC, også kendt som tumorfremkaldende celle, TIC) er defineret som en delmængde af tumorceller med self -genoptage evne og involverer i kræft initiering og progression. CSC er også meget modstandsdygtig over for stråling og kemoterapi og ansvarlig for cancer tilbagefald efter behandling [5]. Derfor CSC er blevet set som et attraktivt mål for destruktivt eliminere cancerceller. Det er vigtigt at identificere potentielle CSC markører, der kan anvendes til at isolere CSCS og karakterisere deres egenskaber at være terapeutisk målrettet. Selvom CSC er blevet bredt opdaget i faste tumorer, herunder bryst-, tyktarms-, gliom, prostata, lever, og melanom [6-11], og flere markører for deres identifikation er tilgængelige, den molekylære markør for esophageal CSC er meget begrænset.

epithelial-til-mesenkymale overgang (EMT) er en vigtig udviklingsproces under mesoderm dannelse og neuralrøret dannelse, hvor epitelceller erhverve en vandrende mesenkymale fænotype [12]. Processerne tumorinvasion og metastase, har mange fænotypiske ligheder med EMT, herunder tab af celle-celle-adhæsion og en stigning i celle mobilitet. Forbindelsen mellem CSC og EMT blev først etableret i den transformerede brystepiteliet [13], og de eksperimentelle resultater viste, at TGF-induceret EMT var forbundet med købet af brystkræftceller med CD44

+ /CD24

– /lav tumorfremkaldende fænotype, mesenchymale træk, og forøget evne til at danne mammospheres. For nylig erhvervede beviser viste, at CSC spiller en vigtig rolle i metastase af flere typer af karcinom [14,15]. Derfor øge vores generelle forståelse af molekylær biologi CSC vil sandsynligvis afdække rolle CSC i metastaser af kræft.

Flere integrerede analyser, herunder genomforskning, Epigenomics, transcriptomics og proteomics, er blevet rekrutteret til at studere biologi CSC. Blandt dem, proteomics har en unik position på dette område. For eksempel flere store gennembrud i CSC forskning skyldes identifikation af proteiner ved hjælp proteomisk tilgang såsom koloni-stimulerende faktorer [16] og celle-overflade CD molekyler [17]. Desuden er proteomics fremstår som et effektivt redskab til at identificere de signalering komplekser, der styrer CSC differentiering og regulere CSC vedligeholdelse veje [18]. En systematisk proteomisk tilgang til at karakterisere CSC egenskaber vil kaste nyt lys over CSC biologi og fremskynde kliniske applikationer i prognosen, diagnose, og behandling af kræft [19].

Membranproteiner, herunder enzymer, receptorer, ionkanaler, og transportører, spille mange biologiske funktioner. Dysregulering af membranproteiner er blevet forbundet med en række forskellige humane cancere [20]. Derfor har mange membranproteiner blevet karakteriseret som markører til diagnose og terapeutiske mål, omkring 70% af eksisterende farmaceutiske lægemiddelmål er membranprotein [21]. I denne undersøgelse, vi havde til formål at identificere potentielle overflade markører for esophageal CSC ved hjælp af en proteomisk tilgang. ESCC cellelinier med forskellige sfære dannelse evne blev anvendt til screening af egnede overflademarkører. CSC egenskaber potentiel markør blev yderligere karakteriseret ved hjælp af kolonidannelse assay, narkotika resistente assay, og tumorgenicitet assay i immune manglende mus.

Materialer og metoder

cellelinjer og Celledyrkning

i denne undersøgelse blev humane kræft i spiserøret cellelinjer købt fra Bioresource Indsamling og Research center for Fødevarer Industri Forskning og Udvikling Institute (Hsinchu, Taiwan; https://www.bcrc.firdi.org.tw/). Cellelinjer CE81T /VGH (CE81T; BCRC 60.166) og CE146T /VGH (CE146T; BCRC 60.167) blev afledt fra 57-, og 50-årige taiwanske mænd hhv. Begge cellelinier blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles minimale essentielle medium (DMEM; Gibco BRL) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) (Gibco BRL), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Gibco BRL), og holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2/95,% luft atmosfære.

