PLoS ONE: Afdækning af Profil af Somatic mtDNA mutationer i kinesisk tarmkræft Patienter

abstrakt

I det seneste årti har en høj forekomst af somatiske mitokondrie-DNA (mtDNA) mutationer blevet observeret, hovedsagelig baseret på en brøkdel af molekylet, i forskellige ondartede væv; alligevel blev nogle af dem forespurgt på grund af problemer i datakvaliteten. Det er klart, uden en samlet forståelse af mtDNA mutations profil i kræft væv af en specifik patient, er det usandsynligt at oplyse ægte forhold mellem somatiske mtDNA mutationer og tumorigenese. For at nå dette mål, den mest enkle måde er at direkte sammenligne hele mtDNA genomet variation blandt tre væv (nemlig kræft væv, para-kræft væv, og fjernt normale væv) fra den samme patient. I betragtning af, at de fleste af de tidligere undersøgelser af den rolle, mtDNA i colorektal tumor fokuserede udelukkende på D-loop eller delvis segment af molekylet, i den aktuelle undersøgelse, vi har samlet tre væv (kræft, para-cancerøse og normale væv) henholdsvis rekrutteret fra 20 patienter med colorectal tumor og fuldstændigt sekventeret det mitokondrielle genom hvert væv. Vores resultater viser en relativt lavere forekomst af somatiske mutationer i disse patienter; Interessant nok alle somatiske mutationer er i heteroplasmic status. Overraskende er de observerede somatiske mutationer ikke begrænset til kræft væv, for para-cancer væv og fjerne normale væv også havnen somatiske mtDNA mutationer med en lavere frekvens end kræft væv, men højere end hos den almindelige befolkning. Vores resultater antyder, at somatiske mtDNA mutationer i cancervæv ikke kunne simpelthen forklares som en konsekvens af tumorigenese; i mellemtiden, kan de somatiske mtDNA mutationer i normale væv afspejler en ændret fysiologisk miljø hos cancerpatienter

Henvisning:. Wang C-Y, Li H, Hao X-D, Liu J, Wang J-X, Wang W-Z, et al. (2011) At afdække Profil af Somatic mtDNA mutationer i kinesisk tyktarmskræft patienter. PLoS ONE 6 (6): e21613. doi: 10,1371 /journal.pone.0021613

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: 15. marts 2011; Accepteret: 3 juni 2011; Udgivet: 28 juni 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Videnskab og Teknologi Komité Yunnan-provinsen (2007C103M), og National Natural Science Foundation of China. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i det seneste årti har den rolle, mitokondrie-DNA (mtDNA) mutation i tumorigenese fået megen opmærksomhed. En høj forekomst af somatiske mtDNA mutationer, mest i homoplastic, er blevet identificeret i næsten alle typer af cancervæv [1], [2]. Ikke desto mindre, forholdet mellem somatiske mtDNA mutationer og tumorigenese er blevet genstand for heftig debat. Nogle undersøgelser antydet, at mtDNA somatiske mutationer sandsynligvis resultere fra de forhøjede reaktive oxygenarter (ROS) i tumorcelle [3], [4], [5], fordi de fleste af disse mutationer er T til C og G til en basis overgange [ ,,,0],1], [2], svarende til mutationen mønster af oxidativ henfald på DNA [6], [7]. Det blev også foreslået, at nogle ændringer i mtDNA kunne deaktivere funktionen af ​​mitokondrie respiratoriske kæde og dermed bidrage til tumor procession [8], [9], [10], [11]. For eksempel en nylig undersøgelse antydede, at mtDNA mutationer som producerer manglen i respiratorisk kompleks I-aktivitet kunne bidrage til tumorudvikling ved at styrke metastatiske potentiale af tumorceller [12]. I modsætning hertil nogle undersøgelser antydet, at somatisk mutation i tumorvæv simpelthen kunne opstå ved en tilfældighed i tumor progenitorceller uden nogen fysiologisk fordel eller tumorigene krav [13], [14]. Faktisk Vega og kolleger fandt, at en masse af mtDNA mutationer fundet i tumor faktisk var de fælles polymorfier eller mutationsmønstre hotspots fremherskende i humane generelle populationer, hvilket forfatterne til at foreslå, at disse somatiske mutationer er mere tilbøjelige til at være neutral [15]. Ligeledes blev de funktionelle roller nogle af de identificerede somatiske mtDNA mutationer forespørges skyldes i høj grad problemerne i kvalitet oplysninger [16], [17], [18]. Naturligvis er der behov for yderligere bevis for at belyse den nøjagtige rolle, som somatiske mtDNA mutationer har spil i tumorigenese.

