PLoS ONE: PSMA-specifikke CAR-Engineered T-celler Udrydde Dissemineret Prostata Cancer i prækliniske modeller

Abstrakt

Immunologi-baserede interventioner er blevet foreslået som en lovende helbredende chance til effektivt at angribe postoperativ minimal residual sygdom og fjerne metastatiske lokaliseringer af prostata tumorer. Vi udviklede et kimært antigen receptor (CAR) konstruere målretning af humane prostataspecifikke membran-antigen (hPSMA), baseret på en ny og specifik mAb høj affinitet. Som en overførselsmetode, anvendte vi sidste generation lentivirusvektorer (LV), der bærer en syntetisk tovejs promotor, der kan robust og koordineret ekspression af CAR-molekyle og et bioluminescerende reportergen for at tillade sporing af transgene T-celler efter

in vivo

adoptiv overførsel. , Demonstrerede vi samlet at CAR-udtrykkende LV effektivt transduceret kortvarig aktiveret PBMC, som igen blev let stimuleret til at producere cytokiner og at udøve en relevant cytotoksisk aktivitet ved indgreb med PSMA

+ prostata tumorceller. Ved

in vivo

transfer i tumor-bærende mus, CAR-transducerede T-celler var i stand til helt at udrydde en formidles neoplasi hos størstedelen af ​​behandlede dyr, og dermed støtte til oversættelse af en sådan tilgang i kliniske omgivelser.

Henvisning: Zuccolotto G, Fracasso G, Merlo A, Montagner IM, Rondina M, Bobisse S, et al. (2014) PSMA-Specific CAR-Engineered T-celler Udrydde dissemineret prostatacancer i prækliniske modeller. PLoS ONE 9 (10): e109427. doi: 10,1371 /journal.pone.0109427

Redaktør: Natalia Lapteva, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Maj 27, 2014; Accepteret: September 1, 2014; Udgivet: 3 oktober 2014

Copyright: © 2014 Zuccolotto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra den italienske sammenslutning for Cancer Research (AIRC, IG-13121, og Special Program Molekylær Clinical Oncology 5 pr mille ID 10016 til AR) og University of Padova, “Progetti Strategici di Ateneo 2011” til AR. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

adoptiv celleterapi med umodificeret og

ex vivo

ekspanderede T-celler har vist sig effektiv mod forskellige tumor enheder, navnlig melanom og EBV-associerede tumorer [1]. I dag kan den genetiske modifikation af T-celler giver nye tumor målretning egenskaber til naturligt forekommende lymfocytter, dermed overvinde afhængigheden af ​​komponenter af det endogene immunsystem.

Mens transduktion med Ag-specifikke TCR kun kan omdirigere T-celle aktivitet baseret på egenskaberne samme anerkendelse, kimært antigen-receptor (CAR) teknologi har potentiale til at udstyre T-celler med de fordelagtige træk ved et antistof, nemlig specificitet, affinitet og muligheden for at målrette ikke-proteinantigener [2]. Desuden i en unik molekyle CAR giver nogle foranstaltninger for at modvirke tumor immune unddragelse strategier: det lindrer T-celle genkendelse og aktivitet af MHC restriktion og udtryk, og kan viderebringe costimulatoriske signaler gennem sine intracellulære domæner

Terapeutisk virkning af CAR. T-celler er allerede blevet rapporteret hos patienter, især mod kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) og akut lymfoblastær leukæmi (ALL) [3] – [6] med meget lovende resultater i form af sygdomsfri overlevelse og komplet hæmatologiske og molekylære reaktioner, selv i forsøgspersoner, der mislykkedes alle tidligere standard behandlinger. Men blodkræftsygdomme, navnlig af B-celle oprindelse, kan betragtes som et ideelt mål for immunterapeutiske tilgange [7]. Faktisk er disse maligne celler naturligt give costimulatoriske receptor ligander og deler de samme fysiologiske rum med adoptivt overførte T-celler. Endelig er eliminering af normale B-celler er forbundet med ikke livstruende bivirkninger, som kan klinisk forvaltes med intravenøs immunglobulin administration.