Membranprotein ekstraktion og i-gel fordøjelse

kompartment proteinekstraktion kits CNM (BioChain Institute) blev anvendt til at ekstrahere membranproteiner fra cancerceller. Den CNM Sættet indeholder to kemisk ekstraktion trin: (1) fjernelse af cytoplasmatiske og nukleinsyrer proteiner ved reaktion buffer indeholdende HEPES, MgCl

2, KCI, saccharose, glycerol og natriumorthovanadat; (2) ekstraktion membranproteiner ved NP40 og natriumdeoxycholat. Før massespektrometer analyse blev membranproteiner separeret ved SDS-PAGE og opdelt i ti gel fraktioner, som derefter blev skåret i små gelstykker ( 1 mm

3) og underkastet in-gel fordøjelse, individuelt. Den i-gel fordøjelse procedure omfatter coomassie blå affarvning, reduktion disulfid-obligation, acrylering med iodacetamid, og trypsin fordøjelse, fulgt vores tidligere beskrevne metode [22].

Matrigel invasion og sårheling assay

In vitro

invasion blev analyseret under anvendelse Matrigelcoatede (1 mg /ml; BD Biosciences) PET-membran Transwell indsætte (BD Biosciences) på en 24-brønds plade. Kræftceller (1,5 x 10

5 celler i 200 pi) blev suspenderet i DMEM-medium og tilsat til den øverste halvdel af insertet kammeret. DMEM-medium suppleret med 10% FBS blev tilsat som en kemoattraktant for den nederste halvdel. Efter inkubation ved 37 ° C i 24 timer, blev cancerceller passeret gennem indsatsen fikseret med 3,7% formalin (Sigma-Aldrich) og farvet med 0,1% krystalviolet (Sigma-Aldrich).

I vitro

migration blev analyseret ved hjælp ibidi Kultur-Insert (ibidi). Kræftceller (70 pi, koncentration: 7×10

5 celler /ml) blev føjet til Kultur-Insert godt og dyrket i 24 timer. Efter fjernelse af Kultur-Indsæt, kræftceller blev dyrket i 16 timer. Migrationen afstand af kræftceller blev registreret og målt ved hjælp af software billede J.

Sphere dannelse assay

Sphere dannelse assay blev udført i 6cm kultur fad belagt med 1% agarose. Cancer celler suspenderet i serumfrit medium blev podet ved en densitet 5.000 celler /skål og inkuberet i 7 dage. Antallet af primære sfære blev talt manuelt på 7. dag under mikroskop. For sekundær sfære assay blev kugler fra primær kultur opsamlet og inkuberet med trypsin ved stuetemperatur i 10 min. Trypsinerede celler fra sfærer blev ført gennem 26 G nål tre gange. Dissocierede celler blev individuelt udpladet med 5000 celler /skål densitet i 6cm dyrkningsskål i 7 dage. Antallet af sekundær sfære blev talt på 7. dag.

Tumorigenicitet assay i immun mangelfuld musemodel

Dyret procedure (102-97-N) blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved China Medical University Hospital (Taichung, Taiwan). Forskellige doser af CE146T celler (10

2, 10

3, og 10

4) injiceret subkutant i begge flanker af 5 uger gammel mand NOD-SCID-mus for at generere tumorer. Venstre blev injiceret med kontrolgruppe af cancerceller, og højre flanke blev injiceret med forsøgsgruppe. Tumor størrelse blev målt ved skydelære måling ugentlig når tumorer blev synlige, og varigheden af ​​observation var otte uger. Tumorvolumen blev beregnet med formlen: (længde x bredde

