PLoS ONE: ARID3B Direkte Regulerer kræft i æggestokkene Fremme Genes

Abstrakt

DNA-bindende protein AT-Rich Interactive Domain 3B (ARID3B) er forhøjet i kræft i æggestokkene og øger tumorvækst i en xenograft model af kræft i æggestokkene . Men relativt lidt om ARID3B funktion. I denne undersøgelse udføre vi det første genom wide screen for ARID3B direkte målgener og ARID3B reguleret veje. Vi identificerede og bekræftet talrige ARID3B målgener ved chromatin immunoprecipitation (chip) efterfulgt af microarray og kvantitativ RT-PCR. Brug af motiv-finding algoritmer, vi kendetegnet et bindingssted for ARID3B, hvilket svarer til den tidligere kendte sted til ARID3B paralog ARID3A. Funktionalitet af denne forudsagte site blev demonstreret af Chip analyse. Vi næste viste, at ARID3B inducerer ekspressionen af ​​sine mål i æggestokkene kræftceller. Vi valideret at ARID3B binder til en epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) forstærker og øger mRNA-ekspression. ARID3B bindes også til promotoren for Wnt5A og dets receptor FZD5. FZD5 er stærkt udtrykt i æggestokkene kræftcellelinjer, og opreguleres ved eksogen ARID3B. Både ARID3B og FZD5 udtryk stigning adhæsion til ekstracellulær matrix (ECM) komponenter, herunder kollagen IV, fibronektin og vitronectin. ARID3B-øget adhæsion til kollagener II og IV kræver FZD5. Denne undersøgelse viser direkte, at ARID3B binder målgener i en sekvens-specifik måde, hvilket resulterer i øget genekspression. Desuden er vores data viser, at ARID3B regulering af direkte målgener i Wnt-vejen fremmer vedhæftning af æggestokkene cancerceller

Henvisning:. Bobbs A, Gellerman K, Hallas WM, Joseph S, Yang C, Kurkewich J, et al. (2015) ARID3B Direkte Regulerer kræft i æggestokkene Fremme Genes. PLoS ONE 10 (6): e0131961. doi: 10,1371 /journal.pone.0131961

Redaktør: Jinsong Zhang, Saint Louis University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Februar 6, 2015; Accepteret: 8 juni 2015; Udgivet: 29 juni 2015

Copyright: © 2015 Bobbs et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health /National Cancer Institute R00CA133190, https://www.cancer.gov/(KDCD), æggestokkene Cancer Research Fund, Liz Tilberis Scholar Award, https://www.ocrf.org/(KDCD), Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, Pilot Tilskud til Genomics Core, https://globalhealth.nd.edu/(KDCD ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i USA, ovariecancer er 5

th mest almindelige cancer hos kvinder og den mest dødelige gynækologiske cancer. I 2014 forventes det, at der har været 21,980 nye tilfælde af kræft i æggestokkene, og 14,270 dødsfald [1]. Vi viste, at DNA-bindende protein ARID3B overeksprimeres i serøs ovariecancer; ARID3B udtryk i kernen korrelerer med sygdom tilbagefald [2, 3]. Målet med denne undersøgelse var at mekanistisk identificere direkte target gener af ARID3B der kan bidrage til kræft i æggestokkene progression.

ARID3B tilhører en familie af AT-Rich Interactive domæne (ARID) proteiner, der er involveret i kromatin remodellering og regulering af genekspression. Disse proteiner er kendetegnet ved de tørre DNA-bindende domæne, en særdeles konserveret sekvens på ~ 100 aminosyrer [4]. ARID3B har en ARID domæne, der deler 89,9% aminosyreidentitet med sin paralog ARID3A (en B-celle-aktivator oprindeligt navngivet “Bright”), der har en bindende konsensus site af “AATTAA” [5-7]. Mobilitet skift analyser har vist, at ARID3B kan binde Matrix Attachment Regioner, der også er bundet af ARID3A fra IgH [8]. For nylig blev det rapporteret, at ARID3B binder til Oct4 promotoren og regulerer dens udtryk, men en fordomsfri tilgang til at identificere direkte ARID3B målgener er ikke blevet rapporteret [9].

tørre proteiner er involveret i udvikling og vævs- specifik genekspression, og afvigende ekspression er blevet forbundet med tumorigenese [10].