Omvendt solid tumor behandling stadig en stor udfordring og bør forbedres, både hvad angår kliniske effekt og sikkerhed. Delvise succeser var erfarne mod neuroblastom ved hjælp GD2-specifikke CAR-T-celler uden præ-konditionerende behandling, i det virtuelle fravær af bivirkninger [8], [9]. Derimod blev der ikke klinisk respons optaget med infusion af T-celler omdirigerede mod folat receptor i ovariecancer patienter [10], eller imod carboxy-anhydrase IX (Caïx) i nyre celle karcinom patienter [11], på trods af den relevante “på -target, off-tumor “toksicitet fremgår i sidstnævnte tilfælde. Erfaringer fra disse erfaringer tyder på, at definitionen af ​​målet antigen til sikkerhedsspørgsmål, og de vedvarende og tumor målsøgende kapacitet infused celler er særligt kritiske for en succesfuld behandling.

Vi rettet nogle af disse spørgsmål ved at målrette prostata tumor kræftceller med T-celler modificeret til at udtrykke en CAR specifik for den humane prostata membran-antigen (hPSMA).

prostata tumor udgør en alvorlig klinisk enhed, med anslået 233.000 nye tilfælde og 29,480 dødsfald i USA i 2014 [12], med på nuværende tidspunkt kun palliative behandlinger for hormon refraktær og metastatiske former [13]. For disse patienter har immunterapi vist sig at være en brugbar løsning baseret på vaccination med modificerede hele prostata tumorceller (GVAX [14]) eller PBMC udgør en relevant prostata antigen (Sipuleucel-T [15]). Med hensyn til adoptivforældre celleterapi tilgange, har prækliniske studier rapporteret opmuntrende resultater [13], [16], [17] og klinisk evaluering er under (klinisk forsøg nummer NCT01140373, NCT01929239, NCT00664196, www.clinicaltrials.gov). I dette scenarie kan PSMA repræsentere et egnet target og det er faktisk for tiden udnyttes til både billeddannelse og terapeutiske formål. Især PSMA ekspressionsniveauer differentiere normale og cancerøse prostatavæv, og parallelt Gleason score på prostatacancer [18]. Interessant, PSMA udtryk involverer neovaskulatur af flere tumor enheder, således påtænker en ekstra antiangiogenisk effekt.

Her rapporterer vi udformningen af ​​CAR mod hPSMA baseret på en roman og høj affinitet specifikt mAb [19], og den fænotypiske og funktionel karakterisering af T-krop-hPSMA både

in vitro

og

in vivo

. For transduktion, brugte vi en lentiviral vektor, der bærer en tovejs promotor, som driver den samtidige ekspression af CAR molekyle og et reporter bioluminescerende gen. Dette tillod sporingen af ​​infunderede T-celler og dermed direkte korrelation af det terapeutiske resultat med persistens og målsøgende kapacitet af T-celler. Samlet set CAR-transducerede T-celler ikke blot udøvede en relevant loco-regional terapeutisk aktivitet, men også helt udryddet en dissemineret neoplasi hos størstedelen af ​​behandlede dyr. Disse resultater støtter stærkt oversættelse af en sådan tilgang i kliniske omgivelser

Materialer og metoder

Cellelinjer

Følgende cellelinjer blev anvendt i denne undersøgelse:. LNCaP og PC3 , human prostata carcinoma cellelinier; Jurkat, humant T lymfoblastisk leukæmi og 293 T [20], human embryonisk nyrecellelinie. Den PC3-PIP cellelinie, stabilt udtrykker human PSMA (hPSMA) [21] blev generøst tilvejebragt af Dr. Warren Heston; LNCaP-cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). LNCaP, PC3, PC3-PIP og Jurkat-celler blev opretholdt i RPMI 1640-medium (EuroClone, Milano, Italien), mens DMEM medium (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) blev anvendt til 293 T-celler; begge medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco BRL Paisley, UK), 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin (alle fra Lonza, BioWhittaker, Basel , Schweiz), ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære.