2) /2

Mass Spectrometer analyse

Mass Spectrometer analyse blev udført under anvendelse af lineære ion trap-Fourier-transformation-cyklotron. resonans massespektrometer (LTQ-FTICR MS, Thermo Fisher) udstyret med en nano-elektrosprayionkilde (New mål) og en nano-HPLC-system. Nano-HPLC-adskillelse anvendt en omvendt nano-søjle (75 um ID x 200 mm) pakket med Magic C18AQ harpiks (partikelstørrelse 5 um, porestørrelse 200 A °; Michrom Bioressourcer) og en Agilent 1100 serie binære HPLC-pumpe (Agilent Technologies) . Det analytiske program blev fastsat til en lineær gradient fra 10% til 50% ACN med en 60 min driftslevetid. Undersøgelsen scanning af MS-analyse (

m /z

320-2,000) blev udført i LTQ-FTICR MS med en masse opløsning på 100.000 ved

m /z

400. Top ti mest rigelige formere ladede ioner blev sekventielt isoleret for MS /MS af LTQ. De resulterende data blev anvendt på MaxQuant software [23] til identifikation protein. Præcis etiket-fri kvantificering blev udført ved anvendelse af MaxLFQ programmet ved normalisering og maximum peptid forholdet ekstraktionsmetoder [24]. Tærsklen for betydning for identifikation blev indstillet til

P

0,01.

Statistik

Data blev udtrykt som middelværdi ± SD. Betydningen af ​​forskel blev undersøgt af Students

t

-test (to-halet).

P

0,05 blev anset for at være betydelig.

Resultater

CE146T har mere metastatisk potentiale og stemness egenskaber end CE81T

For at vælge egnet target celle til identifikation af nye CSC markører, vi først karakteriseret de metastatiske egenskaber såsom migration og invasion og sfære dannelse evne esophageal skællede kræftcelle linjer CE81T og CE146T. Resultaterne viste, at CE146T har bemærkelsesværdigt højere migration og invasion evner end CE81T (Fig 1A og 1B), der blev identificeret som en brønd differentieret cancercelle. Derudover CE146T har også højere sfære dannelse evne end CE81T (Fig 1C). Nylige undersøgelser viste, at CSC i ESCC udtrykker høje niveauer af CD44 [25,26]. Derfor brugte vi flowcytometri til at analysere ekspressionen af ​​CD44 i CE146T og CE81T. Resultatet viste, at CE146T har højere niveauer af CD44 end CE81T (Fig 1D). Tilsammen disse data viste, at CE146T har mere CSC befolkning og udviser flere CSC egenskaber end CE81T, hvilket indebærer, at vi er i stand til at identificere CSC markører ved at sammenligne de proteomiske ændringer i CE146T og CE81T.

(A) Sår healing assay. CE81T og CE146T blev dyrket i ibidi Kultur-Insert godt, og migrationen billeder af cancerceller blev registreret ved 0hr (fjernelse af Kultur-Insert) og 16 timer. Migration afstand blev målt ved hjælp af software billede J. (B) Matrigel invasion assay. Repræsentative fotografier indeholder invaderet annullere celler, som blev farvet med krystalviolet. (C) Sphere dannelse assay. Forskellige størrelser af kugler i CE81T og CE146T blev talt på dag 7. Forsøg blev udført tre gange (gennemsnit ± SD). (D) CD44-ekspression i CE81T og CE146T blev målt ved anvendelse af flowcytometri.

Identifikation af CSC-markører ved hjælp af en komparativ membran proteomisk tilgang

Membranprotein har den fordel i diagnostisk og terapeutisk anvendelse . , Brugte således vi en komparativ membran proteomisk analyse for at identificere de nye CSC markørerne fra CE146T og CE81T. Selvom CE146T og CE81T ikke isogene kan CE146T udtrykker højere niveauer af proteiner forbundet med CSC egenskaber end CE81T baseret på ovennævnte observationer. I MS-analyse blev to tekniske replikater udført for hver prøve. Protein identifikation og etiket-fri kvantificering af masse signaler blev analyseret ved anvendelse af MaxQuant software [23]. I denne analyse blev de samlede 652 membranproteiner identificeret, som omfattede 266 plasma membranproteiner baseret på Gene ontologi definition. Blandt membranproteiner, viste alt 13 proteiner specifikke udtryk eller mere end en 50-dobling af udtryk i CE146T sammenlignet med CE81T (tabel 1).