Arid3b

er en væsentlig gen; null embryoner dør midten af ​​drægtigheden, der udviser alvorlige defekter i udviklingen af ​​hjertet, nervevæv, kraniofaciale strukturer, lemmeknopper, og dannelse af den apikale endodermal højderyg [11-13]. ARID3B overudtrykkes i neuroblastom, navnlig trin IV tumorer, og samarbejder med MitCN at øge onkogent potentiale og proliferation [14, 15]. I serøs ovariecancer er ARID3B forhøjet [2]. Nuklear ekspression af ARID3B korrelerer med sygdomstilbagefald [3]. Endvidere overekspression af ARID3B i ovariecancerceller accelererer tumorvækst i en xenograft model af ovariecancer [3]. De målgener der er reguleret af ARID3B og de molekylære mekanismer, der ARID3B virkninger tumorigenese i kræft i æggestokkene er ikke kendt.

I denne undersøgelse identificerede vi direkte gen mål for ARID3B i æggestokkene kræftceller via chromatin Immunfældning (chip) efterfulgt af microarray (chip-Chip) teknologi. De bindende regioner af ARID3B blev karakteriseret ved beregningsmæssig bioinformatisk analyse og gav en stærkt bevaret bindingssted. Blandt de målgener af ARID3B er medlemmer af de EGFR, HAK, TNF, og Wnt signaling pathways. Vi var især interesseret i ARID3B effekt på Wnt signalvejen fordi ARID3B har bindende regioner i fire Wnt pathway gener: WNT5A, FZD5, APC, og MYC. WNT5A og FZD5 er overudtrykt i kræft i æggestokkene og korrelerer med dårlig prognose, og Wnt aktivitet er kendt for at regulere celledeling og død [16-19]. Opregulering af FZD5 og liganden WNT7A stigning tumorvækst og celleadhæsion [20]. Vi fandt, at ARID3B øger ekspression af FZD5, APC, og MYC. Overekspression af FZD5 eller ARID3B i æggestokkene cancerceller øger vedhæftning til adskillige ECM-proteiner, herunder fibronektin og vitronectin, mens knockdown af FZD5 eller redigering af ARID3B forårsager et tab af vedhæftning til bestemte ECM komponenter. Derudover knockdown af FZD5 i celler, hvor ARID3B overudtrykkes fører til nedsat adhæsion og faldt ARID3B induceret adhæsion til collagen II, collagen IV, og tenascin. Disse resultater antyder, at direkte regulering af Wnt signalering ved ARID3B kan bidrage til ovariecancer progression.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

Cellelinjer blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2. OVCA429 celler (leveret af Dr. Bast, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX og beskrevet i [21]) blev dyrket i minimalt essentielt medium (MEM). Vi opnåede Skov3IP celler fra Dr. Mills, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. Udledningen af ​​Skov3IP celler er beskrevet i Yu et al [22]. Skov3IP celler blev dyrket i McCoys medier 5A. Medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Atlas, Ft. Collins, CO), 0,1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. OVCA429 og Skov3IP celler, der udtrykker ARID3B, FZD5 (pLenti-C-mGFP, Origene, Rockville, MD) eller styre Red fluorescerende protein (RFP) blev skabt som tidligere beskrevet og niveauer af ARID3B overekspression svarede til dem opnået i vores tidligere undersøgelser ( fig 1) [23]. Redigering af ARID3B genet i OVCA429 celler blev udført ved hjælp af transficeret sgRNA /Cas9 alt-i-én ekspressionsvektor målrettet ARID3B (p-CRISPR-CG01, Geneocopeia, Rockville, MD). Som en kontrol for CRISPR-redigerede cellelinier blev OVCA429 celler transduceret med en Cas9 nuclease ekspressionsklon (CP-LvC9NU-01, Geneocopeia, Rockville, MD) og en kodet sgRNA kontrolvektor (p-CRISPR-LvSG02, Geneocopeia, Rockville, MD). For FZD5 transduktion, SKOV3-celler (ATCC, Manassas, VA, USA, # HTB-77) [24] blev anvendt i stedet for Skov3IP celler, idet vores SKOV3IP celler udtrykker GFP og FZD5 ekspressionsvektoren udtrykker GFP (pLenti-C-mGFP) . FZD5 knock-down blev opnået ved anvendelse af en transducerede shRNA vektor (pGFP-C-shLenti, Origene, Rockville, MD). OVCAR3-celler (ATCC, # HTB-161) [25] blev dyrket i RPMI-medier med 20% FBS og 10 mg /ml insulin. CaOV3 (ATCC, # HTB-75) [26] og 293FT (Life Technologies, Carlsbad, CA, # R700-07) [27] celler blev dyrket i Dubecco modificerede Eagle-medium (DMEM) med 10% FBS. IOSE398 celler (fra Dr. Stack, Harper Cancer Research Institute, Notre Dame, IN beskrevet i [28]) blev dyrket i en 1: 1 blanding af Media 199 og MCDB105, med 5% FBS og 50 ug /ml gentamicin. Alle cellekulturreagenser bortset fra de FBS var fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Cellelinjer blev bekræftet den 1. oktober 2013 ved ATCC ved STR profilering.