I den foreliggende undersøgelse, udførte vi hele mitochondriegenom screening for somatisk mutation i parrede ondartede og ikke-kræft væv fra 20 patienter med kolorektal cancer. Ved at bruge de samme kvalitetskontrol som vedtaget i vores tidligere undersøgelser i fuldstændig mtDNA sekventering [19], [20], [21], [22], vi ønsker at få en dybere indsigt i profilen af ​​de mtDNA somatiske mutationer i kolorektal kræft. Den direkte sammenligning af hele mtDNA sekvenser af de primære kræft, matchede para-kræft normale og fjerne normale væv fra den samme patient, ledsaget af strenge data-kvalitetskontrol, er vedtaget for at udlevere en detaljeret profil af mtDNA somatiske mutationer i både normal og tumorvæv i den samme patient. Vores resultater viste, at de observerede somatiske mutationer i vores prøver er langt mindre hyppigt end de tidligere undersøgelser. Overraskende, alle de observerede somatiske mutationer er i heteroplasmic tilstand, en observation helt forskellig fra de tidligere undersøgelser.

Resultat

I alt 59 komplette mitokondrie genom sekvenser af tre parrede væv fra 20 kolorektal cancer patienter blev opnået i denne undersøgelse, og alle de sekvenser er blevet deponeret i GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/) med accessionsnumre GU392048-GU392106. Alle mtDNA variable steder af hvert væv er vist på en skematisk træ (figur 1), som kunne give en direkte sammenligning af hele mtDNA genomet variation blandt tre væv fra den samme patient og således muliggøre indkredsning somatisk mutation (er) i en patient bekvemt. Som vist i figur 1, seks ud af 20 patienter udført mtDNA somatiske mutationer i deres cancervæv, indtager en meget mindre andel (6/20, 30%) end mange tidligere rapporter. For eksempel, Tan et al. fundet 27 somatiske mutationer i 14/19 (74%) bryst patienter [23]; Zhu et al. fandt 45 somatiske mutationer ved 35 nukleotidposition i 14/15 (93%) brystkræftpatienter [24]; i Polyak et al. (1998), 7/10 (70%) kolorektal tumor sager blev demonstreret til at bære en til tre mutationer.

haplogroup navne er indsat langs grenene, der bestemmer placeringen af ​​de tilsvarende forfædres haplotyper. Varianter (rekonstruerede mest parsimoniously) om uafbrudt grene er opført vilkårligt i stigende rækkefølge. Suffikser “A, C og T” angiver transversioner, “ins” indikerer en nukleotid indsættelse; “C /T, A /C, og A /G” tyder heteroplasmic mutationer, “d” angiver en sletning. Tilbagevendende varianter er understreget. Længde variation af C-tarmkanalen omkring positionerne 310 og 16189 er ikke angivet i figuren. Suffikser “C, CP, og CN” i prøvenavne indikerer “kræft væv, para-kræft væv og normale væv” hhv.

I alt er der 18 somatiske mutationer blev påvist i 59 vævsprøver under undersøgelsen (figur 1 og tabel S1), og alle de somatiske mutationer forekommer kun på de terminale grene af fylogenetiske træ, og ingen haplotype-shift blev observeret. Med undtagelse af RNA-kodende gener (herunder Srna og tRNA), er disse somatisk mutation sites spredt over hele mtDNA-genomet, som synes helt forskellig fra mutationen spektrum observeret hos patienter med mitokondriesygdomme [25], [26]. Konkret syv mutationer finde i D-loop-regionen, mens de resterende 11 lokalisere i protein-kodende regioner. Blandt de 11 kodning-region somatiske mutationer, kun to (dvs. G4532A og A9275G) er synonyme overgange, der forekommer på to ustabile steder; mens resten ni mutationer alle er ikke-synonyme substitutioner, finde på positionerne 6718, 14288, 15332, 15447 og 15276, hvoraf de fleste er evolutionært højt konserverede efter sammenlignet med de mitochondriale genomer fra 13 forskellige hvirveldyr arter (tabel S1). Ved yderligere at evaluere bevarelsen af ​​disse fem mutationsmønstre sites blandt i alt udgivet 3.635 komplette mitokondrie genom sekvenser fra generelle befolkningsgrupper, afslørede vores resultater, at alle de fem steder er højt konserveret blandt de generelle befolkningsgrupper samt (tabel S1). Overraskende, på trods af den høje bevarelse af site 6718, heteroplasmic variation 6718A /G viser i både kræft og para-cancer normale væv fra patient 1, øge muligheden, at para-cancer normalt væv sandsynligvis er blevet invaderet af cancerceller . Faktisk iagttages et lignende mønster i Patient 3, hvor dens cancer og para-cancervæv deler samme heteroplasmic variation 16365C /T. Denne observation, igen, understreger især nødvendigheden af ​​optagelsen af ​​den fjerne normalt væv til analyse.