For at validere MS resultater, vi brugte RT-PCR, kvantitativ PCR (qPCR), og western blot at undersøge gen- og protein ekspressionsniveauer af kandidat-proteiner undtagen to histokompatibilitetsantigener. RT-PCR og qPCR Resultaterne viste, at intercellulære adhæsionsmolekyle 1 (ICAM1) og prominin-2 (PROM2) har højere genekspression i CE146T end i CE81T, hvilket er i overensstemmelse med den proteomik konstatering (Fig 2A og 2B). Western blot viste, at ICAM1 har en høj ekspression i CE146T, men ikke PROM2 (fig 2C). Følgelig vi yderligere evalueret karakter af ICAM1 på CSC egenskaber ESCC.

(A) mRNA niveauer af målproteiner blev analyseret under anvendelse af RT-PCR-assay. GAPDH tjente som kontrol. (B) mRNA niveauer af målproteiner blev analyseret under anvendelse qPCR assay. (C) De protein-niveauer af både PROM2 og ICAM1 blev analyseret ved anvendelse western blot-assay. β-actin tjente som lastning kontrol.

ICAM1 øger metastatiske potentiale af kræftceller

For at vurdere funktioner ICAM1 på CSC ejendomme, vi brugte lentivirusvektoren udtrykker ICAM1-specifikke kort hårnål RNA (shRNA) at vælte ICAM1 udtryk. To slags ICAM1 shRNA transfekteredes i CE146T (mærket som shICAM1 # 1 og shICAM1 # 2), viste både transfekterede celler indlysende knockdown af ICAM1 i Western blot analyse (figur 3A). ICAM1 knockdown påvirkede ikke cellevækst af CE146T (Fig 3B), men det betydeligt reduceret cellemigration og invasion evner CE146T i sårheling og transwell assays (fig 3C og 3D). Desuden to farmakologiske ICAM1 hæmmere, silibinin [27] og 18 beta-glycyrrhetinsyre (18β-GA) [28], vises tilsvarende effekt på at reducere migrationen og invasion evner CE146T (Fig 3C og 3D). Resultaterne viste, at ICAM1 bidrager til CE146T metastatiske egenskaber

in vitro

. Derfor har vi endvidere fundet, om ICAM1 knockdown påvirker ekspressionsniveauerne af EMT markører. Western blot Resultatet viste, at både shRNA og farmakologisk inhibering kunne øge niveauet af epitel markør såsom ZO-1 og dæmpe niveauerne af mesenchymale markører, såsom N-cadherin og fibronectin (figur 3E).

(A) ICAM1 udtryk blev slået ned med to slags shRNA, shRNA # 1 målsekvens er: GCCCGAGCTCAAGTGTCTAAA, og shRNA # 2 target sekvens er: CCTCAGCACGTACCTCTATAA. (B) Cellevækst af CE146T blev analyseret under anvendelse MTT assay. ICAM1 knockdown ikke signifikant indflydelse på væksten af ​​CE146T celler. CE146T-shGFP tjente som kontrol. Virkningerne af ICAM1 knockdown på cellemigration og invasion evner blev analyseret under anvendelse af (C) sårheling og (D) matrigel invasion assays hhv. Begge eksperimenter blev udført i tre eksemplarer (gennemsnit ± SD). (E) Ekspressionen af ​​EMT markører blev bestemt under anvendelse western blot-assay. CE146T blev behandlet med ICAM1 inhibitor silibinin (2 uM) eller 18β-GA (10 uM) for 24 timer. Udtrykkene for epitel markør ZO-1 og mesenchymal markører N-cadherin og fibronectin blev undersøgt under anvendelse af specifikke antistoffer. β-actin tjente som lastning kontrol.