Anti-hPSMA CAR generation

CAR mod hPSMA antigenet indeholder den fuldstændige sekvens af anti- hPSMA scFv afledt af det anti-hPSMA D2B hybridom [19]. Denne sekvens blev klonet ind i det multiple kloningssite (MCS) af pSecTag2A vektoren (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milano, Italien). MCS af pSecTag2A plasmidet ligger mellem to sekvenser: i 5 ‘, den murine Ig kappa let kæde ledersekvensen V-J2-C og i 3’ Myc tag-sekvens. Således blev den førende ScFv-myc sekvens bruges til CAR generation. Leader-ScFv-myc fragment blev amplificeret ved PCR og indsat i pBS SKII konstruktion (Invitrogen). En del af CD28 (baserne 438-759) og CD3ζ intracellulære domæne (227-563 region), begge opnået fra cDNA af EBV-specifikke CD4

+ T-celler [22], blev fusioneret ved PCR og derefter indsat i pBS SKII vektor, nedstrøms Leader-ScFv-myc fragment. Denne vektor blev derefter sekventeret på Centro Ricerca Interdipartimentale Biotecnologie Innovative (CRIBI) of Padua Universitet, Italien. Den anti-hPSMA CAR sekvens blev endelig subklonet ind i pcDNA3.1-vektoren (Invitrogen). For at kontrollere kapaciteten til at drive ekspressionen af ​​CAR-molekylet på membranen, blev denne vektor anvendes til transfektion af 293-T-celler ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.

LV plasmider og lentiviral forberedelse

følgende lentivirale emballage vektorer blev anvendt: pMDLg /pRRE, pRSV-Rev, pMD2.VSVG og pADVantage, alle venligst stillet til rådighed af Dr. L. Naldini (San Raffaele, Milano, Italien). Transfervektoren # 945.pCCL.sin.cPPT.SV40ployA.eGFP.minCMV.hPGK.deltaLNGFR.Wpre er en selvstændig inaktiverende (SIN) HIV-afledte vektor [23], som bærer en minCMVPGK divergerende tovejs promotor driver samtidig ekspression af to gener i antisense-orientering. Transfervektorerne anvendt i denne undersøgelse anti-hPSMA CAR sekvensen (opnået fra PMA-T-organ vektor) under kontrol af den hPGK-promotoren, og EGFP (forstærket grønt fluorescerende protein) eller ildflue-luciferase (Fluc) reportergener under kontrol af minCMV. PMA-T-krop vektor og Fluc sekvens blev syntetiseret ved GeneArt, Life Technologies (Regensburg, Tyskland). Lentiviral produktion i 293 T-celler er tidligere blevet beskrevet [23]. En lentiviral vector koder kun for Fluc [24] blev anvendt til at transducere PC3-PIP-celler.

Western blot-analyse

293 T-celler, transficerede eller transficeret med pcDNA3.1-CAR blev lyseret i buffer indeholdende 50 uM Tris-HCI pH 6,8, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 2% β-mercaptoethanol, 10% glycerol og 0,1-0,05% bromphenolblåt (al fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ) Proteiner blev separeret på 10% SDS-PAGE geler og overført til PVDF-membran (Immobilion-P, Millipore, Billerica, MA, USA). Membranen blev blokeret i 5% skummetmælk (Sigma Aldrich) i TBS og 0,05% Tween 20, efterfulgt af inkubation med det primære antistof (muse-anti-c-myc mAb, 1:1000, Sigma-Aldrich) i en time ved stuetemperatur. Efter tre 10 minutters vask i PBS-Tween, HRP-konjugeret gede-anti-muse-IgG sekundært antistof (fortyndet 1:10000, Amersham, Milano, Italien) tilsat i en time ved stuetemperatur i mælk. Membranen blev udviklet ved hjælp af SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, IL, USA) og visualiseret under anvendelse af kemiluminescens. Signal intensitet blev målt ved hjælp af en Bio-Rad XRS kemiluminescensdetektion systemet (Life Science Group, Milano, Italien).

Jurkat celle transduktion

For at vurdere funktionaliteten af ​​LV vektorer, Jurkat celler blev inkuberet med viral supernatant (hPSMA /eGFP LV bil eller hPSMA /Luciferase LV CAR) i 15 timer i nærværelse af 8 pg /ml protaminsulfat (Sigma-Aldrich). Flowcytometri og Bioluminescens (BLI) analyser blev udført på forskellige tidspunkter efter transduktion at evaluere CAR og eGFP udtryk eller luciferaseaktivitet.