Interessant nok som vist i figur 1, de der belyses mtDNA somatiske mutationer er ikke blot anvendes i tumorvæv, for vi gjorde har observeret nogle somatiske mutationer i de normale væv i patienter 1, 3, 8, 14, og 20. Konkret overgang 14288 synes at være et tilbagevendende mutation websted, fordi det vises i tre patienter, der tilhører forskellige haplogruppe. Denne ikke-synonym mutation viser kun i normale væv af patienterne. Den 14288 webstedet selv er ikke bevaret på tværs af forskellige arter, men synes at være ganske konserveret blandt befolkningsgrupper; om denne mutation har funktionelle effekt er ukendt.

I Patient 14, side 16093 i kræft væv er homoplastic C, mens der i para-kræft normalt og fjern normalt væv dette site skifter til at være heteroplasmic som C /T. Dette mønster blev bekræftet af DHPLC analyseresultat: i kræft væv C14 websted 16093 viser en enkelt peak, mens der i para-kræft normale og fjernt normale væv det viser dobbelt top (figur 2). At bemærke er, at webstedet 16093 selv er et hotspot i den almindelige befolkning og mutation på dette site er også blevet fundet i normalt væv af cancerpatienter i andre undersøgelser [27]. Lignende fænomen skete også for Patient 20, hvor kun fjernt normalt væv nærede somatisk mutation (nemlig., A9275G). Disse mtDNA somatiske mutationer kan være irrelevant for tumorigenese overvejer deres udseende i de normale væv.

Direkte sekventering viser, at nukleotid websted 16093 viser en homoplastic C i kræft væv, mens der i para-cancer normalt og fjern normalt væv dette site er i heteroplasmic status T /C. DHPLC assay bekræftede sekventering resultat: i væv C14 vises en enkelt top, mens der i CP14 og CN14 det viser dobbelt top

Diskussion

Hidtil er de fleste af de tidligere undersøgelser om. rolle mtDNA i colorektal tumor fokuserede udelukkende på D-loop eller delvis segment af molekylet [28], [29], [30], [31], har kun få rapporter fokuseret på mutationel profil på sit samlede genom (Polyak et al. 1998). For at få mere indsigt i sammenhængen mellem mtDNA og colorectal tumor, i den aktuelle undersøgelse, vi har rekrutteret tre væv (kræft, para-kræft og normale væv) stikprøven fra 20 patienter med colorectal tumor; ved sekventering af hele genomet mtDNA fra hvert væv og sammenligning af mutationel forskel blandt tre væv fra den samme patient, vores undersøgelse afslørede en relativt lav mutationel frekvens og heteroplasmic status for alle de observerede somatiske mutationer. Disse observationer er helt forskellige fra de tidligere undersøgelser, der understreger kompleksiteten i ætiologien af ​​kolorektal tumor.

Da de fleste af patienterne (12/20) under undersøgelsen ikke harbor nogen mtDNA somatisk mutation i deres ondartede væv, en forklaring kan være, at det er ændringen i nukleare genom, som har bidraget til tumorigenese i prøverne uden at involvere nogen mtDNA ændringer. Hyppigheden af ​​mtDNA somatiske mutationer (6/20, 30%) observeret i vores aktuelle undersøgelse, der er sammenlignelig med vores tidligere resultater på brystcancer (2/10, 20% [22]), men er signifikant lavere (p 0,05 ) end de tidligere bemærkninger, især dem om kolorektal tumor. F.eks Polyak et al. fundet, at 7/10 (70%) colorektale tumor patienter foretaget en til tre mutationer [32]. Det er muligt, at den somatisk mutation frekvens kan variere mellem forskellige etniske befolkningsgrupper eller korrelerer med faser kræft; afprøve denne mulighed ville kræve en systematisk design af undersøgelsen i nær fremtid. Alternativt meget lavere forekomst af somatiske mutationer observeret i vores undersøgelse mest troværdig tilskrives streng kvalitetskontrol, der blev vedtaget under generering og analyse af data. Faktisk, når de potentielle problemer påpeget i de tidligere undersøgelser ved hjælp af en fylogenetisk tilgang [18] blev udelukket, frekvensen af ​​somatiske mutationer ville så falde betydeligt.