ICAM1 øger sfære dannelse og resistens

CSC har været kendt for at øge evnen af ​​kugle dannelse og udtrykker meget modstandsdygtige over for stråling og kemoterapi. Til karakter funktioner ICAM1 på kugle dannelse, vi sammenlignet evne sfære dannelse mellem shICAM1 # 1 og shICAM1 # 2 og deres kontrolgruppe shGFP af CE146T. Resultatet viste, at ICAM1 knockdown reducerer sfære dannelse evne CE146Y, uanset i sfære antal eller i kugle størrelse (Fig 4A) signifikant. Derudover er det også væsentligt reduceret sekundær sfære dannelsen af ​​CE146T (Fig 4B).

assays af (A) primær sfære dannelse og (B) sekundære sfære dannelse blev udført i CE146T med eller uden ICAM1 knockdown. Sphere antal og størrelse blev observeret og talt af primær på 7. dag kultur. (C) Drug modstand analyse. CE146T-shGFP og ICAM1-shICAM1 # 1 blev behandlet med forskellige doser af cisplatin for 24 timer, og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse MTT assay. Hvert forsøg blev udført tredobbelt (gennemsnit ± SD).

Cisplatin er et almindeligt anvendt cytotoksisk middel i kemoterapi for kræft i spiserøret, medens cisplatin har også en klinisk vigtig radio-sensibiliserende virkning, der gør kombinationsterapi praktisk [29]. For at evaluere funktionen af ​​ICAM1 på cisplatin modstand behandlede vi CE146T med forskellige doser af cisplatin og bestemmes cellelevedygtigheden ved hjælp MTT assay. Resultatet viste, at ICAM1 knockdown reducerer evnen af ​​cisplatin modstand CE146T, og IC50 på CE146T i kontrolgruppen (shGFP) og ICAM1 knockdown gruppe (shICA1 # 1) er 5 uM og 3,5 uM af cisplatin, henholdsvis

( fig 4C).

ICAM1 fremmer tumorigenese i immune defekte mus

at studere funktioner ICAM1 på tumorigenese

in vivo

, vi injiceres subkutant i begge flanker af NOD-SCID mus med 10

2, 10

3, eller 10

4 i CE146T celler. Venstre blev injiceret med kontrolgruppe af CE146T (shGFP), og højre flanke blev injiceret med eksperimentel gruppe CE146T (shICAM1 # 1) (Fig 5A). Resultaterne viste, at selv lave doser af CE146T celler (10

2) uden subpopulation berigelse kan fremkalde tumorigenese i NOD-SCID-mus, hvilket antyder, at CE146T faktisk har høj population af CSC (Fig 5B og 5C). Desuden højere dosis af ICAM1 knockdown CE146T celler (10

4) er nødvendige for at inducere tumordannelse, afslører, at ICAM1 knockdown reducerer

in vivo

tumorigene potentiale, en af ​​de vigtigste egenskaber ved CSC (Fig 5B og 5C).

(A) Forskellige doser af CE146T celler, 1×10

2, 1×10

3, og 1×10

4, blev injiceret subkutant i begge flanker af 5 uger gamle mandlig NOD-SCID mus (

N

= 4). Repræsentative subkutane tumorer afledt af CE146T-shGPF i venstre flanke og CE146T-shICAM1 # 1 i højre flanke. (B) Antallet af tumor dannelse i hver gruppe blev registreret og samlet. (C) Tumorstørrelse blev registreret ugentligt og den gennemsnitlige tumorvolumen i hver gruppe blev afbildet. Observationen blev fortsat i otte uger efter podning.