T-organer generation

For at generere T-organer, PBMC fra raske donorer blev aktiveret 48 timer med OKT-3 (50 ng /ml; Ortho Biotech Inc, Raritan, NJ, USA) og humant IL-2 (hIL-2, 300 U /ml; Proleukin, Novartis Pharmaceuticals, Horsham, UK ). T-celler blev derefter inficeret med den virale supernatant i 18 timer ved 37 ° C og 5% CO

2, i nærvær af protaminsulfat (40 ug /ml; Sigma-Aldrich) og hIL-2 (500 U /ml ). Supernatanten blev derefter ændret med frisk komplet medium indeholdende hIL-2 (100 U /ml). Halvfjerds-to timer senere, blev PBMC analyseret for CAR og eGFP udtryk, og for luciferaseaktivitet. PBMC blev omtalt som T-krop-hPSMA /eGFP og T-krop-hPSMA /Fluc når transduceret med hPSMA /eGFP LV CAR eller hPSMA /Luciferase LV CAR hhv. T-organer blev re-stimuleret en gang om ugen med bestrålede (60 Gy) PC3-PIP ved et 10:01 forhold. Komplet medium med frisk IL-2 var genopfyldes to gange om ugen

Antistoffer

CAR-udtrykkende celler blev mærket med anti-c-myc mAb (klon 9E10; Sigma-Aldrich). Eller isotypekontrol (muse IgG1, Southern Biotech, Milano, Italien), efterfulgt af et sekundært antistof (PE-konjugeret gede anti-mus IgG, Southern Biotech). Celleoverflademarkører blev mærket under anvendelse af APC, FITC- eller PE-konjugerede antistoffer mod CD4, CD8, CD57, CD27, CD28, CD62L (BioLegend, San Diego, CA, USA), CCR7 (eBioscience, San Diego, CA, USA) , og de relative isotypekontroller købt fra de samme virksomheder.

cytotoksicitet assay

Den cytotoksiske aktivitet af T-krop-hPSMA /eGFP og T-krop-hPSMA /Fluc blev vurderet i et standard 4 h

51Cr-frigivelsesassay som tidligere rapporteret [25], på forskellige tidspunkter post-transduktion. PC3, PC3-PIP og LNCaP blev anvendt som target-celler.

cytokinfrigivelse analyser

For at evaluere IFN-γ produktion, en ELISA IFN-γ Screening Set (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, 1 x 10

6 T-celler blev podet med 1 × 10

6 målceller (PC3 eller PC3-PIP) i tredobbelte brønde i 96-brønds rundbundede plader. Cytokinsekretion blev målt efter 12 timers inkubation anvendelse af t-organer på forskellige stadier af differentiering. Negative og positive kontroller blev repræsenteret af utransducerede PBMC og T-organer ustimuleret eller behandlet med 40 ng /ml PMA og 4 pg /ml ionomycin (Sigma-Aldrich), hhv. Supernatanterne blev derefter analyseret på en VICTOR X4 (PerkinElmer, Zaventem, Belgien).

Mus og

in vivo

eksperimenter

In vivo

eksperimenter involveret 6 til 8 uger gamle hanner SCID, rag2

– /- /yc

– /- og NOD /SCID-mus (Charles River Laboratories, Calco, Como, Italien), der blev anbragt i SPF-dyr facilitet i Institut for Kirurgi, onkologi og Gastroenterology, Padova Universitet (Italien). Dyrene blev anbragt med en 12-timers lys /mørke cyklus, i temperatur (22 +/- 1 ° C) og fugtighed (55 +/- 5%) kontrolleret rum. Alle mus havde fri adgang til vand og en vedligeholdelse kost. Alle bure opstaldet op til 6 dyr og indeholdt træspåner og et paprør for miljøberigelse. Procedurer, der involverer dyr og deres pleje var i overensstemmelse med institutionelle retningslinier, som opfylder nationale og internationale love og politikker (DL 116/92 og efterfølgende gennemførelsesbestemmelser cirkulærer) og forsøgsprotokollen (n ° 7/2012) blev godkendt af den lokale etiske komité Padova Universitet (CEASA). Under

in vivo

eksperimenter blev dyr i alle forsøgsgrupper undersøgt dagligt for et fald i fysisk aktivitet og andre tegn på sygdom; alvorligt syge dyr (vægttab på over 15%, sløvhed, pjusket hår, lav temperatur) blev aflivet ved kuldioxid overdosis.

Winn analysen.

Winn assay blev udført ved at injicere s.c. SCID-mus med 5 × 10

6 PC3 eller PC3-PIP tumorceller pr dyr, blandet med enten RPMI eller T-krop-hPSMA /eGFP celler (5 x 10

6 /mus; 6 mus /gruppe). Tumorvolumen blev beregnet ifølge følgende ligning: V (mm

3) = (d

2 * D) /2, hvor d (mm) og D (mm) er de mindste og største vinkelrette tumordiametre, henholdsvis som vurderet af caliper måling.