Interessant, alle de somatiske mutationer er identificeret her, er i heteroplasmic, der er helt forskellig fra de tidligere observationer. Især nogle af de somatiske heteroplasmic mutation også til stede i de normale væv af kræftpatienter. Tilsvarende Taylor og kolleger fandt også mtDNA somatiske mutationer i det normale væv i colorektale tumorpatienter, og de fleste af disse mutationer var heteroplasmic [33]. For at vurdere, om de heteroplasmic mtDNA somatiske mutationer fundet i de normale væv i kræftpatienter er et normalt fænomen, vi undersøgte hyppigheden af ​​heteroplasmic mtDNA somatiske mutationer i de almindelige befolkningsgrupper (omfavne alt 4738 mtDNA genom sekvenser hentet fra litteraturen). Vores resultat viste, at hyppigheden af ​​individer huser heteroplasmic somatisk mtDNA mutation (er) er mindre end 4%, hvilket tyder på, at heteroplasmy i mtDNA fra den almindelige befolkning er et sjældent fænomen, i hvert fald når de opdages ved direkte DNA-sekventering metode [34], [ ,,,0],35], [36]. Så vi grundigt revideret de tidligere undersøgelser af mtDNA mutation i forskellige tumortyper og fandt, at heteroplasmic somatiske mtDNA mutationer også blev observeret i de normale væv kræftpatienter [9], [22], [27], [33], [37] med en betydelig højere frekvens (38,6%) end i den almindelige befolkning (3,2%; p 0,001) men stadig lavere end i cancervævet (52,9%; p 0,05) (tabel S2). Da hver enkelt er karakteriseret ved en blanding af beslægtede mitokondrielle haplotyper, og udbredt heteroplasmy i mtDNAs af forskellige normale humane væv ikke er iagttaget [27], [38], [39], [40]. Det er sandsynligt, at den observerede forskel i frekvenserne af heteroplasmic mutationer mellem normalt væv af tumorpatienter og den almindelige befolkning (almindeligvis vedtage deres perifere blod) er tilskrevet den heteroplasmy mellem forskellige væv. Alternativt kan den øgede heteroplasmic mutationsfrekvens, både kankrøse og matchede normale væv i tumor patienterne i forhold til den almindelige befolkning (tabel S2), kan skyldes en ændret fysiologisk miljø (måske det forhøjede niveau af ROS, eller nogle andre ukendte mutagener). For eksempel, Goodwin et al. (2008) fandt, at både tumor og matchede normale væv fra prostatacancerpatienter udviser signifikant højere ekspression af spermin oxidase [41], som er blevet forbundet med forøget ROS og DNA-beskadigelse [42], [43], versus væv fra prostata sygdomsfri gratis patienter.

i bakspejlet, har tidligere undersøgelser vist, at mtDNA mutation med potentiel funktionelle effekt kunne bidrage til tumor procession [8], [12]. I den foreliggende undersøgelse, de identificerede somatiske mtDNA mutationer i kodende region alle beliggende i evolutionært højt konserverede sites. Det synes derfor muligt, at disse somatiske mutationer, omend alle i heteroplasmic, kunnet spille nogle roller i at påvirke funktionen af ​​respiratoriske kæde og har således nogle biokemiske funktionelle effekt til sin værtscelle. Men i betragtning af, at de fleste af patienterne ikke harbor somatiske mutationer i cancervæv, hvorvidt den funktionelle virkning af disse somatiske mutationer er nødvendige for værtscellen fortsat ukendt. Med hensyn til de somatiske mtDNA mutationer til stede i normale væv, bør de afspejler en ændret mikromiljø for mtDNA. Hvorvidt disse mutationer, plus interaktionen med det ændrede mikromiljø, kunne øge modtageligheden for en celle til tumorigenese er ukendt.