ARID3B udtryk blev vurderet i forældrenes, RFP-udtrykkende, og 6xHis-ARID3B OVCA429 (A) og Skov3IP (B) cellelinjer, hjælp både QRT-PCR. (C) En western blot af forældre og ARID3B-udtrykkende cellelinjer bekræfter dette resultat.

xenotransplantat musemodeller af kræft i æggestokkene

Alle undersøgelser blev godkendt af University of Notre Dame IACUC udvalg (protokol 14-060) og blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne i US Public Health service Policy for Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Seks uger gamle hun nøgne nu /nu mus (Charles River, Wilmington, MA) blev opretholdt på Freimann Life Science Center (University of Notre Dame). I pilotundersøgelsen (4 mus pr gruppe), 1×10

6 SKOV3IP-RFP eller SKOV3IP-ARID3B celler i 200 pi phosphatpufret saltvand (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, og 11,9 mM phosphatpuffer, pH 7,4 ) injiceret intraperitonealt (IP) i nøgne mus. Mus blev overvåget ugentligt for tumorvækst (med en ventral og dorsal billede hver uge). Væksten af ​​tumorer og billeddannelse er rapporteret i Roy, L., et al [3]. Da IP tumor vækst resulterer i spredning tumor spredning bred, er det svært præcist at kvantificere tumor volumen for flere tumorer

in vivo

. Mus blev aflivet, når af

in vivo

imaging registreres flere store tumorer, eller hvis mus viste tegn på sygdom, herunder en udspilet mave.

microarray analyse og Bioinformatik

Tre RNA-prøver hver fra SKOV3IP-RFP og SKOV3IP-ARID3B ascitesvæske /peritoneale vasker fremstilledes [3]. Den microarray blev udført ved Notre Dame Genomics Core Facility på en Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA). Probesættet ekspressionsniveauer blev normaliseret og samlet ved hjælp af GC robust multi-matrix gennemsnit (GCRMA) algoritme [29]. Kontrolprobe sæt og probesæt, der var “ikke påviselig” blev frafiltreret til yderligere analyse. “Ikke påviseligt” blev defineret som probe sæt, der enten bliver kaldt “fraværende” af Affymetrix Call Detection Algoritme (Manual titlen “GeneChip Expression Analyse Data Analysis Fundamentals”, Affymetrix; www.affymetrix.com) i alle de seks arrays, eller have alle dens udtryk rapporteret af GCRMA mindre end 2,5. Betydning Analyse af microarrays (SAM, [30]) blev anvendt til at detektere de differentielt udtrykte gener mellem ARID3B og RFP kontroller. Et tusinde tolv probesæt blev fundet at være signifikant med en falsk opdagelse sats (FDR) mindre end 10%. Af disse probe sæt, blev 199 ned reguleret af ARID3B. En anden, mere stringent analyse normaliseret de rå microarray data ved RMA, og krævede en FDR på mindre end 5%. Pathway analyse blev gennemført af krydsreferencer regulerede gener med tilhørende Gene ontologi (GO) vilkår, der er anført i Ensembl database.

chromatin immunpræcipitation efterfulgt af microarray (chip-Chip)

spån- Chip procedure blev udført i overensstemmelse med protokollen af ​​Tamimi et. Al. [31]. Kort fortalt, Ni

2 + -NTA magnetiske perler blev anvendt til at isolere forskydningspåvirkede chromatin komplekser indeholdende (His) -6-ARID3B fusionsproteinet fra lysater. En positiv kontrol (100% input, ingen Ni

2 + NTA) og negative kontrol (H2O plus Ni

2 + -NTA tilføjet til prøve) var også inkluderet. Microarray hybridisering blev udført under anvendelse af en NimbleGen human 2.1M Deluxe Promoter Array ifølge producentens anvisninger som beskrevet nedenfor. Prøve integritet til eksperimentelle chip og kontrol input prøver blev verificeret med en Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Et ug eksperimentelle prøver og kontrolprøver blev mærket med Cy3 og Cy5-mærkede tilfældige nonamerer, henholdsvis (Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI). En 34 ug portion af hver cy-farvestof mærkede produkt blev samlet og hybridiseret til et mikroarray ved 42 ° C i 16-20 timer. Mikroarrays blev vasket, tørret og derefter scannet i en NimbleGen MS200 scanneren 2 um opløsning. Microarray billeder blev visualiseret og analyseret med NimbleScan software v2.5 (Roche NimbleGen, Inc.).