Loco-regional behandling.

for at evaluere det terapeutiske potentiale af loco-regional behandling blev SCID-mus injiceret sc med 5 × 10

6 PC3-PIP celler. Når tumorer bliver håndgribelig omkring fire dage senere blev mus randomiseret til kontrolgruppen (de blev efterladt ubehandlet) eller forsøgsgruppen (de blev injiceret intralæsionalt med CAR-transducerede T-celler ved 72 timer efter transduktion, 6 mus /gruppe). To primære resultater blev analyseret: tumorvækst blev overvåget over tid ved caliper måling og den samlede overlevelse blev registreret

Systemisk behandling af subkutane prostata tumorer

For at vurdere den terapeutiske aktivitet af den systemiske T.. -body indgivelse blev SCID-mus injiceret sc med 5 × 10

6 PC3-PIP-celler og 4 dage senere modtog de i.v. T-krop-hPSMA /Fluc (10 × 10

6 /mus) efter 72 timer eller 5-6 uger efter transduktion (n = 6); ubehandlede dyr tjente som kontrolgruppe (n = 6). T-celle biofordeling blev vurderet ved bioluminescens imaging (BLI) under samme betingelser, bortset fra at musene blev injiceret med både PC3-PIP eller PC3 tumorceller til højre og venstre, hhv.

Dissemineret prostata tumor model.

for at oprette en model af dissemineret prostata tumor, SCID, rag2

– /- /yc

– /- og NOD /SCID-mus blev injiceret iv med forskellige numre (fra 1 x 10

5 til 5 × 10

6) af Fluc-transducerede PC3-PIP-celler (6 mus /gruppe). Tumor indpodning og vækst blev vurderet ved BLI. Desuden tumor-fri SCID, rag2

– /- /yc

– /- og NOD /SCID-mus blev injiceret med 20 × 10

6 T-krop-hPSMA /Fluc, at vurdere deres skæbne ved BLI (6 mus /gruppe).

adoptiv immunterapi eksperimenter.

I adoptiv immunterapi eksperimenter, selvlysende PC3-PIP blev injiceret iv i NOD /SCID og rag2

– /- /yc

– /- mus (1 x 10

5 /mus). Fire dage senere blev dyrene randomiseret til kontrolgruppen (de blev efterladt ubehandlet) eller forsøgsgruppen, hvor de modtog i.v. 20 × 10

6 T-krop-hPSMA /eGFP 3 gange inden for en uge (6 mus /gruppe). Tumorvækst blev monitoreret ugentligt af BLI, og overlevelse blev registreret.

Kvantitativ Bioluminescens

Kvantitativ BLI er en kraftig teknologi, der tillader at opnå flere billeder på langs og på samme tid, for at reducere dyr numre. Bioluminescens billeder blev indsamlet med IVIS Lumina II Imaging System (PerkinElmer). Ti til 15 minutter før billeddannelse blev dyrene bedøvet med isofluran /oxygen og administreret i.p. med 150 mg /kg D-luciferin (PerkinElmer) i PBS. Tre mus blev afbildet samtidigt med eksponeringstider området fra 0,5 til 3 min. En 12 × 12 cm synsfelt og lav, medium eller høj binning niveauer blev anvendt til at maksimere følsomhed og rumlig opløsning. Ventrale billeder blev opnået for hvert dyr og kvantificeret gennem regionen af ​​interesse (ROI). Living Billede Software (PerkinElmer) blev anvendt til at erhverve og kvantificere de bioluminescens imaging datasæt.

cytofluorimetrisk evaluering af hPSMA udtryk i voksende tumorer

Tumor celler suspensioner blev opnået ved enzymatisk behandling med 270 enheder /ml DNase, 35 U /ml hyaluronidase, og 200 U /ml collagenase buffer (alle fra Sigma-Aldrich). Efter en 30-minutters inkubation ved 37 ° C blev cellerne passeret gennem en 70-um cellefilter (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Prøver blev derefter farvet ved 4 ° C med en muse-anti-hPSMA mAb [19] efterfulgt af et PE-konjugeret anti-muse IgG1 sekundært antistof (BioLegend) og analyseret på en FACSCalibur (BD) flow cytometer. Data blev evalueret med FlowJo software (TreeStar Inc., Olten, Schweiz).