I alt forstå forholdet mellem mtDNA somatiske mutationer og tumorigenese er en udfordrende opgave, fordi strategier, direkte estimering celle skæbner eller opsporing den detaljerede proces med begge begivenheder er stadig upraktisk in vivo. Ved direkte at sammenligne mtDNA genom variation i tre parrede væv fra den samme patient, kunne vores undersøgelse giver en omfattende profil af somatisk mtDNA mutation i tumor patient. En lav frekvens somatisk mtDNA-mutation blev identificeret i de kolorektale patienter og alle mutationerne var heteroplasmic. I mellemtiden kunne nogle somatiske mutationer være til stede i det normale væv, som indikerer, at disse somatiske mutationer, ikke fremgår af tumorigenese, og det kan afspejle en ændret fysiologisk miljø for mtDNA i tumor patient.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

i alt 59 vævsprøver blev indsamlet i denne undersøgelse, herunder de primære kolorektale ondartede væv (C1-C10), svarende para-kræft normale væv (CP1-CP10) og fjern normale væv (CN1-CN10), som er taget fra 20 kinesiske patienter med colorectal cancer under operationen med informeret samtykke. Cancervævet blev bekræftet ved HE-farvede objektglas af den frosne sektion efter operationen, mens para-kræft normalt væv blev opnået fra det normale væv omkring kræft, og den fjerne normalt væv er mindst 5 cm fra kanten af kræftvæv. Alle patienter blev klinisk diagnosticeret med stadium I (T1-T2, N0, M0) kolorektal cancer i henhold til den kliniske standard for den kategori af kræft [44]. Da det store mål med vores undersøgelse er at lokalisere den subtile forskel mellem kræft og de matchede normale væv fra det synspunkt af mitokondrie-genomet, blev derfor taget kun de kolorektale normale væv (herunder para-kræft og fjerne normale væv) fra den samme patient i betragtning. Den para-kræft normale væv var ikke tilgængelig for Patientsikkerhed 19. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen.

DNA-amplifikation og sekventering

Totalt genomisk DNA blev henholdsvis udvundet fra para- cancervæv, primær kræft væv og fjernt normale væv ved anvendelse af standard phenol /chloroform-metoden. Hele mtDNA genomer blev amplificeret og sekventeret som fuldstændigt beskrevet i vores tidligere undersøgelser [19], [20], [21], [22]. Sekventeringsdata blev redigeret og tilpasses ved anvendelse af DNASTAR-software (DNAStar Inc., Madison, Wisc.), Og mutationer blev bedømt i forhold til den reviderede Cambridge referencesekvensen (RCR’er) [45]. Det fylogenetiske status for hver mtDNA blev bestemt ifølge den rekonstruerede East Asian mtDNA fylogeni [20], [46], og deres forhold blev illustreret ved hjælp af en skematisk fylogenetisk træ (figur 1).

Kvalitetskontrol

for at undgå potentielle problemer og fejl observeret i de offentliggjorte sygdom studier mtDNA [18], [47], [48], [49], en streng kvalitetskontrol procedure [19], [20], [21 ] blev anvendt under prøvehåndtering og datagenerering. Hertil kommer, helt at undgå kunstig rekombination udløst af prøve mix-up eller forurening [18], [50], hver vævsprøve blev forstærket og sekventeret individuelt som vi har gjort før [22].

Bestemmelse af heteroplasmy af DHPLC

for den observerede heteroplasmic mutation under direkte DNA-sekventering, vi yderligere bekræftet det ved denaturering hØJTRYKSVÆSKEKROMATOGRAFI (DHPLC) (Figur 2).

Støtte Information

tabel S1.

Somatisk mtDNA mutationer identificeret i 20 kolorektal patienter

doi: 10,1371 /journal.pone.0021613.s001

(DOC)

tabel S2. Sammenligning

af hyppigheden af ​​individer huser heteroplasmic mtDNA mutationer i normale befolkning og hos cancerpatienter

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0021613.s002

(DOC)

Tak

Vi er taknemmelige for alle deltagerne i denne forskning. Vi vil også gerne anerkende Shi-Fang Wu og Chun-Ling Zhu for deres hjælp i eksperimenter. Vi takker de anonyme korrekturlæsere for nyttige kommentarer til den tidligere version af manuskriptet.