Beregning af ARID3B bindingssted blev gennemført ved hjælp af både MEME (University of Queensland, Brisbane, Australien [32, 33] og ALLEGRO (Tel Aviv University, Tel Aviv, Israel) [34, 35]. Sekvensdata af ARID3B bindende regioner som bestemt af vores chip-Chip forsøg blev udvundet ved hjælp af en specialbygget PerlScript. De øverste 50 ARID3B bindingssted sekvenser blev scannet for fælles motiver ved hjælp af MEME. I en parallel analyse blev alle væsentlige ARID3B bindingssted sekvenser sammenlignet på baggrund genom ved hjælp ALLEGRO.

chromatin Immunfældning (chip)

Skåret kromatin blev fremstillet af 90% sammenflydende ovariecancer celler ved anvendelse af Pierce Agarose chIP Kit (Rockford, IL) og en offentliggjort protokol fra Cold Spring Harbor [36]. DNA klipning udførtes under anvendelse af en EpiShear probesonikator (Active Motif, Carlsbad, CA), med en serie af 10 20 sekunders pulser ved 25% amplitude. Halvtreds ug af klippet kromatin blev anvendt til hver immunpræcipitering (IP). IP blev udført under anvendelse af et anti-ARID3B antistof (Bethyl Laboratories, A302-564A, Montgomery, TX) eller IgG (Pierce, Rockford, IL) og protein A-agarose magnetiske perler. En prøve af “Input DNA” blev indsamlet før IP for normalisering. Chip prøver blev revers-tværbundet ved opvarmning ved 65 ° C i 4 timer i nærvær af 20 ug proteinase K og 250 mM NaCl, og renset under anvendelse af en standard phenol /chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning.

ChIP DNA-prøver blev analyseret med kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), ved anvendelse af Sso Fast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). Hver chip DNA-prøve blev sammenlignet med den relevante Input DNA-prøven. Primere blev købt fra Integrated DNA Technologies (Coralville, IA), og designet til at flankere foreslået ARID3B bindingssteder:

EGFR F: CTCAAGTGTCTCATACTACC /R: GTCATTGGGCAAACCACTG

BTC F: GTCTCAGCCTCCCAAGTAGC /R: CTAACAGGTATAATGTCACAG

WNT5A F: AGTGATTCTCCTGCCTCAGC /R: TGGAAGGGATGAATTTGGTC

MYC F: GGAGGCCAGATGCATGAG /R: TAC CTA TGG CTG TTA GAA TC

FZD5 F: GCACAATGGCTCATGCTTG /R: CGCAATCTTGGCTCACTGC

APC F: CTCCTGACCTCAAGTGATCC /R: CAGTCACTGCTTATAGAATC

RIPK1 F: GTCTTGAACTCCTGACCTCG /

R: ACAGAAACTCCATGCAAACC

NOTCH2 F: GTCAGGAGTTTGAGACC /R: ACTGCAATCTCTGCCTCC

NUSAP1 F: TTCACATGCCTCATTAAGAG /R: TCCCGAGTAGCTGGGATTCC

CASP1 F: ACTCAAGCAATTCACTCACG /R: CATTCTGAGTCCAGAGCCTG

LPAR1F: TGAAGAGTTGCGTATTAAC /R: AGTTTCATGGGTGCTATACC

CENPN F: ATCTACTGTATGTCAGACAC /R: CAGGCACCCGATACCACG

CEP55: F: GCAGGAGTTCGTGATCAGAG /R: CCAGCTAATTCTGGGATCG

Gene Expression

RNA fra OVCA429 og Skov3IP celler blev isoleret ved hjælp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), i henhold til producentens anvisninger. Komplementær DNA (cDNA) blev fremstillet ud fra 500 ng RNA ved anvendelse med høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Waltham, MA) som anvist. Reaktioner blev kørt enten bruge iTaq Universal Probes Supermix (Bio-Rad) eller skibets Fast EvaGreen Supermix (Bio-Rad). Alle genekspression primersæt blev opnået fra Integrated DNA Technologies (Coralville, IA), med undtagelse af ARID3B (fra Life Technologies, Carlsbad, CA). kvantitative revers transkriberet polymerasekædereaktion (QRT-PCR) reaktioner blev kørt tredobbelt og normaliseret til ekspressionen af ​​GAPDH. Primer Analyser er som følger: APC: Hs.PT.56a.3539689, ARID3B: HS01084949_g1, BTC: Hs.PT.56a.3511718, CASP1: Hs.PT.56a.39699622, CENPK: Hs.PT.56a.40187080. g, CENPN: Hs.PT.56a.22431568.g, CEP55: Hs.PT.56a.279272.g, EGFR: Hs.PT56a.20590781, FZD5: Hs.PT.56a.3585264, GAPDH: Hs.PT. 39a.22214836, MYC: Hs.PT.49a.3659201.g, NOTCH2: Hs.PT.512811432, NUSAP: Hs. PT.51.21077614, WNT5A:. Hs.PT.56a.22221435

Western Blot

helcelle-proteinlysater blev opnået ved at lysere OVCA429 og Skov3IP ovariecancer celler i RIPA-buffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% EDTA, 0,1% SDS og 1X Halt Protease phosphataseinhibitor Cocktail (Pierce, Rockford, IL)). Proteinkoncentration blev målt under anvendelse af en bicinchoninsyre (BCA) assay ifølge standardprotokol (Pierce, Rockford, IL). blev påvist proteiner ved anvendelse af følgende antistoffer: ARID3B (# A302-564A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, kanin-polyklonalt, syntetisk peptid antigen), FZD5 (# MC-4273, MBL, Woburn, MA, kanin-polyklonalt, Syntetisk peptidantigen) , β-actin (# AM1829b, Abgent, San Diego, CA, Mouse Monoclonal, rekombinant protein antigen), GAPDH (# ab128915, Abcam, Cambridge, England, kanin monoklonale, syntetisk peptid Antigen), COXIV (# 4850, Cell Signaling Technology , kanin polyklonale, syntetisk peptid svarende til resterne omgivende Lys29 af human COXIV), og ARID3A (polyklonalt antistof, en slags gave fra H. Tucker UT Austin) efterfulgt af et sekundært anti-kanin-HRP-konjugeret antistof (GE Healthcare, Knox , IN). Imaging og kvantificering blev udført ved anvendelse af en Bio-Rad Chemidoc XRS + System, kører Imager Lab Software (Hercules, CA).

ECM adhæsionsanalysen

Cellulær fastgørelse til ECM komponenter blev bestemt under anvendelse af en kolorimetrisk ECM celleadhæsion Array Kit (Millipore, Billerica, MA). ECM vedhæftede analyser blev udført på OVCA429 og SKOV3 celler, der udtrykker ARID3B, FZD5, FZD5 shRNA eller indeholder CRISPR-redigerede ARID3B. Efter 1 times inkubering blev ikke-vedhængende celler vasket væk, med de resterende adhærerende celler farvet i overensstemmelse med producentens anvisninger. Farvede celler blev vasket med vand, og pletten blev solubiliseret med kittet ekstraktionsbuffer. Lysabsorption ved 540 nm blev målt på en Spectramax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). For at beregne forskelle i cellulær vedhæftning blev absorptionsmålinger rapporteret som en fold ændring over OVCA429-RFP eller SKOV3-RFP vedhæftning for hver ECM komponent.

TCF /Lef reporter assay

Vi transficerede 293FT celler dyrket til 80% konfluens i en 12-brønds plade under anvendelse Lipfectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), med 500 ng DNA. Alle celler blev transficeret med TOPflash eller FOPflash reporterplasmider sammen en vektor kraft-udtrykkende ARID3B (pLenti-suCMV-RSV, Gentarget, San Diego, CA), FZD5 (pLenti-C-mGFP, Origene, Rockville, MD) Wnt5a (pLenti- C-mGFP), eller en tom pLenti-C-mGFP vektor. Alle prøver blev også cotransficeret med et Renilla luciferase kontrol til at normalisere for celleantal og transfektionseffektivitet. Luciferaseaktivitet blev målt ved anvendelse af et Promega Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner og målt på en TD 20/20 luminometer (Turner Designs, Sunnyvale, CA). Et lignende forsøg blev udført med 3T3 “Førende Light” celler (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY). Da disse celler udtrykker et Wnt Reporter luciferase, blev de kun transficeret med de ovennævnte ARID3B, FZD5, og Wnt5a vektorer, og normaliseret ved proteinkoncentration. Alle betingelser blev kørt i tre eksemplarer og normaliseret til den interne kontrol Renilla.