Statistisk analyse

Kaplan-Meier produkt-limit metode blev udført for at estimere overlevelseskurverne, og sammenligning af overlevelse mellem grupper blev udført ved anvendelse af log-rank test. Statistiske analyser blev udført med Sigmaplot (version 12.3) statistisk pakke.

Resultater

Konstruktion og udvikling af et effektivt tovejs LV for anti-hPSMA CAR udtryk

En CAR sekvens designet som kodede følgende komponenter i-ramme fra 5 ’til 3′-enderne (fig 1A.): en ledersekvens, det enkeltkædede variable fragment (ScFv) af det nye anti-hPSMA antistof IgGD2B [19], c-myc-tag-sekvens, og CD28 costimulerende molekyle bundet til CD3ζ sekvens. Vi besluttede at udnytte dette nye anti-PSMA scFv (scFvD2B) til opførelse af vores bil, på grund af dens meget tiltalende egenskaber, navnlig det nanomolære affinitet for målet, der ligner den, der fremgår af hele J591 antistof [19] . Desuden er vores scFvD2B viser høj specificitet og identificerer en anden epitop fra det genkendes af J591 antistof, som vurderet af konkurrencemyndighederne forsøg udført med radioaktive immunoligands eller biotin-mærkede antistoffer ([19] og data ikke vist).

(A) Anti-hPSMA CAR map. EF: ekstracellulært domæne; TM: transmembrane domæne; IC: intracellulært domæne. (B) cytofluorimetrisk profil CAR-ekspression i transficerede 293-T-celler. 293 T-celler blev transficeret med pcDNA3.1-vektor bærende CAR sekvens og analyseret ved flowcytometri efter 24 timer (mørk linje). Utransficerede celler (grå plot) tjente som kontrol. (C) CAR ekspression som vurderet ved Western blotting ved 24 timer (linie 1) og 7 dage (linje 2) post 293 T-celle-transfektion. Negative kontroller var alene mediet (linje 3) og ikke-transficerede 293-T-celler (linje 4). Linje 5, molekylvægtsmarkører. (D) Lineær kort over den rekombinante virale vektor indeholdende minCMVPGK tovejs-promotoren (22). Især reportergenet (eGFP eller Luciferase) er under kontrol af minCMV promotoren, mens CAR-genet er under kontrol af hPGK-promotoren. (E) Transduktion af Jurkat celler med LV CAR anti-hPSMA /eGFP. Co-ekspression af c-myc og eGFP i LV-transducerede Jurkat-celler, som bedømt ved flowcytometri. Dot plot rapporterer de begivenheder gated på totale levedygtige celler; mere end 90% af cellerne co-udtrykker både c-myc og eGFP. (F) Transduktion af Jurkat celler med LV CAR anti-hPSMA /luciferase.

Venstre panel

, c-myc udtryk (sort) i jurkatceller ved 72 timer efter transduktion, vurderet ved flowcytometri. Grå plot repræsenterer isotypekontrol.

Right panel

, Vurdering af luciferaseaktiviteten i LV-transducerede Jurkat-celler (2 x 10

5 /brønd) ved BLI.

For at vurdere kapaciteten af ​​konstruktionen til drive ekspressionen af ​​en receptor, der korrekt monteret på cellemembranen, blev anti-hPSMA CAR sekvens klonet i pcDNA3.1-vektoren og det resulterende plasmid blev anvendt til transient transfektion af 293-T-celler. På forskellige tidspunkter derefter blev ekspressionen af ​​det kimære receptor vurderes af cytofluorimetrisk og Western blotting-analyse (fig. 1B og 1C, henholdsvis) ved anvendelse af anti-c-myc mAb. Resultater beskrevet, at bilen var korrekt monteret på membranen og havde den forventede molekylvægt (ca. 60 kDa); CAR-ekspression var allerede påviselige 24 timer efter transfektion til hurtigt forsvinder de næste dage på grund af manglen af ​​en markering trin (fig. 1C). Efterfølgende blev CAR sekvens indsat i en LV bærer en tovejs promotor, der tillod transskription af et reporter gen (eGFP eller Fluc) fra opstrøms minimal promotor minCMV, uden at påvirke nedstrøms udtryk for den anti-hPSMA CAR fra den effektive hPGK promotor (Fig . 1D). For at vurdere funktionalitet lentivirusvektorer blev jurkatceller transduceret med LV CAR hPSMA /eGFP og LV CAR hPSMA /Fluc. CAR viste sig at være højt udtrykt allerede 72 timer efter transduktion, hvilket fremgår af den høje andel af c-myc