ICAM1 regulerer esophageal CSC egenskaber dels gennem p53-afhængige vej

For at realisere potentialet mekanisme ICAM1 i regulering af CSC egenskaber, vi udførte en komparativ proteomisk analyse til at undersøge protein skift mellem shGFP gruppe og shICAM1 gruppe af CE146T. Blandt de identificerede liste (S1 Table), bemærkede vi et p53-relateret undergruppe betydeligt ned-udtrykt sammen med ICAM1 knockdown (tabel 2). P53 er et velundersøgt tumorsuppressor i cancer biologi. Nylige undersøgelser i stamceller felt har fremhævet en dyb rolle p53 som barriere for kræft stamceller dannelse [30,31]. Derfor undersøgte vi p53 proteinniveauer af CE146T i shGFP kontrol og under behandlingen af ​​shRNA eller farmakologisk ICAM1 inhibitor tilstand. Western blot viste, at ICAM1 knockdown og farmakologiske inhibitorer er i stand til at øge p53 niveauer af CE146T (Fig 6A), hvilket indebærer, at ICAM1 kan regulere esophageal CSC tegn, i det mindste delvist, ved at reducere p53-niveauer og dens relaterede signalveje. Vi yderligere valideret p53-relaterede undergruppe af proteom konstatering anvendelse af RT-PCR-assay. Resultatet viste, at mRNA-niveauer af hypofyse tumor-transformerende gen 1-protein-interagerende protein (PTTG1IP) og DNA (cytosin-5) -methyltransferase 1 (DNMT1) naturligvis reduceres under ICAM1 knockdown tilstand, hvilket er i overensstemmelse med den proteomik resultat (Fig 6B).

(A) p53 niveauer af CE146T i shGFP kontrol og under shRNA knockdown eller ICAM1 inhibitor betingelser blev analyseret ved anvendelse western blot-assay. Det relative forhold af p53-niveauer blev normaliseret med p-actin niveauer. (B) mRNA niveauer af p53-relaterede proteiner PTTG1IP og DNMT1 blev analyseret under anvendelse af RT-PCR-assay. GAPDH tjente som kontrol.

ICAM1 og CD44 kunne udnytte en kompensationsordning for at opretholde esophageal CSC egenskaber

I xenotransplantation eksperiment ICAM1 knockdown mister sin hæmning strøm på tumorigenese ved høje celletal (10

4) injektion tilstand (fig 5B). Vi spekulerede på, om cross regulering findes i molekyler, der påvirker CSC egenskaber, fx ICAM1 og CD44. For at bevise dette spekulation, vi gensidigt bankede ned ICAM1 og CD44 og bestemt deres ICAM1 og CD44-ekspression ved hjælp western blot. Resultatet viste, at ICAM1 knockdown anvendelse af både shRNA og farmakologisk inhibering effektivt reducerer ICAM1 ekspression og samtidig øger CD44-ekspression i en omvendt korrelation måde (Fig 7A). Desuden CD44 knockdown er også i stand til at øge ICAM1 ved omvendt korrelation på en lignende måde (Fig 7B). Dette fund indikerede en potentiel mekanisme, kræftceller kunne bruge en kompensationsordning til at opretholde deres CSC egenskaber.

ICAM1 og CD44-ekspression blev analyseret ved hjælp af Western blot analyse. (A) Både shRNA og farmakologisk hæmning reducere ICAM1 udtryk og samtidig øge CD44-ekspression. (B) CD44 knockdown fører til stigning ICAM1-niveauer i et compensative måde. CD44-ekspression blev slået ned med tre slags shRNA, shRNA # 1 målsekvens er: CGCTATGTCCAGAAAGGAGAA, shRNA # 2 target sekvens er: ATGGACTCCAGTCATAGTATA, og shRNA # 3 target sekvens er: GGACCAATTACCATAACTATT. β-actin tjente som lastning kontrol.

Diskussion

intercellulært adhæsionsmolekyle 1 (ICAM1, CD54) er en 90 kDa glykosyleret transmembrane protein immunglobulinsuperfamilien. ICAM1 spiller en vigtig rolle i immunologiske synapse formation, T-celle-aktivering, leukocyttrafik og talrige cellulære immunresponser [32]. Tidligere undersøgelser observeret, at ICAM1 stærkt udtrykker i forskellige mesenkymale stamceller herunder knoglemarv, placenta, fedtvæv, periodontal ligament, og Whartons jelly [33-36]. For nylig, ICAM1 blev identificeret til at fungere som en markør af hepatocellulær karcinom stamceller [37]. I denne undersøgelse blev ICAM1 identificeret at udtrykke i højere stemness egenskaber af esophageal kræft CE146T celler ved hjælp af en komparativ proteomisk tilgang. Vores undersøgelse viste tilstedeværelsen af ​​ICAM1 bidrager til cancercelle sfære dannelse, lægemiddelresistens, og tumorigenese i muse xenotransplantation model, hvilket indikerer, at ICAM1 kan anvendes som en potentiel CSC markør for ESCC og derfor tjene som et terapeutisk mål for udviklingen af ​​lægemidler og udvikling.