Statistik

qPCR data og celle vedhæftning t-statistik blev beregnet ved anvendelse af Smith-Satterthwaite procedure med ulige befolkning varianser. Statistisk signifikans fik sammenligninger med en p-værdi på 0,05 eller lavere. Overrepræsentation af Gene ontologi (GO) vilkår blev beregnet ved hjælp af en Chi-Squared test.

Resultater

ARID3B binder regulatoriske regioner af DNA

For at få indblik i, hvordan ARID3B regulerer æggestokkene tumor vækst, vi søgte at identificere ARID3B regulerede gener. Vores første skridt var at identificere regulatoriske regioner (såsom promotorer og forstærkere) bundet af ARID3B via chip-Chip-analyse i æggestokkene cancerceller overekspression ARID3B (6xHis-ARID3B). OVCA429 celler blev transduceret med ARID3B som tidligere beskrevet [23]. Da ekspressionsniveauerne af ARID3B i cellerne, der anvendes til chip-Chip var meget høj (ca. 300-dobling) valgte vi at validere gener på mere moderate niveauer af ARID3B udtryk, der er mere tilbøjelige til at blive stødt

in vivo

(figur 1). Klippet kromatin komplekser bundet til His-mærket ARID3B blev isoleret ved hjælp af Ni

2 + NTA magnetiske perler, derefter hybridiseret til en NimbleGen Menneskelig 2.1M Deluxe Promoter Array. Statistisk analyse af chip-Chip vifte afslørede 2.367 genomiske regioner bundet af ARID3B (S1 tabel). De genomiske regioner identificeret ved chip-Chip varierede fra 397 basepar til 3.198 basepar (median: 1.131 basepar).

Næste vi vurderet, om ARID3B bundne gener klynge i forskellige veje eller biologiske funktioner. De genomiske regioner omgiver hver ARID3B bindingssted blev scannet for transskription Start steder (TSS) i nærhed, således at tildele hvert bindingssted til en sandsynlig regulatorisk region. Ca. 11% af de ARID3B bindingssteder placeret på denne måde er i umiddelbar promotorregion af et gen (defineret som 0-2Kb fra TSS), 18% er i en nærliggende enhancer region (2-5 kb fra TSS), 52 % er i fjernere enhancerregioner, og 19% er i introner (figur 2).

(A) Fordeling af ARID3B bindingssteder i forhold til transkriptionsstartsitet for den nærmeste genet. (B) Grafisk fremstilling af den beregningsmæssigt-afledte ARID3B konsensus site, der genereres af MEME.

Gener med nærliggende ARID3B binding blev grupperet efter Gene Ontology (GO) form af biologisk funktion (tabel 1). Mange af de formodede ARID3B mål har GO termer forbundet med celledød og apoptose (88 gener), hjerte udvikling (21 gener), neuron udvikling (47), og stamcellemarkører (6 gener). Et mindre antal gener blev fundet med GO forretningsbetingelser for lemmer knop (2-gener) og i ansigtet-craniale formation (1-gen). Vi bemærkede også, at ARID3B binder til en række gener, der er involveret i centromerer eller metafase (44 gener). Disse kategorier repræsenterer en delmængde af de biologiske funktioner, som ARID3B kan regulere og implicere ARID3B mål i mange processer.