+ -celler påvises ved flowcytometri analyse (fig. 1 E og 1 F). Især CAR-udtrykkende celler var mere end 90%, når transduceret med LV CAR hPSMA /eGFP (fig. 1 E), og mere end 60% ved brug af LV CAR hPSMA /Fluc (fig. 1 F,

venstre panel

). Især de tovejs LV vektorer syntes at drive ekspressionen af ​​enten bilen og reportergener med en meget afbalanceret effektivitet, hvilket fremgår af den høje intensitet eGFP signal (fig. 1E) og den relevante Luciferaseaktivitet (fig. 1F,

højre panel

).

Fænotypisk karakterisering af CAR-transducerede T-celle-populationer

til fremstilling af T-celle populationer, der udtrykker anti-hPSMA CAR, en hurtig ekspansion protokollen blev udviklet . Den optimale infektion tid blev oprettet efter 48 timers OKT3 aktivering, da der på dette tidspunkt, vi opnåede den højeste procentdel af CAR-udtrykkende T-celler (Fig. 2A,

venstre panel

), og en mindre differentieret fænotype , som vurderes af høj ekspression af CD27, CD28 og CD62L markører (fig. 2A,

centrale panel

). Efterfølgende udvidelse protokol involveret ugentlig restimulering med PC3-PIP celler, der tillod en hurtig og vedvarende spredning af både T-krop-hPSMA /eGFP og T-krop-hPSMA /Fluc populationer (fig. 2A,

højre panel

).

(A) Opsætning af transduktion protokol og vækst kinetik.

Venstre panel

, blev PBMC aktiveret med OKT3 på tidspunkt 0 og transduceret samtidigt (Td0), eller efter 48-h (Td2) eller 72-H (Td3) timer. Flowcytometrianalyse af c-myc-mærket ekspression blev udført 72 timer efter infektion.

Central panel

rapporterer ekspressionen af ​​CD27, CD28 og CD62L i de tre forskellige betingelser for aktivering /infektion rapporteret i

venstre panel

.

Right panel,

Udvidelse af T-krop-hPSMA /Fluc og T-krop-hPSMA /eGFP transduceret efter 48 timers aktivering som reaktion på ugentlig restimulering med PC3-PIP celler. Utransducerede PBMC blev anvendt som kontrol. (B) Fænotype og CAR udtryk i transducerede T-celler ved stimulering.

Venstre panel

, Ekspression af overflademarkører i T-krop-anti-hPSMA /Fluc på forskellige tidspunkter (3, 11 og 18 dage) efter transduktion, som vurderet ved flowcytometri. Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. Overlappende resultater blev opnået i T-kroppen-anti-hPSMA /eGFP.

Right panel,

procentdel af c-myc

+ celler i LV CAR hPSMA /Fluc og LV CAR hPSMA /eGFP-transducerede T-celle-populationer på forskellige tidspunkter efter transduktion. Figuren viser middelværdien +/- SD af mindst tre uafhængige forsøg. (C) Kinetik af CD4 og CD8 undergrupper i transducerede T-cellepopulationer. Ekspression af CD4 og CD8 markører i c-myc

+ – gated T-krop-hPSMA /eGFP

(venstre panel)

og T-krop-hPSMA /Fluc (

højre panel)

populationer på forskellige tidspunkter efter transduktion, som bedømt ved flowcytometri. Dataene er fra et repræsentativt forsøg ud af tre, der producerede lignende resultater.