Systematisk meta-analyse påpegede positivt udtryk for p53 repræsenterer en gunstig prognostisk funktion og er konsekvent forbundet med den samlede overlevelse ESCC [38]. Vores undersøgelse observeret, at ekspressionen af ​​ICAM1 omvendt korrelerer med p53-niveauer, hvilket antyder, at høj ekspression af ICAM1 kunne føre til kræft malignitet. Desuden sammenligning med proteom ændring af CE146T med og uden ICAM1 knockdown identificerede vi en undergruppe af proteiner relateret til ekspressionen og funktioner af p53. I overensstemmelse med den proteomisk fund, både PTTG1IP og DNMT1 sænke deres mRNA niveauer sammen med ICAM1 knockdown. PTTG1IP kan fremme tumorvækst og invasion evne, og dets høje ekspression er uafhængigt associeret med dårlig prognose og lavere sygdomsspecifik overlevelse [39]. En nylig undersøgelse viste, at PTTG1IP er stand til at mindske p53 stabilitet ved at øge ubiquitinering, som afhænger af E3-ligaseaktivitet af Mdm2 [40]. Dette resultat giver en forklaring på vores undersøgelse, at ICAM1 knockdown sænker PTTG1IP niveauer fører til stabilisering p53, og derved øge p53 niveauer. DNMT1 er det vigtigste enzym involveret i etableringen af ​​genomiske methylering mønstre. DNMT1 overekspression blev identificeret i forskellige kræftformer, og det kan resultere i epigenetisk ændring af flere tumorsuppressorgener og i sidste ende føre til tumorigenese og dårlig prognose [41-46]. Desuden blev DNMT1 overekspression påvist at være forbundet med tab af repression af p53 i cellulær og kliniske niveau [46]. Sammenfattende vores observation og lignende data tyder på en potentiel mekanisme, ICAM1 kan regulere CSC egenskaber ved en ICAM1-PTTG1IP-p53-DNMT1 vej. er dog fortsat den foreslåede vej, der skal bevises af detaljerede eksperimenter.

signalvej krydstale, fx mTOR /S6K1 og Hedgehog veje [47] eller EGFR og VEGF veje [48], er godt anerkendt for at give komplekst samspil og omfattende kommunikation som reaktion på cellulær stimulation, og føre til synergistiske eller antagonistiske virkninger og til sidst ønskelige biologiske resultater [49]. Uanset om cancer stamceller bruge en tilsvarende mekanisme, molekylær krydstale, at fastholde deres CSC egenskaber forbliver undvigende. I aktuelle undersøgelse, observerede vi en kompensation fænomen mellem ICAM1 og CD44-ekspressionsniveauer, som dog også rejser en række kritiske spørgsmål. Gør ICAM1 og CD44 deler fælles signalering netværk til at opretholde tumor stemness? Hvad er det støkiometriske forhold mellem ICAM1 og CD44 i at kontrollere CSC befolkning og egenskaber? Omfattende undersøgelse vil være nyttige i at afsløre de underliggende mekanismer, der er involveret i vedligeholdelse af ICAM1 og CD44 i CSC i ESCC. Baseret på en sådan kompensationsordning, vores undersøgelse tyder kombinationen af ​​flere målretning strategier bør være under overvejelse for at erhverve en mere potent terapeutisk effekt på CSC i ESCC.

Støtte Information

S1 Table.

doi: 10,1371 /journal.pone.0142834.s001

(PDF)

Tak

Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan Grants NSC102-2320- B-039-050 og mEST 102-2911-I-002-303.