ARID3B regulerer genekspression

Vi næste ønskede at identificere ARID3B regulerede gener, som er involveret i tumorvækst vi isolerede celler fra en musemodel for ovariecancer. Skov3IP celler, der udtrykker rødt fluorescerende protein (RFP) eller 6xHis-ARID3B og RFP blev injiceret i nøgne mus. Tumorer fik lov til at vokse. Vi indsamlede ascites eller peritoneale vaskevæsker fra Skov3IP-6xHis-ARID3B eller Skov3IP-RFP xenotransplantater ascites som beskrevet [3]. RNA blev indsamlet fra de maligne ascites danner Skov3IP-ARID3B tumorbærende mus eller peritoneale vaske fra mus med Skov3IP-RFP tumorer. Microarray analyse blev udført ved hjælp af en Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 GeneChip. I dette forsøg var der 813 gener med forøget ekspression som svar på ARID3B og 201 gener med nedsat ekspression (S2 Table). En mere stringent beregning af “stærkt modificerede” gener (baseret på RMA normalisering med False Discovery Rate mindre end 5%) gav 132 gener med forøget ekspression, og 39 med nedsat udtryk. Svarende til vores chip-Chip-data blev disse resultater filtreret af GO vilkår. Blandt de gener, som er ARID3B induceret er 44 celledød gener, 13 heart udviklings- gener, 17 neurale udviklingsprojekter gener, 37 celledeling gener og 9 stamcelle gener (tabel 2). Efter aftale med vores chip-chip data, flere gener vi identificeret som direkte ARID3B mål blev fremkaldt af ARID3B udtryk herunder NOTCH2, CASP1, CENPN, og CENPK. En statistisk analyse af GO sigt fordeling fandt, at metafase og centromerfusioner-associerede termer var betydeligt overrepræsenteret blandt gener opreguleres af ARID3B, mens neuron udvikling vilkår var overrepræsenteret blandt gener nedreguleret ved ARID3B (S3 tabel).

karakteriserer ARID3B bindingssted

konsensus bindingssted ARID3B s paralog ARID3A blev tidligere vist at være “AATTAA” [5]. Som beskrevet ovenfor blev genomiske sekvenser bundet af ARID3B opnået ved chip-chip. Disse sekvenser blev analyseret ved anvendelse af to separate motiv-finding algoritmer (MEME [32] og ALLEGRO [34]) for at finde en fælles AT-rige motiv. Begge metoder gav en konsensus bindende motiv af “TGGGATTACAG.” (Figur 2) For at demonstrere funktionerne på dette beregningsmæssigt afledt motiv, vi udførte chip til at opdage ARID3B binding til regulator regioner af gener identificeret via chip-Chip. Binding til de regulatoriske regioner af disse gener blev bestemt ved anvendelse qPCR primere designet til at amplificere et 200-300bp område indeholdende en eller flere formodede ARID3B bindende sites, vi identificeret bioinformatically. Chip prøver blev fremstillet af Skov3IP og OVCA429 ovariecancerceller, ved hjælp af både forældre linjer og cellelinjer, der udtrykker 6xHis-ARID3B (figur 1). Målgener blev udvalgt til validering baseret på chippen-Chip data og den biologiske relevans af genet. De udvalgte målgener var inddelt i 4 kategorier af Gene ontologi: Wnt signalering (Wnt5A, FZD5, MYC, APC) (fig 3A), Cell død-associeret (NOTCH2, CASP1, LPAR1, og RIPK) (Fig 3B), Cell division (CENPN, CENPK, NUSAP, og CEP55) (fig 3C) og EGFR-signalering (EGFR og BTC) (fig 3D). For hver region blev qPCR resultaterne af ARID3B chip normaliseret til et input DNA-prøve, og sammenlignet med en negativ (IgG) kontrol. Som vist i figur 3, viste næsten alle udvalgte målregioner ARID3B binding væsentligt over den negative kontrol i mindst en cellelinje. Relative binding i ARID3B ChIP versus tilsvarende negative kontrol var generelt meget højere i celler, der overudtrykker ARID3B, i sammenligning med de parentale cellelinier (figur 3). Lignende resultater blev fundet, når der udføres chip på high-grade serøse ovariecancerceller (OVCAR3), med betydelig ARID3B binding fundet til Wnt5a, RIPK, BTC, og APC (fig 3E).

chromatin Immunfældning (chip) efterfulgt af qPCR blev udført på forældrenes og 6xHis-ARID3B Skov3IP og OVCA429 celler til at opdage binding af ARID3B at målrette gener i vigtige veje. Alle tal er rapporteret som relative binding sammenlignet med den tilsvarende indgang DNA-prøven. Parentes angiver, at bindende i ARID3B-chip prøver er væsentlig højere end den tilsvarende baggrund (IgG) prøve (* p-værdi 0,05, ** – p-værdi 0,005). N = 3. Vi valideret ARID3B binding til gener med Gene ontologi (GO) vilkår vedrørende (A) Wnt Signaling, (B) celledød og Apoptose, eller (C) Cell Division, eller (D) EGFR-signalering. (E) Lignende chip resultater i høj kvalitet serøs æggestokkræft cellelinje OVCAR3.