For bedre definere staten om differentiering af CAR-transducerede T-lymfocytter i efter infektion periode antigene restimuleringer, udtryk for forskellige overflademarkører (CD62L, CD27, CD28, CCR7, CD57) blev vurderet ved cytofluorimetrisk analyse. Tooghalvfjerds timer efter transduktion, det spirende profil var i det væsentlige af tidlig effektor T-celler, som vist ved den høje ekspression af CD62L, CD27 og CD28, tilstedeværelsen af ​​CCR7-positive celler og den lave ekspression af CD57 (fig. 2B,

venstre panel

). Efter restimuleringer med antigenet, erhvervede T-celler en mellemliggende effektor memory fænotype med progressionen ned-modulering af CD62L, CD28 og CCR7 og en lille stigning i CD57-ekspression (fig. 2B,

venstre panel

). Interessant, mens den efterfølgende møde med antigenet førte til udvidelsen af ​​CAR-udtrykkende befolkning (fig. 2B,

højre panel

), kunne observeres et modsætningsforhold mellem de ekspanderende T-celle delmængder. Faktisk mens CAR ekspression var næsten lig i CD4

+ og CD8

+ T-cellepopulationer umiddelbart efter infektion, den antigenrestimulering bestemmes den gradvise ophobning af CD8

+ T-celle delmængde kun, som næsten fuldstændigt overvandt CD4

+ T celler ved måned én efter transduktion (fig. 2C).

Funktionel karakterisering af CAR-udtrykkende T-celler

CAR udtryk forudsat den transducerede population med evnen til at genkende den hPSMA antigen på overfladen af ​​prostata tumorcellelinjer, og at mediere en høj og specifik cytotoksicitet (fig. 3A). Faktisk både T-kroppen-hPSMA /Fluc og T-krop-hPSMA /eGFP befolkninger lyserede hPSMA-transfekterede PC3 celler, mens besparende antigen-negative modstykke; endnu vigtigere, de var også i stand til at genkende de LNCaP target celler, der naturligt huser den hPSMA antigenet. Cytotoksicitet var allerede tydeligt, omend på et lavt niveau, 3 dage efter transduktion og øges ved maksimale niveauer lige efter en enkelt runde af antigen restimulering, forbliver derefter konstant op til 2 måneder efter infektion. Andre end at udøve en relevant cytotoksisk aktivitet, CAR-transducerede T-celler på forskellige stadier af differentiering også producerede høje niveauer af IFN-γ som reaktion på hPSMA-udtrykkende tumorceller (fig. 3B og 3C), men ikke mod hPSMA negative kontrol celler. Som en negativ kontrol, havde uinficerede T-celler ikke producerer IFN-γ når samdyrket med PC3 celler konstrueret til at udtrykke overfladen hPSMA antigen.

(A) lytiske aktivitet af T-kroppen-hPSMA /eGFP og T -body-hPSMA /Fluc. Cytotoksicitet analyseredes ved 3, 11 og 60 dage efter transduktion; PC3, PC3-PIP og LNCaP-celler blev anvendt som målceller. Utransducerede PBMC tjente som negativ kontrol. I det øverste venstre hjørne af hvert panel de procentdele af c-myc

+ T-celler er rapporteret. Figuren viser middelværdien +/- SD af 4 uafhængige eksperimenter. (B) IFN-γ-sekretion ved antigenstimulering. IFN-γ produktion blev analyseret på forskellige tidspunkter efter PBMC transduktion ved at stimulere T-krop-hPSMA /Fluc med PC3-PIP hPSMA

+ eller PC3 hPSMA

– cancer cellelinjer. T-organer ikke-stimuleret eller behandlet med PMA /lonomycin repræsenterede de negative og positive kontroller, hhv. Lignende resultater blev opnået med T-kroppen-hPSMA /eGFP. (C) c-myc udtryk i T-krop-hPSMA /Fluc befolkninger testet for IFN-γ produktion.

Analyse af terapeutiske effekt af anti-hPSMA T-krop administration mod lokale prostata tumorer

In vivo

terapeutiske effekt af CAR-transducerede T-celler på forskellige stadier af differentiering (72 timer eller 5 uger efter transduktion) blev oprindeligt evalueret ved hjælp af en Winn assay (fig. 4A). Især når PC3-PIP tumorceller blev co-injiceret med T-kroppen-hPSMA /eGFP blev observeret nogen tumorvækst (fig. 4A,

venstre panel

), uanset differentiering fase af T-organer . På den anden side, havde T-celle-overførsel ikke væsentligt påvirke væksten af ​​hPSMA-negative PC3-tumorceller (fig. 4A,

højre panel Salg).

(A) Winn Assay. PC3-PIP (

venstre panel

) og PC3 (

højre panel

) tumorceller blev inokuleret s.c. i SCID-mus, alene eller blandet 1:01 med T-kroppen-hPSMA /eGFP ved modstående flanker af samme dyr. Tumorvækst blev overvåget over tid ved caliper måling.