ARID3B ændrer ekspressionen af ​​gener i vigtige cellulære veje

Næste vi konstaterede hvis ARID3B udtryk ændrer udtryk af formodede målgener. Exogen ekspression af ARID3B forøgede gener i Wnt og EGF signalveje ved QRT-PCR. I OVCA429 celler, APC, FZD5, MYC, og EGFR induceret af ARID3B. I Skov3IP celler, ARID3B øger FZD5, MYC, BTC, og EGFR (fig 4A). Den konsekvente fremkaldelse af FZD5 og MYC er særlig interessant, i betragtning af at begge udtrykkes ofte i høje niveauer i ovariecancerceller sammenlignet med immortaliserede æggestokkene overflade epitelceller (IOSE398) (fig 4B og 4C). Desuden har vi bekræftet, at ARID3B inducerer ekspression af mange forudsagte mål: ARID3B opreguleret NOTCH2, SORBS1, og CASP1 i Skov3IP cellelinjer (Fig 4D). Disse gener blev anset af interesse på grund af deres Gene ontologi vilkår. ARID3B binder også flere metafase og centromerfusioner-associerede gener (Tabel 1). Vi bekræftede bindingen af ​​ARID3B til regulatoriske regioner i CEP55, CENPN, og CENPK vha chip (fig 3C). I OVCA429 celler, CEP55 og CENPN markant opreguleres ved ARID3B (Fig 4E).

(A) QRT-PCR blev udført for target gener på OVCA429 og Skov3IP forældrenes celler og OVCA429 og Skov3IP celler, der udtrykker 6xHis-ARID3B. N = 5 (B og C) QRT-PCR blev udført på total RNA fremstillet fra IOSE398 og et panel af æggestokkene cancercellelinier at måle ekspressionen af ​​formodede ARID3B målgener FZD5 og MYC. N = 3 (D) QRT-PCR-analyse på Skov3IP parentale celler, Skov3IP-6xHis-ARID3B, og Skov3IP-RFP-celler. N = 3 (E) QRT-PCR-analyse på OVCA429 parentale celler, 6xHis-ARID3B, og RFP-udtrykkende OVCA429 celler. N = 4. * = p 0,05, ** = p 0,005 (F) Western Blot ved hjælp af lysater OVCA429, OVCA-6xHis-ARID3B, SKOV3 og Skov3-6xHis-ARID3B celler til FZD5. N = 2.

Da Wnt signalering er impliceret i mange type tumorer, herunder kræft i æggestokkene vi undersøgt yderligere regulering af FZD5 ved ARID3B. Opregulering af FZD5 blev yderligere bekræftet ved Western blot (Fig 4F), hvor proteinekspression af FZD5 steg 9 gange i OVCA429 celler og 2,8 gange i SKOV3-celler som respons på ekspression af 6xHis-ARID3B. Dette viser, at ARID3B regulerer FZD5

in vitro

.

For yderligere at støtte den rolle ARID3B i reguleringen af ​​genekspression blev OVCA429 celler transficeret med vektorer, der udtrykker Cas9 nuklease og CRISPR guide RNA rettet ARID3B. Betydeligt tab af ARID3B ekspression blev bekræftet ved Western blot (Fig 5A) og rammeskift mutationer blev bekræftet ved sekventering (data ikke vist). Angivelse af ARID3B målgener blev målt ved hjælp af qPCR som før, sammenligner OVCA429 celler med CRISPR-redigerede ARID3B mod OVCA429 celler, der indeholder en kontrol Cas9 og scrambled sgRNA vektor. Vi fandt signifikant nedsat ekspression af EGFR i CRISPR-redigerede celler (Fig 5B), og det samme for pro-apoptotiske mål TRADD og TNF-receptor TNFR2, som vores laboratorium tidligere havde verificeret at være opreguleret af ARID3B [23].

(A) Western blot ved hjælp af hel-cellelysat fra OVCA429 og OVCA429 ARID3B CRISPR celler, med registrering af ARID3B. N = 2. (B) QRT-PCR blev udført for EGFR, TRADD og TNFR2 på total RNA fra OVCA429 celler transduceret med Cas9 nuklease og en kontrol scrambled CRISPR guide RNA og OVCA429 celler med ARID3B redigeret af målrettede CRISPR vektorer. (C) QRT-PCR blev udført for ARID3B på OVCA429-GFP og OVCA429 celler sorteret for medium ARID3B-GFP eller høj ARID3B-GFP udtryk. (D) QRT-PCR blev udført for EGFR, TRADD, TNFR2, TNF, og TRAIL på OVCA429-GFP, OVCA429 medium ARID3B-GFP, og OVCA429 høje ARID3B-GFP-celler. N = 3. * = p 0,05.